本发明涉及一种黄芪甲苷可溶型复合物，特别涉及一种具有高稳定性黄芪甲苷可溶型复合物及其制备方法。
背景技术：
：黄芪甲苷(astragalosideiv，cas号83207-58-3)，是一种从黄芪中分离得到的环丙烷型三萜皂苷，是黄芪的主要有效成分，具有防治心血管疾病、抗癌、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗高血糖和神经保护等多种药理活性，具有良好的药用价值，极具开发潜力。最新的研究表明，黄芪甲苷在治疗糖尿病等方面具有降血糖、降血脂、改善胰岛素抵抗、抑制炎症反应等广泛的药理学活性，并且在糖尿病引起的视网膜病变中黄芪甲苷对视网膜神经节细胞具有保护作用，这表明黄芪甲苷在治疗糖尿病及其并发症等方面如糖尿病性角膜病变有着广阔的应用前景。但是黄芪甲苷存在如下不足，严重影响其开发和利用：水溶解性差，黄芪甲苷在水相中20℃时，在水中溶解度仅为0.05mg/ml；半衰期短、透生物膜性能差，口服等生物利用度极低，仅为2.2％。上述这些不足，严重限制了黄芪甲苷在临床和作为饮料、膳食剂等食品工业等领域的应用。因此，很有必要进一步探索一种经济又有效的新型黄芪甲苷制剂或产品。黄芪甲苷是黄芪的主要活性成分，通常作为评价黄芪药材质量优劣的标准，黄芪在我国的用药历史已非常悠久，并且具有广泛的药理活性。本发明人通过实验进行比较，发现目前已有的文献报道和技术均不能满足黄芪甲苷水溶液溶解度及其水溶液稳定性的要求。发明专利申请号200610013088.6“黄芪甲苷脂质体及其药物制剂”，公开了一种采用黄芪甲苷、磷脂以及亲脂性添加剂制备的脂质体，显著提高了黄芪甲苷的口服生物利用度，但是该发明专利所公开的技术并没有解决黄芪甲苷在水溶液中的溶解度及其水溶液稳定性，无法解决滴眼液等临床需求的水溶液制剂需求，也无法解决黄芪甲苷在一些保健品、饮料行业等领域的应用需求，且该发明专利申请中，采用磷脂等制备黄芪甲苷的脂质体，因磷脂本身性质不稳定，容易氧化，无法在水溶液状态下长期保存。发明专利申请号200510095308.x“黄芪甲苷环糊精包合物、制剂及制备方法”，公开了一种采用环糊精包合黄芪甲苷，提高了黄芪甲苷的溶解度和口服生物利用度，但是该发明专利所公开的技术并没有显著提高黄芪甲苷在水溶液中的溶解度，仅将黄芪甲苷溶解度由22.2μg/ml提高至188.4～386.8μg/ml，且该包合物最终是固体状态保存，其水溶液稳定性并没有提高的数据公开，但依据包合物常识性推断，且该发明专利申请中制备的环糊精包合黄芪甲苷无法在水溶液状态下长期保存。而研究表明黄芪甲苷滴眼液浓度需要在2mg/ml以上浓度，该发明提高溶解度的幅度有限，达不到黄芪甲苷有效滴眼液浓度要求。发明专利申请号200510014971.2“一种黄芪甲苷注射液及其制备方法”，公开了一种采用非水溶剂、助溶剂来提高黄芪甲苷的溶解度，用于制备注射剂。但是因该发明使用乙醇等非水溶剂，且非水溶剂的浓度达20％～60％，无法应用于医药领域的滴眼液、常规饮料等领域。采用纳米药物递送技术可以提高难溶性药物溶解度，提高药物水溶液稳定性，提高口服生物利用度。目前常用的眼用纳米药物递送系统如胶束、纳米粒等主要采用聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇共聚物(pvcl-pva-peg)、聚羟基乙酸(pga)、聚乳酸(pla)、羟基乙酸与乳酸的共聚物(plga)、乙交酯-丙交酯-己内酯三元无规共聚物(pglc)等，其本身仅为一种载体而已，没有治疗作用，且这些人工合成的高分子材料载体，因存在降解性等问题，长期使用存在一定的安全隐患。如能使用天然提取物质，特别是天然提取的小分子物质作为一种新型载体，这种载体可起到构建纳米药物递送系统的作用，提高药物稳定性，增强角膜药物吸收、提高疗效。目前已报道的天然小分子物质作为载体的有人参皂苷(发明专利申请号201310155639.2)、甜菊甙(现代食品科技,2014,30(1):115-119；jagricfoodchem,2013,61(18):4433-4440)等。上述已有研究和报道的天然小分子物质作为载体可满足对白藜芦醇、姜黄素等难溶化学物的包载，但是本发明人通过实验对比，发现目前已有的文献报道的人参皂苷、甜菊甙均不能满足黄芪甲苷滴眼溶解度及其水溶液稳定性的要求。上述已有文献报道中的人参皂苷、甜菊甙等对其包载的黄芪甲苷没有很好的稳定作用，黄芪甲苷很快从胶束中渗漏出来，达不到滴眼液的长期稳定作用。因此，如能选择一种天然小分子物质，使其能有效包封黄芪甲苷，从而提高黄芪甲苷在水溶液中的溶解度及其稳定性，维持其药理活性，同时在有效的包封浓度下这种天然的小分子物质对眼部无刺激性，安全有效就显得尤为重要。瑞鲍迪苷a(rebaudiosidea，cas登记号58543-16-1，分子式c44h70o23，分子量967.03)是从菊科植物steviarebaudia(该植物在我国称作甜叶菊)的叶子中提取出来的一种糖苷，作为一种新型天然甜味剂而广泛应用于食品、饮料、调味料的生产中。在南美洲使用甜叶菊作为药草和代糖已经有几百年历史。近年的研究表明，瑞鲍迪苷a具有强抗氧化活性(saravananr,ramachandranv.modulatingefficacyofrebaudiosidea,aditerpenoidonantioxidantandcirculatorylipidsinexperimentaldiabeticrats.environtoxicolpharmacol.2013,36(2):472-83)，同时，瑞鲍迪苷a具有强抗糖尿病、抗炎、免疫调节等作用(v,s,n,etal.insightintoanti-diabeticeffectoflowdoseofstevioside.biomedpharmacother.2017,90:216-221)。本发明人研究发现，瑞鲍迪苷a可显著增溶黄芪甲苷，提高黄芪甲苷稳定性，并显著提高黄芪甲苷口服生物利用度。而从菊科植物steviarebaudia(该植物在我国称作甜叶菊)的叶子中提取出来的另一种成分甜菊甙(又名甜菊糖苷，cas登记号57817-89-7，分子式c38h60o18，分子量804.87)，则未能达到同时提高黄芪甲苷水溶解度及其稳定性的作用。甘草酸(glycyrrhizicacid，cas登记号:1405-86-3，分子式:c42h62o16，分子量:822.93)是甘草的主要成份，具有抗炎、抗氧、抑菌、治疗创伤、有效清除超氧离子和羟基自由基、显著抑制脂质体过氧化物的作用。技术实现要素：本发明的目的是提供一种具有高稳定型黄芪甲苷可溶型复合物，改善黄芪甲苷水溶性，提高溶解度，提高与改善口服给药后的生物利用度，并提高黄芪甲苷的贮存稳定性，同时，构建黄芪甲苷复合物的载体是两种天然的安全的小分子物质，具有抗糖尿病、抗炎、免疫调节等作用，使得其构建的黄芪甲苷复合物具有协同增效的作用，例如，增强黄芪甲苷治疗糖尿病并发症如糖尿病性角膜病变和角膜神经病变的药效。同时，黄芪甲苷改善水溶解度，提高其在水溶液中的稳定性后，可拓展黄芪甲苷在食品工业以及领域的应用，例如，用于保健型饮料等。本发明的另外一个目的是提供上述黄芪甲苷复合物的制备方法。本发明技术构思：黄芪甲苷具有明确的抗氧化、抗炎、抗糖尿病和神经保护等药理学活性，但是黄芪甲苷难溶于水、口服生物利用度低等问题严重限制了黄芪甲苷在临床药物治疗、食品工业等领域中的应用。而提高黄芪甲苷的稳定性，特别是提高其在水溶液中的稳定性，可显著拓展其临床应用(例如，可制备成口服液、滴眼液等水溶液制剂)及其在保健食品等领域的应用(例如，可制备成饮料等)。采用纳米药物递送系统将黄芪甲苷构建成纳米制剂，因纳米药物递送系统的本身所特有的优势，将使黄芪甲苷稳定性显著提高，提高口服生物利用度，增强疗效。而采用具有生物活性的小分子天然产物作为构建黄芪甲苷纳米制剂的载体，不仅起到有效构建黄芪甲苷纳米制剂，还因载体具有药理学活性，则可进一步增强黄芪甲苷的药理学效应。本发明人研究发现，瑞鲍迪苷a和甘草酸在水溶液中可自发形成具有类似胶束的纳米结构，发挥增溶黄芪甲苷的作用，且因瑞鲍迪苷a本身的抗氧化活性，甘草酸类似激素的抗炎活性，能很好的与黄芪甲苷进行协同作用，增强黄芪甲苷胶束溶液的药理学活性。瑞鲍迪苷a和甘草酸的混合胶束增溶的黄芪甲苷溶液，即黄芪甲苷胶束溶液，稳定性显著提高，进一步实验发现黄芪甲苷胶束溶液具有显著的提高口服生物利用度、提高黄芪甲苷治疗糖尿病性角膜病变的有效性作用。本发明的技术方案：一种黄芪甲苷可溶型复合物，包括黄芪甲苷为主药，其特征还在于包括瑞鲍迪苷a和甘草酸作为药物辅料，所述黄芪甲苷主药和瑞鲍迪苷a药物辅料质量比在1:15-1:30之间，所述甘草酸和瑞鲍迪苷a两种药物辅料质量比在1:3-1:6之间。所述的瑞鲍迪苷a(rebaudiosidea)为菊科植物steviarebaudia(该植物在我国称作甜叶菊)的叶子中提取出来的一种糖苷(cas登记号:58543-16-1，分子式:c44h70o23，分子量:967.03)，瑞鲍迪苷a纯度≥98％。所述的甘草酸(glycyrrhizicacid，cas登记号:1405-86-3，分子式:c42h62o16，分子量:822.93)是甘草的主要成份，甘草酸纯度≥97％。本发明的黄芪甲苷可溶型复合物的制备方法如下：将黄芪甲苷和瑞鲍迪苷a、甘草酸溶解到无水乙醇中，通过40℃水浴旋转真空蒸发乙醇(可回收乙醇)，在容器内部形成固体粉末即得本发明的黄芪甲苷复合物。制备工艺简单，绿色环保，适用于工业化大规模生产。上述黄芪甲苷胶束复合物的制备方法，制得的黄芪甲苷复合物极易溶于水，溶解度可达13.6mg/ml，黄芪甲苷复合物溶于水后自发形成胶束，胶束粒径范围在6～15nm之间。上述黄芪甲苷胶束复合物，适用于进一步制备成口服液等水溶液制剂，也适用于灌装胶囊，或者直接袋装成散剂。上述黄芪甲苷胶束复合物的制备方法，制备过程及工艺简单，操作简单，无需喷雾干燥等大型仪器设备，适用于工业化生产，也非常适用于制药企业或食品企业等的洁净化工业生产。本发明制备的黄芪甲苷复合物，因在水溶液中，复合物材料瑞鲍迪苷a与甘草酸可自组装形成胶束，快速增溶黄芪甲苷，使得黄芪甲苷在水溶液中有良好的溶解性，黄芪甲苷的溶解度可达13.6mg/ml，且胶束粒径极小，分布范围均一，药物稳定性良好。该黄芪甲苷复合物不但提高了黄芪甲苷在水溶液状态中的稳定性，还可显著增强口服生物利用度，本发明的实验结果表明，相同剂量的本发明专利的黄芪甲苷复合物在大鼠灌胃后的口服生物利用度是制备之前的黄芪甲苷普通粉末的9.7倍，同时瑞鲍迪苷a具有的抗糖尿病、抗炎等活性以及甘草酸具有的抗炎、免疫调节等活性使得黄芪甲苷复合物具有很好的协同治疗糖尿病性并发症如糖尿病性角膜病变和角膜神经病变的药效。因此，本发明的黄芪甲苷复合物具有很好的经济性。具体实施方式下面通过具体实施例来进一步详细说明本发明。实施例1：将50mg黄芪甲苷、900mg瑞鲍迪苷a、300mg甘草酸置于100ml圆底烧瓶中，加入50ml无水乙醇，充分溶解后，40℃水浴旋转真空蒸发无水乙醇并回收乙醇，得到黄芪甲苷和瑞鲍迪苷a、甘草酸的均匀分散的黄芪甲苷复合物。实施例2：将20mg黄芪甲苷、300mg瑞鲍迪苷a、50mg甘草酸置于100ml圆底烧瓶中，加入50ml无水乙醇，充分溶解后，40℃水浴旋转真空蒸发无水乙醇并回收乙醇，得到黄芪甲苷和瑞鲍迪苷a、甘草酸的均匀分散的黄芪甲苷复合物。实施例3：将100mg黄芪甲苷、3000mg瑞鲍迪苷a、750mg甘草酸置于100ml圆底烧瓶中，加入50ml无水乙醇，充分溶解后，40℃水浴旋转真空蒸发无水乙醇并回收乙醇，得到黄芪甲苷和瑞鲍迪苷a、甘草酸的均匀分散的黄芪甲苷复合物。实施例4：将100mg黄芪甲苷、3000mg瑞鲍迪苷a、1000mg甘草酸置于100ml圆底烧瓶中，加入50ml无水乙醇，充分溶解后，40℃水浴旋转真空蒸发无水乙醇并回收乙醇，得到黄芪甲苷和瑞鲍迪苷a、甘草酸的均匀分散的黄芪甲苷复合物。实验效果例1：本发明的黄芪甲苷复合物溶解性能及其水溶液稳定性测定。实验药物：黄芪甲苷复合物(实施例1制备，设为实验组)。对照药物：采用本发明专利实施例1制备方法，但是不加甘草酸，其余制备过程一致，制备的黄芪甲苷复合物(设为对照药物1)；采用本发明专利实施例1制备方法，但是不加瑞鲍迪苷a，其余制备过程一致，制备的黄芪甲苷复合物(设为对照药物2)；采用申请号200610013088.6“黄芪甲苷脂质体及其药物制剂”，采用黄芪甲苷、磷脂以及亲脂性添加剂制备的脂质体(对照药物3)；黄芪甲苷普通粉末(对照药物4)。实验方法：取过量的实验药物、对照药物1、对照药物2、对照药物3、对照药物4，密封于棕色玻璃瓶中，加入5ml水，漩涡振荡一小时后，吸取液体，0.22μm微孔滤膜过滤后，将过滤所得的溶液分成两份，一份采用100倍甲醇溶解与稀释，高效液相色谱法测定浓度，另一份装于透明玻璃小瓶中，放置于常温(不避光)，24小时候后将液体用0.22μm微孔滤膜过滤后，高效液相色谱法测定浓度，并计算药物含量和降解百分数。实验结果表明，实验药物(即黄芪甲苷复合物)漩涡振荡一小时后溶解的量为13.6mg/ml。采用本发明专利实施例1制备方法，但是不加甘草酸，其余制备过程一致，制备的黄芪甲苷复合物(设为对照药物1)漩涡振荡一小时后溶解的量为11.1mg/ml。采用本发明专利实施例1制备方法，但是不加瑞鲍迪苷a，其余制备过程一致，制备的黄芪甲苷复合物(设为对照药物2)漩涡振荡一小时后溶解的量为8.5mg/ml。采用申请号200610013088.6“黄芪甲苷脂质体及其药物制剂”，采用黄芪甲苷、磷脂以及亲脂性添加剂制备的脂质体(对照药物3)漩涡振荡一小时后溶解的量为0.24mg/ml，黄芪甲苷普通粉末(对照药物4)漩涡振荡一小时后溶解的量为0.038mg/ml。说明本发明技术制备的黄芪甲苷复合物显著提高与改善黄芪甲苷溶解性能，而单纯使用瑞鲍迪苷a或甘草酸也能很好地增溶黄芪甲苷，但是增溶效果没有瑞鲍迪苷a和甘草酸共用的混合胶束好。实验药物(即黄芪甲苷复合物)水溶液常温不避光放置24小时后，溶液中黄芪甲苷含量为初始溶液的93％。采用本发明专利实施例1制备方法，但是不加甘草酸，其余制备过程一致，制备的黄芪甲苷复合物(设为对照药物1)，水溶液常温不避光放置24小时后，溶液中黄芪甲苷含量均只有初始溶液浓度的41％。采用本发明专利实施例1制备方法，但是不加瑞鲍迪苷a，其余制备过程一致，制备的黄芪甲苷复合物(设为对照药物2)，水溶液常温不避光放置24小时后，溶液中黄芪甲苷含量均只有初始溶液浓度的27％，而采用黄芪甲苷、磷脂以及亲脂性添加剂制备的脂质体(对照药物3)和黄芪甲苷普通粉末(对照药物4)水溶液常温不避光放置24小时后，溶液中黄芪甲苷含量均只有初始溶液浓度的1.3％，说明本发明技术制备的黄芪甲苷复合物显著提高与改善黄芪甲苷水溶液的稳定性，而单纯使用瑞鲍迪苷a或甘草酸虽然也能很好地增溶黄芪甲苷，但是水溶液稳定性均较差。实验效果例2：本发明的黄芪甲苷复合物用于stz诱导型糖尿病模型小鼠眼部并发症的有效性。实验药物：黄芪甲苷复合物(实施例1制备，设为实验组)。对照药物：采用本发明专利实施例1制备方法，但是不加甘草酸，其余制备过程一致，制备的黄芪甲苷复合物(设为对照药物1)；采用本发明专利实施例1制备方法，但是不加瑞鲍迪苷a，其余制备过程一致，制备的黄芪甲苷复合物(设为对照药物2)；采用申请号200610013088.6“黄芪甲苷脂质体及其药物制剂”，采用黄芪甲苷、磷脂以及亲脂性添加剂制备的脂质体(对照药物3)；黄芪甲苷普通粉末(对照药物4)。实验动物与实验方法：因stz诱导的糖尿病小鼠作为较公认的类似于人非增殖期糖尿病视网膜病变模型，本部分内容采用此模型进行研究。选用c57bl/6小鼠，雄性，6-8周龄，体重18～25克(购买自北京维通利华实验动物技术有限公司)。动物随机分组，一组采用新鲜配置的柠檬酸盐缓冲液(ph4.5)配制stz溶液后对小鼠进行腹腔注射，连续注射5天，在最后一次(第五次注射)后的第8天(一周后)对每小鼠测量血糖，连续测量3天，stz注射组血糖值大于300mg/dl(16.7mmol/l)认为ⅰ型糖尿病模型成功。模型成功后，将小鼠随机分成6组(即实验组、对照1组、对照2组、对照3组、对照4组、空白对照组)，每组12只，灌胃剂量为25mg/kg体重(灌胃给药剂量结合文献报道确定)，灌胃前，分别将实验组、对照各组的黄芪甲苷溶解或分散于水中，配制成黄芪甲苷浓度为2.5mg/ml，灌胃体积为0.1ml/10g体重(即25mg黄芪甲苷每公斤小鼠体重剂量灌胃)，空白对照组灌胃给予相应体积的生理盐水，每天灌胃一次，连续灌胃8周，8周灌胃结束后对糖尿病小鼠的体重、空腹血糖、角膜敏感度进行测定。0033实验结果表明，stz腹腔注射建模的小鼠，灌胃给予生理盐水的空白对照组，逐渐表现出多饮、多食、多尿、体重下降等糖尿病典型症状，其血糖稳定维持在较高水平，体重较正常小鼠偏低，表明造模成功。而实验组(黄芪甲苷复合物)小鼠的体重和血糖指标则明显优于各对照药物组(表1)。检测小鼠的角膜敏感性，结果显示，stz建模糖尿病小鼠灌胃给予生理盐水的空白对照组的角膜敏感度显著下降(相比于正常小鼠，p<0.05)，而采用本发明专利的黄芪甲苷复合物口服给药组(即实验组)，小鼠角膜敏感度则有不同程度的改善(相比于正常小鼠，p>0.05)，而stz建模糖尿病小鼠对照1组、对照2组、对照3组、对照4组，小鼠角膜敏感度具有一定程度的改善，但是效果差于实验组(黄芪甲苷复合物)小鼠(相比于实验组小鼠，p<0.05)。表1正常和糖尿病模型小鼠在取样点时体重及血糖检测(n＝12)实验效果例3：本发明的黄芪甲苷复合物大鼠口服生物利用度检测实验。实验药物：黄芪甲苷复合物(实施例1制备，设为实验组)。对照药物：采用本发明专利实施例1制备方法，但是不加甘草酸，其余制备过程一致，制备的黄芪甲苷复合物(设为对照药物1)；采用本发明专利实施例1制备方法，但是不加瑞鲍迪苷a，其余制备过程一致，制备的黄芪甲苷复合物(设为对照药物2)；采用申请号200610013088.6“黄芪甲苷脂质体及其药物制剂”，采用黄芪甲苷、磷脂以及亲脂性添加剂制备的脂质体(对照药物3)；黄芪甲苷普通粉末(对照药物4)。实验动物与实验方法：选用sd大鼠，雄性，体重290～310克(购买自北京维通利华实验动物技术有限公司)。动物随机分为5组，每组8只，实验前禁食过夜，灌胃前将实验药物、各组对照药物分别以1mg/ml浓度溶解或分散于水中，以1ml/100g体重进行灌胃(即10mg黄芪甲苷每公斤大鼠体重剂量灌胃)，在给药后的0.25、0.5、1、2、4、6、8、12和24小时，尾静脉取血0.25ml，肝素抗凝，离心分离血浆，高效液相色谱-质谱仪检测血样中黄芪甲苷浓度，das2.0软件处理与分析药物动力学参数。实验结果如表1所示，实验组的cmax显著高于对照药物4组(p<0.05)和对照药物2组(p<0.05)，实验组的auc0-24h也显著优于对照药物4组(p<0.05)，对照药物1组、对照药物2组和对照药物3组相比于对照药物4组，cmax和auc0-24h有不同程度提高(相比于对照药物4组，p<0.05)，但是对照药物1组、对照药物2组和对照药物3组相比于实验组，cmax和auc0-24h均则显著较低(相比于实验组，p<0.05)，说明本发明的黄芪甲苷复合物具有更快的口服吸收，更好的口服吸收生物利用度，且较单独使用甘草酸或瑞鲍迪苷a制备的黄芪甲苷复合物口服效果更好。表2口服药物动力学参数药物动力学参数实验组对照药物1对照药物2对照药物3对照药物4cmax(μg/ml)0.46±0.380.141±0.0110.097±0.0030.041±0.0030.026±0.019tmax(h)12222auc0-24h(μg/ml)88.95±3.7949.54±5.1632.79±3.7316.52±2.359.17±0.36上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。当前第1页12