氢气在制备医用防治制品中的用途的制作方法

本发明涉及医药技术领域，涉及氢气的医用用途，具体涉及氢气在制备医用防治制品中的用途，尤其是在制备治疗压疮的制剂和设备中的用途

背景技术：

资料记载，压疮又称压力性溃疡，是一种由于机体局部组织长期受压所致的组织坏死性皮肤疾病。调查显示，近年来，随着我国城镇化、老龄化进程的加快，其患病率呈逐渐增长趋势。压疮其致病机制主要与局部组织缺氧、重复性缺血再灌注损伤、细菌定植等因素密切相关，易于迁延，反复发作，治疗困难，经久难愈，是临床上十分常见的“顽疾”，对患者生活质量影响很大。研究显示，由于机体局部组织长期受压，导致皮损区处于慢性缺血状态，皮损周围区表现为纤维化和局部组织灌注降低，导致组织缺血坏死，且难以愈合；较之组织缺氧，组织缺血再灌注在压疮发生发展过程中更为关键。组织早期缺血可降低细胞代谢水平以保存功能，而后反复血液再灌注至缺氧区，则易诱发氧化自由基分子过度产生，启动组织损伤事件。又有如，急性广泛的自由基损伤可启动血管内皮细胞的凋亡，引起内皮细胞骨架破坏并损伤细胞间粘附，导致血管内皮屏障渗透性升高；这些损伤改变，进一步促进炎细胞的停滞、粘附、趋化与激活，而白细胞激活可以氧化爆发式释放ros，从而增强蓄积性氧化损伤，加重对血管和周围组织的损伤，导致组织水肿和血流动力学改变；因此，缺血再灌注诱发的炎症损伤成为介导压力性溃疡发生发展的重要致病基础。目前临床常用的压疮治疗方法有限，如加强护理、外科清创、物理治疗、生长因子以及皮肤移植等，压疮的治疗已成为业内公认的难题。

最为自然界最简单的分子氢气，长期以来被生物界和医学界所忽视。2007年7月，日本太田成男教授在naturalmedicine报道，动物呼吸2％氢气可有效清除自由基，显著改善脑缺血再灌注损伤，首次证实氢气对羟基自由基和亚硝酸阴离子的选择性抗氧化效应；继而有临床与基础研究表明，氢气对有关氧化损伤、炎症反应、细胞凋亡和血管异常增生等病症具有治疗作用。

研究显示，氢气在临床研究中获得应用的另一个原因在于其具有生物安全性，依据为一、国际潜水医学机构70余年的氢气潜水研究，证明高压氢气对人体无任何毒副作用；二、肠道菌群研究发现，大肠内细菌大肠埃希菌可产生氢气，有学者研究提出阿卡波糖对心脏的保护作用可能与其促进大肠内氢气产生密切相关；三、随着氢气在临床研究中的推广，迄今为止，尚无任何证据表明其对人体存在危害性。目前，氢气已被多个国家列为食品添加剂，因此其生物安全毋庸置疑。

迄今，尚未见有关氢气在用于制备治疗压疮的制剂和设备中的用途。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供氢气新的医用用途，具体涉及氢气在制备医用防治制品中的用途，尤其是在制备治疗压疮的制剂和设备中的用途。

技术实现要素：

本发明的目的是基于现有技术的现状，提供氢气新的医用用途，涉及氢气在制备医用防治制品中的用途，尤其是在制备治疗压疮的制剂和设备中的用途。

本发明所述的氢气，为购自上海潓美医疗科技有限公司的相关产氢设备产生。

本发明进行了动物实验，结果显示，氢气干预有利于促进缺血再关注损伤性皮肤溃疡的愈合，具有显著的抗氧化、抗炎以及促修复活性；对缺血再灌注损伤所致的小鼠压疮，提前氢气干预一周可显著缩小早期皮损处的溃疡面积，75％氢气能缩短创面愈合时间；在溃疡形成中期(造模后5-7d)后，氢气干预组小鼠皮损组织的dna损伤(8-oxodg)与细胞凋亡率显著降低，其干预效果与氢气浓度密切相关，以75％氢气效果最佳；皮损组织的氧化自由基与氧化还原酶表达检测显示，氢气干预显著降低缺血再灌注所产生的氧自由基水平，而sod、gpx和cat等抗氧化酶的活性显著升高；分析认为，氢气的抗氧化活性，可能源于其对压疮组织中nrf2抗氧化通路的激活，氢气干预组皮损组织中nrf2及下游关键蛋白ho-1、akr1c1和nqo1的转录与蛋白表达水平显著高于对照组，其调控效应与氢气干预浓度呈正相关；氢气干预可显著抑制压疮皮损组织中促炎细胞因子il-1β、tnf-α、il-6和il-8的表达，促进抑炎性细胞因子il-22的表达，显著逆转缺血再灌注皮肤组织的促炎微环境，其干预效果与氢气浓度呈正相关；本发明的实验结果还显示，氢气干预可显著增强压疮皮损组织中vegf、igf-1、tgf-β等创伤修复因子的表达，并显著抑制金属蛋白酶mmp9的表达，创伤修复相关蛋白的表达改变促进了创口肉芽组织的形成，其促修复活性与氢气干预浓度密切相关。

本发明中，所采用的氢气对人体具有较高的生物安全性，其安全性主要依据以下方面：一、国际潜水医学机构70余年的氢气潜水研究证明高压氢气对人体无任何毒副作用；二、肠道菌群研究显示大肠内细菌大肠埃希菌可产生氢气，以及有学者研究提出阿卡波糖对心脏的保护作用可能与其促进大肠内氢气产生密切相关；三、随着氢气在临床研究中的推广，迄今为止，尚无任何证据表明其对人体存在危害性；以及目前，氢气已被中国、日本、欧盟等多个国家列为食品添加剂，因此，其生物安全毋庸置疑。

本发明中，所述的氢气可经呼吸氢气、富氢水泡浴等防治设备以及静脉注射富氢生理盐水等临床制剂方式发挥治疗预防作用，进一步，所述的氢气可用于制备医用防治制品，尤其是用于制备治疗压疮的制剂和设备中。

本发明为氢气的应用开辟了新的用途，为压疮的临床治疗和预防保健提供了一种新的干预方案，具有良好的临床应用前景。

附图说明

图1，不同浓度氢气呼吸可加速压疮小鼠创口的愈合，其中，

a.皮肤缺血再灌注损伤小鼠皮损图片比较；b.小鼠压疮皮损面积分析；*p＜0.05，***p＜0.001；ctrl为对照组。

图2，氢气可显著降低压疮组织的氧化损伤与细胞凋亡水平，其中，

a.各组小鼠造模后不同时间节点皮损组织的8-oxodg免疫组化分析；b.各组小鼠造模后不同时间节点皮损组织的细胞凋亡检测(tunel)；c.小鼠组织细胞凋亡率分析；^*p＜0.05，^**p＜0.01，与对照组进行比较。

图3.，氢气干预可显著降低缺血再灌注所致的氧化自由基水平(a)，并显著增强氧化还原酶的表达水平(b-d)；^*p＜0.05，^**p＜0.01。

图4，氢气干预显著增强压疮小鼠皮损组织中nrf2通路关键蛋白的表达水平，其中，

a.实时定量pcr；b.蛋白印迹；^*p＜0.05，^**p＜0.01，与对照组进行比较。

图5，氢气干预显著逆转缺血再灌注损伤皮肤组织中的促炎微环境，其中，

a.elisa检测；b.蛋白印迹；c.免疫组化；^*p＜0.05，^**p＜0.01。

图6，氢气干预可显著促进缺血再灌注损伤皮肤中创伤修复蛋白的表达，其中，

a.实时定量pcr；b.蛋白印迹；^*p＜0.05，^**p＜0.01，与对照组进行比较。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的实施作详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1.氢气干预有利于缺血再关注损伤性皮肤溃疡的愈合

24只6-8周龄c57小鼠(常州卡文斯实验动物有限公司)；圆形铁磁片：12mm直径，5mm厚，面积113mm²，可形成1000g磁力，其外在压强约为50mmhg，可降低皮肤血流80％，足以诱导缺血再灌注型皮肤坏死；

c57小鼠麻醉后，进行常规处理，其背部脱毛，以70％酒精和安尔碘消毒，用上述两块磁片夹住实验小鼠背部皮肤，使磁片夹住表皮、真皮、皮下脂肪及部分疏松结缔组织，但不包含肌肉，磁片周围mark笔标记皮肤伤口边缘，12h后松开；第二天、第三天如此重复三轮，即在同样部位夹闭12h松开12h，将压疮模型小鼠按照分组随机分为3组，每组8只：对照组不吸氢气，低浓度氢气干预组2％h2*6h/d，高浓度氢气干预组75％h2*6h/d，对照组造模前提前氢气预处理一周；造模成功后分别于第1d,3d,5d,7d,10d,12d对每只小鼠的伤口进行拍照；

实验结果如图1所示，皮肤缺血再灌注损伤模型造模后3-5天，氢气干预组小鼠压疮伤口面积显著低于对照组，其中以75％氢气干预效果最佳，创面愈合最快；此外，75％氢气干预组所有小鼠在造模成功后10天愈合，而对照组小鼠至少需12天方可愈合；2％氢气干预未能缩短小鼠创面的总体愈合时间，但各时间点创面面积均低于对照组，结果表明，氢气干预尤其高浓度氢气有利于促进缺血再灌注损伤性皮肤溃疡的愈合。

实施例2.氢气干预可降低压疮组织的氧化损伤与细胞凋亡水平

实验材料：皮肤石蜡切片，二甲苯，100％乙醇，95％乙醇，90乙醇，80％乙醇，70乙醇，30％过氧化氢，10×pbs磷酸盐缓冲液，柠檬酸盐缓冲液，bsa，i-cam1抗体(abcam)，dab显色液(中杉金桥，zli-9017)，苏木素，中性树胶。tunel染色试剂盒(凯基,kga7072)；

倒置显微镜(olympus,ix71)，倒置拍照显微镜(leica公司ix71)，高压锅(海尔)，电热鼓风干燥箱(上海博讯gzx-9240mbe)，冷藏冰箱(海尔)，移液器(eppendorf)；

实验方法：免疫组化检测：取造模成功后各组小鼠的皮损组织，制备蜡块；二甲苯ⅰ脱蜡30min，二甲苯ⅱ脱蜡10min；梯度酒精复水，100％酒精3min，100％酒精3min，95％酒精3min，85％酒精3min，75％酒精3min，50％酒精3min，蒸馏水3min，蒸馏水3min，pbs5min；内源过氧化物酶灭活，3％h2o2/pbs室温孵育10min，pbs漂洗5min，重复三次；将切片浸入抗原修复液中(柠檬酸三钠缓冲液)中，96℃5min；用1ml移液器在切片表面加2mlpbs洗涤，重复3次，每次5min；10％fbs封闭，室温15min；加入一抗，4℃孵育过夜；洗片，用1ml移液枪在切片表面加2mlpbs洗涤，重复3次，每次5min；在切片的组织部分用100μl移液器加入100μldab显色液,显色30min；流水冲洗5min，滴加1滴苏木素至切片的组织上，作用2min，流水冲洗5min；显微镜下观察拍照：

tunel检测：将皮损组织二甲苯ⅰ脱蜡30min，二甲苯ⅱ脱蜡10min；梯度酒精复水后，加入1％tritonx-100进行通透5min，pbs洗涤3次，每次5min；配制并滴加100μl含不同活性单位u的dnasei反应液，37度处理30min；pbs洗涤3次，每次5min；配制tdt酶反应液；样本周围用吸水纸吸干，每个样本上滴加50μltdt酶反应液，放入湿盒中，37度避光反应1h；反应后的样本用pbs洗涤3次，每次5min，注意避光；streptavidin-fluorescein试剂按每样5μl用量与45μllabelingbuffer混匀，计算所需的总量后，即用即配，注意避光；细胞培养孔中滴加50μlstreptavidin-fluorescein标记液，放入湿盒，37度避光反应30min；反应后用用pbs洗涤3次，每次5min，注意避光；hoechst复染细胞核，室温避光孵育10min；洗去hoechst染液，荧光显微镜下观察拍照；

8-oxodg免疫组化结果显示(如图2a所示)：造模后1d各组的表达类似，表明此时各组的dna损伤程度相似；3d时8-oxodg表达结果提示，对照组>2％h2组>75％h2组；5d与3d类似；7d时对照组的8-oxodg表达有所降低，但仍显著高于氢气干预组，2％h2干预组的表达明显下降，而75％h2组表达最低。tunel检测结果显示(如图2b&2c所示)：1d时三组的细胞凋亡率类似；3d时75％h2干预组的细胞凋亡轻度降低；5d时氢气干预组的凋亡率显著低于对照组；7d时各组凋亡率进一步降低，氢气干预组显著低于对照组；

结果表明，氢气干预显著降低小鼠皮损组织中的dna损伤与细胞凋亡率，其干预效果与氢气浓度密切相关，以75％氢气效果最佳。

实施例3.氢气通过激活nrf2通路提升压疮小鼠的抗氧化水平

实验材料：gpx(biovision#k762-100)，cat(biovision#k773-100)，sod(南京建成a001-3)，ros。trizol(invitrogen),depc处理水(sigma)，氯仿/异丙醇/无水乙醇(上海国药)，sybrgreenpcr试剂盒(thermof-415xl)，逆转录试剂盒(thermo#k1622)。bca蛋白定量试剂盒(biosharpbl521a)，pvdf膜(milliporehatf00010)，hrp标记二抗(中杉金桥zb-5305)；

细胞培养箱(thermoscientific8000)，光学显微镜(xds-1a)，酶标仪(dnm-9602)；实时定量pcr仪(biorad)，温冷冻离心机(sigma3k15),real-time检测仪(abi-7500)。电泳仪(bio-rad,miniprotean3cell)，酶标仪(thermo,mk3)，一体式化学发光成像仪(chemiscope5300pro)；

实验方法：elisa操作同说明书；

real-timepcr：组织内总rna采用trizon提取试剂盒进行抽提，称取各组100mg皮肤组织加入1mltrizol充分匀浆，室温静置5min；加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，静置3min；4℃12000rpm离心10min，取上清；加入0.5ml异丙醇，混匀，冰上静置20-30min；4℃12000rpm离心10min，弃上清；加入1ml75％乙醇，洗涤沉淀。4℃7500g离心5min，弃上清；室温放置晾干或超净台中吹干5min左右，加入适量的rnase-freeh2o溶解；采用第一链cdna合成试剂盒合成cdna(具体步骤同说明书)；合成引物，逆转录pcr所使用的的引物由上海生工公司primerpremier5.0软件设计、合成，以管家基因β-actin为内参；根据realtime-pcr反应体系配制反应液，进行pcr扩增，94℃10min，(94℃20秒,55℃20秒,72℃20秒)40个循环；

蛋白印迹：取各组压疮小鼠皮损组织，匀浆后加入ripa裂解液，并加入适量的pmsf，置于冰上裂解2h；12000rpm，4℃，离心10min；移上清于新的ep管中，进行蛋白质定量后贮存于-20℃冰箱，以bca蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，制备page胶，将各组蛋白样本(20μg)进行上样及电泳(浓缩胶80v20min，分离胶120v60min)；染料到达胶底部停止电泳，进行转膜；以5％脱脂奶粉，室温封闭1h，依次加入一抗、二抗进行孵育；用tbst洗涤5次，每次10min，一体式化学发光仪拍摄照片；

实验结果显示，检测分析造模后5d各组小鼠皮损组织的活性自由基分子(ros)水平及氧化还原酶表达水平结果显示(如图3所示)，对照组的ros水平较高，当给予氢气干预后ros水平明显下降，特别是75％氢气组的ros下降最为明显；超氧化物歧化酶(sod)、谷胱甘肽还原酶(gpx)和过氧化氢酶(cat)在对照组的活性较低，氢气干预后三者的活性均得以提高，同样75％h2组的三种酶活升高最明显；结果表明，氢气干预显著降低缺血再灌注所产生的氧自由基水平，sod、gpx和cat等抗氧化酶的活性显著升高；

本实施例中，基于nrf2通路是真核细胞内重要的抗氧化调控途径，通过实时定量pcr与蛋白印迹实验，进一步评估各组小鼠皮损组织内的nrf2通路关键蛋白表达情况(如图4所示)，结果显示：nrf2、ho-1、akr1c1和nqo1的mrna水平在对照组最低，随着氢气干预后表达上升，并且具有浓度依赖性，即75％h2组升高最多；nrf2是抗氧化反应元件的激活因子，ho-1和nqo1是其下游抗氧化作用的酶，氢气干预后氧化损伤水平降低，抗氧化的蛋白相应表达升高；

实验结果表明，氢气干预通过激活nrf2抗氧化通路，显著增强压疮小鼠的抗氧化能力，其干预效应与氢气浓度呈正相关。

实施例4.氢气干预可有效逆转缺血再灌注损伤皮肤的促炎微环境

实验材料：il-1β，il-6，tnf-α，il-8，il-22等细胞因子elisa检测试剂盒(thermofisherscientific)；il-1β，il-6，tnf-α，il-8，il-22等细胞因子抗体(invitrogen)。皮肤石蜡切片，二甲苯，100％乙醇，95％乙醇，90乙醇，80％乙醇，70乙醇，30％过氧化氢，10×pbs磷酸盐缓冲液，柠檬酸盐缓冲液，bsa，i-cam1抗体(abcam)，dab显色液(中杉金桥，zli-9017)，苏木素，中性树胶。tunel染色试剂盒(凯基,kga7072)；

倒置显微镜(olympus,ix71)，倒置拍照显微镜(leica公司ix71)，高压锅(海尔)，电热鼓风干燥箱(上海博讯gzx-9240mbe)，冷藏冰箱(海尔)，移液器(eppendorf)。细胞培养箱(thermoscientific8000)，光学显微镜(xds-1a)，酶标仪(dnm-9602)；

实验方法：elisa、蛋白印迹及免疫组化等方法同前；

基于压疮是皮肤反复缺血再灌注损伤引发的炎症损伤反应，本实施例中，用elisa、蛋白印迹及免疫组化方法对造模后5天各组小鼠皮损组织中的炎症细胞因子进行评估(如图5所示)，结果显示：对照组抑炎细胞因子il-22浓度相对较低，而促炎细胞因子il-1β、il-6、tnf-α和il-8浓度相对较高；氢气干预后il-22浓度上升，il-1β、il-6、tnf-α和il-8浓度下降，其中75％氢气干预组的炎性因子表达水平变化最为明显；

结果表明，氢气干预可显著抑制促炎细胞因子il-1β、tnf-α、il-6和il-8的表达，促进抑炎性细胞因子il-22的表达，显著逆转缺血再灌注皮肤组织的促炎微环境，其干预效应与氢气浓度密切相关。

实施例5.氢气干预促进缺血再灌注损伤皮肤中创伤修复蛋白的表达

实验材料：bca蛋白定量试剂盒(biosharpbl521a)，pvdf膜(milliporehatf00010)，hrp标记二抗(中杉金桥zb-5305)；

细胞培养箱(thermoscientific8000)，光学显微镜(xds-1a)，酶标仪(dnm-9602)；低温冷冻离心机(sigma3k15),real-time检测仪(abi-7500)。电泳仪(bio-rad,miniprotean3cell)，酶标仪(thermo,mk3)，一体式化学发光成像仪(chemiscope5300pro)，实时定量pcr仪(biorad)；

实验方法：实时定量pcr与蛋白印迹方法同前；

基于皮肤创伤愈合通常与vegf、igf-1、tgf-β等创伤修复因子的表达水平密切相关，vegf、igf-1和tgf-β对胶原纤维合成有重要作用，是伤口炎症晚期和修复增殖期的主要作用因子，本实施例用实时定量pcr和蛋白印迹分析检测各组小鼠皮损组织中的创伤修复因子表达水平(如图6所示)，结果显示：vegf、igf-1、tgf-β等创伤修复因子的mrna水平在对照组最低，随着氢气干预后表达上升，并且具有浓度依赖性，即75％氢气干预组升高最显著；金属蛋白酶mmp9主要参与降解基底膜或者纤维，其mrna水平在对照组最高，氢气干预后表达显著下降，高浓度氢气干预组下降最为明显，蛋白印迹结果同rt-pcr结果完全一致；结果表明，在压疮小鼠中，氢气干预主要通过调节vegf、igf-1、tgf-β以及mmp9等创伤修复相关因子的表达，促进创口肉芽组织的形成，其干预效果与氢气浓度呈正相关。