本发明涉及一种纳米粒子的制备方法，更具体一点说，涉及一种sirna靶向ph响应性载药光热治疗纳米粒子的制备方法。
背景技术：
石墨烯量子点作为一种新型的量子点，具有优良的光热性能、荧光性能、良好的生物相容性、低细胞毒性、化学惰性等特殊的物理化学性质，近年来受到科学家的广泛关注，而聚合物纳米粒子通过负载石墨烯量子点实现光热治疗、生物成像成为研究者关注的重点，此外通过连接靶向材料、ph、温度等敏感材料使纳米粒子将药物靶向运送到病变部位并控制药物持续有效释放，而且由于聚合物纳米粒子尺寸小，能穿过组织间隙并被细胞吸收，因而成为纳米释放系统良好的药物载体，在药物输送方面具有其它体系无可比拟的优越性，实现纳米粒子的多功能性将给癌症等许多疾病的治疗带来变革。
现有的纳米载体大多只能实现单一功能，而不能将光热治疗、ph响应、靶向递送、生物成像多功能性集于纳米载体一身，而要解决这一问题也成为研究的重中之重，与此同时，也必须使纳米载体对药物具有较高的负载率，且同时满足纳米载体将药物靶向运送到病变部位并控制药物持续有效释放，而羧甲基壳聚糖(cmcs)具有ph响应、良好的生物相容性和生物可降解性等性能，在生理条件下带负电，可吸附在阳离子载体表面，为纳米粒子于外表面连接sirna分子实现纳米载体的靶向性提供可能，从而使纳米载体具有靶向性、光热性、ph响应性、生物成像等多功能性成为可能。
技术实现要素：
为了解决上述现有技术问题，本发明提供了一种sirna靶向ph响应性载药光热治疗纳米粒子的制备方法，本发明中选择良好生物性材料聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)和ph敏感材料羧甲基壳聚糖(cmcs)为基体包裹石墨烯量子点和阿霉素制备纳米粒子，并于其外表面连接sirna，采用二次乳化-溶剂挥发法先将抗癌药物盐酸阿霉素和石墨烯量子点包埋于聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)有机相中形成w/o初乳，随后包埋于ph敏感材料羧甲基壳聚糖(cmcs)水相得到w/o/w复乳液体系，最后在表面通过静电作用连接靶向分子sirna，得到具有主动靶向性的聚合物纳米粒子，该方法制备的聚合物纳米粒子具有多功能性，可以延长药物释放，增加聚合物微粒的稳定性，增强癌细胞治疗，同时该方法不会在后期的实验过程中对细胞产生显著影响，不影响实验结果的科学性，实验操作过程简单、无毒、无害、绿色环保。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明一种sirna靶向ph响应性载药光热治疗纳米粒子的制备方法，包括如下制备骤：
步骤1)：选取浓度均为1mg/ml的石墨烯量子点和抗癌药盐酸阿霉素水溶液，置于4℃的冰箱中预冷备用，作为内部水相；
步骤2)：将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于二氯乙烯中，配制成浓度为2-4％的plga有机溶液，置于4℃的冰箱中预冷备用，作为中间油相；
步骤3)：将水溶性羧甲基壳聚糖溶于水中，配制成浓度为3-5％的羧甲基壳聚糖水溶液，置于4℃的冰箱中预冷备用，作为外部水相；
步骤4)：将小干扰sirna溶于磷酸盐缓冲液，得配制成浓度为20-40μmol/l的均匀溶液，置于4℃的冰箱中预冷备用；
步骤5)：取1-2ml步骤1)获得的石墨烯量子点水溶液和1-2ml抗癌药盐酸阿霉素水溶液混合，加入到8-12ml步骤2)获得的plga有机溶液中，使用超声乳化仪超声1-2min，振幅设为30，制得w/o初乳液；
步骤6)：将步骤6)制得的w/o初乳液立即转移到18-24ml步骤3)获得的羧甲基壳聚糖水溶液中，超声1-2min，制得w/o/w复乳液；
步骤7)：将步骤7)制得的w/o/w复乳液逐滴加入到60-80ml去离子水中，磁力搅拌，陈化30-60min，待有机溶剂挥发完全后，使用冷冻高速离心机，在14000r/m的转速下离心5-10min，收集微粒，并用去离子水洗涤2-3次以除去残留的分散剂，最后冻干保存，获得纳米粒子；
步骤8)：称取40-50mg步骤7)获得的纳米粒子分散于40-50ml磷酸盐缓冲液并充分搅拌，使其分散均匀，获得分散液；
步骤9)：取10-20ml步骤4)所得的均匀溶液，在室温滴加至步骤8)获得的分散液中，均匀搅拌2h，随后静止20-30min；
步骤10)：将步骤9)所得的溶液经冷冻高速离心机，在14000r/m的转速下离心5-10min，并用磷酸盐缓冲液清洗2-3次，收集微粒，获得具有sirna靶向ph响应性载药光热纳米粒子。
本发明一种sirna靶向ph响应性载药光热治疗纳米粒子的制备方法，包括如下制备骤：
步骤1)：选取浓度均为1mg/ml的石墨烯量子点和抗癌药盐酸阿霉素水溶液，置于4℃的冰箱中预冷备用，作为内部水相；
步骤2)：将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于二氯乙烯中，配制成浓度为3％的plga有机溶液，置于4℃的冰箱中预冷备用，作为中间油相；
步骤3)：将水溶性羧甲基壳聚糖溶于水中，配制成浓度为4％的羧甲基壳聚糖水溶液，置于4℃的冰箱中预冷备用，作为外部水相；
步骤4)：将小干扰sirna溶于磷酸盐缓冲液，得配制成浓度为30μmol/l的均匀溶液，置于4℃的冰箱中预冷备用；
步骤5)：取1.5ml步骤1)获得的石墨烯量子点水溶液和1.5ml抗癌药盐酸阿霉素水溶液混合，加入到10ml步骤2)获得的plga有机溶液中，使用超声乳化仪超声1.5min，振幅设为30，制得w/o初乳液；
步骤6)：将步骤6)制得的w/o初乳液立即转移到21ml步骤3)获得的羧甲基壳聚糖水溶液中，超声1.5min，制得w/o/w复乳液；
步骤7)：将步骤7)制得的w/o/w复乳液逐滴加入到70ml去离子水中，磁力搅拌，陈化45min，待有机溶剂挥发完全后，使用冷冻高速离心机，在14000r/m的转速下离心7.5min，收集微粒，并用去离子水洗涤2次以除去残留的分散剂，最后冻干保存，获得纳米粒子；
步骤8)：称取45mg步骤7)获得的纳米粒子分散于45ml磷酸盐缓冲液并充分搅拌，使其分散均匀，获得分散液；
步骤9)：取15ml步骤4)所得的均匀溶液，在室温滴加至步骤8)获得的分散液中，均匀搅拌2h，随后静止25min；
步骤10)：将步骤9)所得的溶液经冷冻高速离心机，在14000r/m的转速下离心7.5min，并用磷酸盐缓冲液清洗2次，收集微粒，获得具有sirna靶向ph响应性载药光热纳米粒子。
与现有技术对比本发明的有益效果：
1)在发明中通过制备的聚合物纳米粒子有望实现高效的药物控释、缓释药物、ph响应、光热治疗和生物成像，并可在实现于主动靶向性，增加与受体的结合能力，从而大大提升对癌细胞的治疗效果；
2)在发明中采用聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)油相包埋抗癌药物形成初乳，使其包封率大大提高，羧甲基壳聚糖(cmcs)包埋初乳，两者皆具有良好的生物相容性，因而不影响细胞实验的准确性，从而减轻或避免毒副反应；
3)通过将多功能性集于纳米载体一身，为有效治疗癌症提供了一种新的治疗方向；
4)这种纳米载体提高药物的稳定性，便于贮存；可以建立一些新的给药途径；
5)在步骤1)中得到石墨烯量子点(cqds)和抗癌药盐酸阿霉素(dox)水相，石墨烯量子点为纳米载体的光热治疗、生物成像提供必然条件，而盐酸阿霉素(dox)为纳米载体的癌症治疗提供必然条件；在步骤2)中，聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)溶于二氯乙烯(ch2cl2)中得到有机相，聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)具有优良的生物相容性，为纳米载体的低毒性，可用于生物活体提供必然条件；在步骤3)中，羧甲基壳聚糖(cmcs)是ph敏感材料，具有良好的生物相容性和生物可降解性，其分子结构中同时具有酸性基团(－cooh)和碱性基团(－nh2)，在生理条件下带负电，为吸附sirna提供良好的基础；在步骤4)中，选择小干扰sirna作为靶向分子，是因为其具有明确靶点，特异性高的优势；在步骤1)、2)、3)和4)中，将制备的溶液都置于4℃的冰箱中预冷，避免了在后续升温对实验的影响，提高了实验的成功率；在步骤5)中，将含有抗癌药物阿霉素和石墨烯量子点水相包埋于聚甲聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)控释体系中，得到尺寸相对较小的初乳，有利于后续所得聚合物微粒和细胞相互作用；在步骤6)中，将形成的w/o初乳包埋于具有较高生物相容性的ph敏感材料羧甲基壳聚糖水溶液，从而形成复乳液，充分增强合成聚合物微粒的生物相容性，并提高聚合物微粒的稳定性；在步骤8)中，将所得纳米微粒溶解于磷酸盐缓冲液，是因为羧甲基壳聚糖在生理条件呈负电性，而sirna带正电，可以将其通过静电作用吸附在表面，实现靶向性；在步骤9)中，通过静止可以增加静电吸附的效率，提高聚合物粒子的结合度，实现药物的高效控释和精确靶向。
6)在步骤1)中选取浓度为1mg/ml石墨烯量子点(cqds)其发光特性较其他浓度明显，且有益于后一步应用于细胞内光热效果；而抗癌药盐酸阿霉素(dox)的浓度选择1mg/ml将有利与细胞作用，表现其抗癌作用。
具体实施方式
以下通过具体的实施方式对本发明作进一步的说明，但本发明的实施方式并不受以下实施例的限制。
实施例1
本发明一种sirna靶向ph响应性载药光热治疗纳米粒子的制备方法，包括如下制备骤：
步骤1)：选取浓度均为1mg/ml的石墨烯量子点和抗癌药盐酸阿霉素水溶液，置于4℃的冰箱中预冷备用，作为内部水相；
步骤2)：将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于二氯乙烯中，配制成浓度为2％的plga有机溶液，置于4℃的冰箱中预冷备用，作为中间油相；
步骤3)：将水溶性羧甲基壳聚糖溶于水中，配制成浓度为3％的羧甲基壳聚糖水溶液，置于4℃的冰箱中预冷备用，作为外部水相；
步骤4)：将小干扰sirna溶于磷酸盐缓冲液，得配制成浓度为20μmol/l的均匀溶液，置于4℃的冰箱中预冷备用；
步骤5)：取1ml步骤1)获得的石墨烯量子点水溶液和1ml抗癌药盐酸阿霉素水溶液混合，加入到8ml步骤2)获得的plga有机溶液中，使用超声乳化仪超声1min，振幅设为30，制得w/o初乳液；
步骤6)：将步骤6)制得的w/o初乳液立即转移到18ml步骤3)获得的羧甲基壳聚糖水溶液中，超声1min，制得w/o/w复乳液；
步骤7)：将步骤7)制得的w/o/w复乳液逐滴加入到60ml去离子水中，磁力搅拌，陈化30min，待有机溶剂挥发完全后，使用冷冻高速离心机，在14000r/m的转速下离心5min，收集微粒，并用去离子水洗涤2次以除去残留的分散剂，最后冻干保存，获得纳米粒子；
步骤8)：称取40mg步骤7)获得的纳米粒子分散于40ml磷酸盐缓冲液并充分搅拌，使其分散均匀，获得分散液；
步骤9)：取10ml步骤4)所得的均匀溶液，在室温滴加至步骤8)获得的分散液中，均匀搅拌2h，随后静止20min；
步骤10)：将步骤9)所得的溶液经冷冻高速离心机，在14000r/m的转速下离心5min，并用磷酸盐缓冲液清洗2次，收集微粒，获得具有sirna靶向ph响应性载药光热纳米粒子。
实施例2
一种sirna靶向ph响应性载药光热治疗纳米粒子的制备方法，包括如下制备骤：
步骤1)：选取浓度均为1mg/ml的石墨烯量子点和抗癌药盐酸阿霉素水溶液，置于4℃的冰箱中预冷备用，作为内部水相；
步骤2)：将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于二氯乙烯中，配制成浓度为3％的plga有机溶液，置于4℃的冰箱中预冷备用，作为中间油相；
步骤3)：将水溶性羧甲基壳聚糖溶于水中，配制成浓度为4％的羧甲基壳聚糖水溶液，置于4℃的冰箱中预冷备用，作为外部水相；
步骤4)：将小干扰sirna溶于磷酸盐缓冲液，得配制成浓度为30μmol/l的均匀溶液，置于4℃的冰箱中预冷备用；
步骤5)：取1.5ml步骤1)获得的石墨烯量子点水溶液和1.5ml抗癌药盐酸阿霉素水溶液混合，加入到10ml步骤2)获得的plga有机溶液中，使用超声乳化仪超声1.5min，振幅设为30，制得w/o初乳液；
步骤6)：将步骤6)制得的w/o初乳液立即转移到21ml步骤3)获得的羧甲基壳聚糖水溶液中，超声1.5min，制得w/o/w复乳液；
步骤7)：将步骤7)制得的w/o/w复乳液逐滴加入到70ml去离子水中，磁力搅拌，陈化45min，待有机溶剂挥发完全后，使用冷冻高速离心机，在14000r/m的转速下离心7.5min，收集微粒，并用去离子水洗涤2次以除去残留的分散剂，最后冻干保存，获得纳米粒子；
步骤8)：称取45mg步骤7)获得的纳米粒子分散于45ml磷酸盐缓冲液并充分搅拌，使其分散均匀，获得分散液；
步骤9)：取15ml步骤4)所得的均匀溶液，在室温滴加至步骤8)获得的分散液中，均匀搅拌2h，随后静止25min；
步骤10)：将步骤9)所得的溶液经冷冻高速离心机，在14000r/m的转速下离心7.5min，并用磷酸盐缓冲液清洗2次，收集微粒，获得具有sirna靶向ph响应性载药光热纳米粒子。
实施例3
本发明一种sirna靶向ph响应性载药光热治疗纳米粒子的制备方法，包括如下制备骤：
步骤1)：选取浓度均为1mg/ml的石墨烯量子点和抗癌药盐酸阿霉素水溶液，置于4℃的冰箱中预冷备用，作为内部水相；
步骤2)：将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于二氯乙烯中，配制成浓度为4％的plga有机溶液，置于4℃的冰箱中预冷备用，作为中间油相；
步骤3)：将水溶性羧甲基壳聚糖溶于水中，配制成浓度为5％的羧甲基壳聚糖水溶液，置于4℃的冰箱中预冷备用，作为外部水相；
步骤4)：将小干扰sirna溶于磷酸盐缓冲液，得配制成浓度为40μmol/l的均匀溶液，置于4℃的冰箱中预冷备用；
步骤5)：取1-2ml步骤1)获得的石墨烯量子点水溶液和2ml抗癌药盐酸阿霉素水溶液混合，加入到12ml步骤2)获得的plga有机溶液中，使用超声乳化仪超声2min，振幅设为30，制得w/o初乳液；
步骤6)：将步骤6)制得的w/o初乳液立即转移到24ml步骤3)获得的羧甲基壳聚糖水溶液中，超声2min，制得w/o/w复乳液；
步骤7)：将步骤7)制得的w/o/w复乳液逐滴加入到80ml去离子水中，磁力搅拌，陈化60min，待有机溶剂挥发完全后，使用冷冻高速离心机，在14000r/m的转速下离心10min，收集微粒，并用去离子水洗涤3次以除去残留的分散剂，最后冻干保存，获得纳米粒子；
步骤8)：称取50mg步骤7)获得的纳米粒子分散于50ml磷酸盐缓冲液并充分搅拌，使其分散均匀，获得分散液；
步骤9)：取20ml步骤4)所得的均匀溶液，在室温滴加至步骤8)获得的分散液中，均匀搅拌2h，随后静止30min；
步骤10)：将步骤9)所得的溶液经冷冻高速离心机，在14000r/m的转速下离心10min，并用磷酸盐缓冲液清洗3次，收集微粒，获得具有sirna靶向ph响应性载药光热纳米粒子。
最后，需要注意的是，本发明不限于以上实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容中直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。