本发明提供一种新型人造角膜制备方法及应用，属于生物医学领域。
背景技术：
角膜是眼睛最前面的透明部分，是眼睛的聚光镜头，它覆盖眼球的虹膜、瞳孔及前房，它为眼睛提供大部分的屈光力，聚集光线，光线便可在眼睛后部的视网膜上构成影像。并且角膜上还有十分敏感的神经末梢，如果有外物接触到角膜，眼睑便会不由自主地闭合，以达到保护眼睛的作用。角膜上并没有血管，因此其显示透明状，它是通过泪液和房水来获取养分和氧气的。
如果角膜因为角膜炎症、物理伤害、机械伤害、化学伤害或先天性角膜异常等原因受到损伤或发生肿胀，会造成视力的严重减退，严重者甚至会发生失明。对于这种眼疾或失明，目前普遍采用的治疗方法是做眼角膜移植手术，移植他人捐赠的眼角膜。但这种传统的移植他人捐赠的眼角膜的手术可能会因为发生免疫排异反应而造成失败，并且异体角膜来源严重不足，角膜异常的患者不能得到及时地治疗，严重影响他们的生活水平和生活质量。因此临床上迫切需要一种可被移植的、不发生免疫排斥的、与受体体制相容的新型人造角膜。但是制备不会被人体免疫排斥并且精密有效的人造眼角膜是相关研究领域面临的极大挑战。
技术实现要素：
本发明旨在针对现有技术的不足，提供一种新型制备人造角膜的方法，本发明制备的人造角膜可应用于临床，用于治疗因角膜疾病或其他原因造成的眼部损伤或失明。本发明方法选取自体角膜细胞体外再生，与新型生物材料结合制备人造角膜，与受体具有较好的生物相容性，不发生免疫排斥，对治疗因角膜受损或角膜疾病引起的眼疾或失明具有广泛应用潜力。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种人造角膜的制备方法，将角膜在体外进行分离，将上皮细胞和角膜内皮细胞分离出来，之后分别进行角膜上皮细胞和角膜内皮细胞的体外扩增培养；待角膜上皮细胞和角膜内皮细胞传到第3代时进行人造角膜的制备；
所述人造角膜的制备步骤包括：
人造角膜上皮细胞层、前弹力层和基质层的培养：利用第3代角膜上皮细胞做上皮细胞单片层，将6片角膜细胞单层片叠放在一起，形成上皮细胞层，然后加入ⅰ型胶原纤维诱导因子培养形成前弹力层；前弹力层用角化介质培养基继续培养，并加入角膜上皮细胞，培养形成角膜基质层；
人造角膜后弹力层与内皮细胞层的培养：利用第3代角膜内皮细胞做内皮细胞单片层，用含有血清和胶原纤维诱导因子α的df-k培养基，诱导培养生成胶原纤维构成后弹力层；将形成的后弹力层与角膜内皮细胞层转膜，转至上皮细胞层、前弹力层和基质层这前三层膜上，使组织结构由下至上依次是上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮细胞层，细胞培养箱中继续培养3天；
人造角膜的透明培养：3天后换成含钙k-sfm培养基对人造角膜进行透明培养，培养4天后便在体外形成完整的人造角膜。
利用聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚甲基丙烯酸甲酯和硅凝胶对人造角膜进行塑形后，可以临床移植用于治疗因角膜疾病导致的失明。
所述自体角膜可以来自受体角膜疾病治疗过程中废弃的角膜，或者收集受体更换脱落的角膜。
角膜共分为五层，由前向后依次为：上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮细胞层。其中上皮细胞层厚度约为50μm，占整个眼角膜厚度的10％，它由5～6层细胞所组成，角膜有中间厚周边薄的特点，角膜周边部上皮细胞增厚，增加到8～10层。角膜上皮细胞约每周更换一次。可将角膜上皮细胞分离，进行体外培养，用于人造角膜制备。角膜的前弹力层位于上皮细胞基底膜的后部，厚度约为8～14μm，电镜观察显示其为一层相当均匀的非细胞层，它是类似基质的特殊层，并不是真正的膜，而是基质层表层的致密层，它由胶原纤维组合而成，不能与基质层分离，前弹力层上有小孔，角膜神经即是由此小孔到达上皮细胞层。前弹力层损坏后不能再生，而是成为一层不透明的疤痕组织。但是其可由角膜上皮细胞层的上皮细胞在体外经胶原纤维诱导因子诱导合成并分泌到细胞外形成紧致的致密层进而形成弹力层。基质层约占角膜厚度的90％，其主要由胶原纤维、粘合物质和焦化细胞组成。该层的胶原纤维很规则、均匀，由胶原纤维束构成片状，然后层层紧密叠加，这种层状结构使得角膜在剥离术中可以很容易地分离开来。其中的粘合物质则是由角朊硫酸盐、软骨素硫酸盐组成，这些粘合物质便充盈在纤维及细胞间隙维持着基质层的结构状态。因此可以在体外由角膜上皮细胞诱导合成并分泌胶原纤维时加入适宜含量的胶阮硫酸盐和软骨硫酸盐构成致密的基质层。后弹力层则位于基质层的后部，内皮层的前部，该层由内皮细胞产生，厚度约10μm，后弹力层与前弹力层不同，后弹力层能轻易地从基质层上脱离下来，并且损伤后可以在体内再生出来。角膜内皮层是由一层六角形的内皮细胞所形成的，厚度约为5μm，宽约为18～20μm，它直接与眼球的防水接触，这层细胞的再生是会受到限制的，因此分离角膜内皮细胞，对其进行体外扩增培养，并取部分角膜内皮细胞在支架上培养成单层内皮细胞，并诱导内皮细胞产生后弹力层。之后将后弹力层与角膜内皮细胞转膜，转至人造角膜的前三层膜上，培养一定时间后便后在体外形成完整的人造角膜。
本发明还提供所述的人造角膜的制备方法获得的人造角膜，在制备人造角膜移植产品中的应用。所述应用包括将所述人造角膜用0.2％-8.0％聚甲基丙烯酸羟乙酯、1.0％-10％聚甲基丙烯酸甲酯和0.6％-2.0％硅凝胶塑形处理。
本发明具有如下有益效果：
1、本发明人造角膜的制备方法新颖。本发明方法采用将受体的人角膜细胞体外培养、并制备人造角膜的方法，所获得的人造角膜与受体角膜结构一致。本发明人造角膜是根据角膜结构形成过程制备的，其功能与受体角膜一致，本方法制备的人造角膜可替代受损的受体角膜。
2、本发明人造角膜来自受体自体细胞，不会发生免疫排斥，其角膜活性更加符合受体的自身体制，对因角膜受损或角膜疾病引起的眼疾或失明具有显著作用。
3、本发明适用性强。传统角膜移植供体少，资源有限。而本发明不受此限制，任何角膜疾病患者均可适用。应用潜力广泛。
附图说明
图1为实施例1角膜上皮细胞aes170504p0第3天细胞状态。
图2为实施例1角膜上皮细胞aes170504p0第6天细胞状态。
图3为实施例1角膜上皮细胞aes170504p1第4天细胞状态。
图4为实施例1角膜内皮细胞aen170524p0第4天细胞状态。
图5为实施例1角膜内皮细胞aen170524p0第6天细胞状态。
图6为实施例1制备的人造角膜组织结构h&e染色分析。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图将对本发明做进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但不应因此理解为对本发明的限定。本发明所述方法中如无特殊说明，均为本领域常规方法。本发明所述试剂、仪器等，如无特殊说明，均为常规试剂、仪器，可以从商业途径获得。
实施例1、羊自体角膜细胞制备人造角膜
一、角膜上皮细胞的收集和体外扩增培养
(1)手术切取患有角膜疾病的羊的角膜，分离出上皮细胞，用含1×双抗dmem离心洗涤两次；
(2)取1个60mm的细胞培养皿，将配好的matrix(hesc-qualifiedmatrix人胚胎干细胞无血清培养基质)加入培养皿中铺匀，室温静置10min，然后将培养皿内多余液体弃掉。
(3)将角膜上皮细胞沉淀用4mldf-k培养基重悬，接种于步骤(2)已coating过的60mm细胞培养皿中，命名为aes170504p0，细胞培养皿放入37℃5％co2细胞培养箱中培养；
(4)细胞观察与拍照记录：每天在显微镜下观察细胞的生长状态，并拍照记录。第3天细胞状态如图1所示。6天后角膜上皮细胞密度达80％，如图2所示，需传代。
二、角膜上皮细胞的原代培养及传代培养
(1)弃掉培养皿中的旧培养液；用无菌的pbs洗一次去除残留的废旧培养液。
(2)向培养皿中加入2ml胰酶，于37℃培养箱中消化细胞。
(3)5min后显微镜下观察，发现角膜上皮细胞已脱落，加6ml含5％血清的dmem中和消化液。
(4)用移液管将角膜上皮细胞吹打几次，收集并转移到离心管中。
(5)将中和后得到的角膜上皮细胞悬液1000rpm离心5min，弃去上清。
(6)角膜上皮细胞沉淀用10ml含1×双抗的f12培养基重悬，吹打4-5次将细胞团块吹散即可。用细胞计数仪计数，共得到角膜上皮细胞200万。
(7)细胞传代：角膜上皮细胞悬液1000rpm离心5min，弃上清，加df-k培养基20ml重悬细胞，接种到2个t75的细胞培养瓶中，记为aes170504p1，100万/瓶。
将传代的角膜上皮细胞培养瓶放入37℃5％co2细胞培养箱中培养。4天后角膜上皮细胞密度达80％，如图3所示，需传代并冻存角膜上皮细胞。
三、角膜上皮细胞的传代培养及冻存
(1)弃掉培养瓶中的旧培养液；用无菌的pbs洗一次去除残留的废旧培养液。
(2)向培养瓶中加入3ml胰酶，于37℃培养箱中消化细胞。
(3)5min后显微镜下观察，发现角膜上皮细胞已脱落，加7ml含5％血清的dmem中和消化液。
(4)用移液管将角膜上皮细胞吹打几次，收集并转移到离心管中。
(5)将中和后得到的角膜上皮细胞悬液1000rpm离心5min，弃去上清。
(6)角膜上皮细胞沉淀用10ml含1×双抗的f12培养基重悬，吹打4-5次将细胞团块吹散即可。用细胞计数仪计数，共得到角膜上皮细胞900万。
(7)细胞传代：取300万角膜上皮细胞悬液1000rpm离心5min，弃上清，加df-k培养基20ml重悬细胞，接种到2个t75的细胞培养瓶中，记为aes170504p2，150万/瓶；余下600万角膜上皮细胞冻存3支，并编号为aes170504fp1，200万/支。
(8)将传代的角膜上皮细胞培养瓶放入37℃5％co2细胞培养箱中培养。
四、角膜内皮细胞的收集和体外扩增培养
(1)手术切取患有角膜疾病的羊的角膜，放入含1×双抗的dmem培养液中保存。
(2)拿到原始样本后进入实验室，登记，在100mm细胞培养皿中先用镊子小心的将角膜后弹力层连同角膜内皮细胞一起从角膜基质层上剥离下来。
(3)将皮肤组织转移至一个新的100mm细胞培养皿中，将组织置于75％乙醇中涮几下，然后用含双抗(100u/ml青霉素+100mg/l链霉素)的磷酸盐缓冲液(pbs)浸泡3min，2次换液以达到灭菌消毒的目的。
(4)称取12.5mgcollagenase和12.5mgdispase粉末加入到50ml的离心管中，用5mlpbs充分溶解，用0.22μm过滤器过滤到一个新的50ml离心管中。
(5)用2把手术刀呈90度交叉将角膜后弹力层及内皮细胞层组织完全切碎，切好的组织应呈糜状，无肉眼可见的颗粒。切组织过程中避免组织太干，可以加少量pbs或f12或dmem到组织周围。
(6)混合酶消化：将组织用手术刀小心转入含有混合酶液(2.5mg/mlcollagenase和2.5mg/mldispase)的离心管中，充分混匀。37℃水浴80rpm震荡消化，消化过程中每隔10-15min摇晃一下管子将组织团块摇散，消化至无组织块，呈匀浆状态，共消化50min。
(7)胰酶和dnase消化：将1.25ml0.25％胰酶加入含组织的离心管中充分混匀，使其终浓度为0.05％继续消化30min。最后再加100ul10mg/ml的dnase充分混匀后消化5min。
(8)组织消化好后加入6ml的含有10％fbs的dmem中和酶消化液，反复吹打50次。
(9)准备100μm细胞过滤器，置于50ml离心管上。将中和后的酶消化液用过滤器过滤，并用5ml含有10％fbs的dmem清洗离心管和过滤器。
(10)将过滤后得到的细胞悬液1000rpm离心5min，弃去上清。细胞沉淀用10ml含1×双抗的f12重悬，吹打4-5次将细胞团块吹散即可。用细胞计数仪计数，共得到角膜内皮细胞50万个。
(11)将角膜内皮细胞悬液1000rpm离心5min，弃去上清。
(12)取1个60mm的细胞培养皿，将配好的matrix加入培养皿中铺匀，室温静置10min，然后将培养皿内多余液体弃掉。
(13)将角膜内皮细胞沉淀用4mldf-k培养基重悬，接种于已coating过的60mm细胞培养皿中，命名为aen170524p0，细胞培养皿放入37℃5％co2细胞培养箱中培养；
(14)细胞观察与拍照记录：每天在显微镜下观察细胞的生长状态，并拍照记录。其间细胞状态部分如图4所示。6天后角膜内皮细胞密度达80％，如图5所示，需传代。
五、角膜内皮细胞的原代培养及传代培养
(1)弃掉培养皿中的旧培养液；用无菌的pbs洗一次去除残留的废旧培养液。
(2)向培养皿中加入2ml胰酶，于37℃培养箱中消化细胞。
(3)5min后显微镜下观察，发现角膜内皮细胞已脱落，加6ml含5％血清的dmem中和消化液。
(4)用移液管将角膜内皮细胞吹打几次，收集并转移到离心管中。
(5)将中和后得到的角膜内皮细胞悬液1000rpm离心5min，弃去上清。
(6)角膜内皮细胞沉淀用10ml含1×双抗的f12培养基重悬，吹打4-5次将细胞团块吹散即可。用细胞计数仪计数，共得到角膜内皮细胞240万。
(7)细胞传代：角膜上皮细胞悬液1000rpm离心5min，弃上清，加df-k培养基20ml重悬细胞，接种到2个t75的细胞培养瓶中，记为aen170524p1，120万/瓶。
(8)将传代的角膜内皮细胞培养瓶放入37℃5％co2细胞培养箱中培养。
4天后人角膜内皮细胞密度达80％，需传代并冻存角膜内皮细胞。
六、角膜内皮细胞的传代培养及冻存
(1)弃掉培养瓶中的旧培养液；用无菌的pbs洗一次去除残留的废旧培养液。
(2)向培养瓶中加入3ml胰酶，于37℃培养箱中消化细胞。
(3)5min后显微镜下观察，发现角膜内皮细胞已脱落，加7ml含5％血清的dmem中和消化液。
(4)用移液管将角膜内皮细胞吹打几次，收集并转移到离心管中。
(5)将中和后得到的角膜内皮细胞悬液1000rpm离心5min，弃去上清。
(6)角膜内皮细胞沉淀用10ml含1×双抗的f12培养基重悬，吹打4-5次将细胞团块吹散即可。用细胞计数仪计数，共得到角膜内皮细胞1000万。
(7)细胞传代：取200万角膜内皮细胞悬液1000rpm离心5min，弃上清，加df-k培养基20ml重悬细胞，接种到2个t75的细胞培养瓶中，记为aen170524p2，100万/瓶；余下800万角膜上皮细胞冻存4支，并编号为aen170524fp1200万/支。
(8)将传代的人角膜内皮细胞培养瓶放入37℃5％co2细胞培养箱中培养。
七、人造角膜上皮细胞层、前弹力层和基质层的培养
(1)为使细胞贴附紧密，6孔板提前用matrix(hesc-qualifiedmatrix人胚胎干细胞无血清培养基质)处理，1ml-2ml/孔。
(2)将角膜上皮细胞继续传代至第3代，记为aes170504p3，用于后续实验。
(3)利用第3代角膜上皮细胞做上皮细胞单片层。将收集到的aes170504p3用df-k培养基重悬，接种于6孔板中，150万/孔，3mldf-k培养基/孔。
(4)6孔板放入37℃5％co2细胞培养箱中培养，每天换液培养至细胞致密。
(5)用无菌的pbs配制dispase酶液，过滤除菌，并将酶液37℃预热。
(6)将6孔板中的废旧培养液弃掉，用无菌的pbs清洗2遍。每孔加入1.5mldispase酶液进行角膜上皮细胞单层片消化。
(7)显微镜下观察上皮细胞单层片消化状态，细胞松弛后弃掉dispase酶液，用无菌的pbs洗一遍。
(8)用无菌的白色枪头将角膜上皮细胞单层片揭下来。
(9)将消化下来的角膜上皮细胞单层片转移至transwell膜。
(10)将消化下来的6片角膜细胞单层片依次叠放在一起，转移到带transwell膜的新的6孔板中继续培养，形成上皮细胞层。
(11)向上皮细胞层的transwell中加入30-90mmⅰ型胶原纤维诱导因子培养液3ml，诱导角膜上皮细胞层的上皮细胞合成并分泌胶原纤维到细胞外形成紧致的致密层，进而形成前弹力层，诱导培养4天左右，每天换培养液。
(12)待前弹力层形成后加入含角朊硫酸盐、软骨素硫酸盐、dmem、f12、碳酸氢钠、腺嘌呤、eop、氢化可的松等成分的角化介质培养基3ml继续培养，并在前弹力层上加入200万角膜上皮细胞，培养10天左右即可形成角膜基质层，该层约占角膜厚度的90％。
八、人造角膜后弹力层与内皮细胞层的培养
(1)为使细胞贴附紧密，6孔板提前用matrix(hesc-qualifiedmatrix人胚胎干细胞无血清培养基质)处理，1ml-2ml/孔。
(2)将角膜内皮细胞继续传代至第3代，记为aen170524p3，用于后续实验。
(3)利用第3代角膜内皮细胞做内皮细胞单片层。将收集到的aen170524p3用df-k培养基重悬，接种于6孔板中的transwell膜上，150万/孔，3mldf-k培养基/孔。
(4)6孔板放入37℃5％co2细胞培养箱中培养，每天换液培养至细胞致密。
(5)待角膜内皮细胞在tranwell膜支架上培养成单层内皮细胞层后，培养基换成含有2％-15％血清和10-50mmⅰ胶原纤维诱导因子α的df-k培养基3ml，诱导培养内皮细胞产生胶原纤维构成后弹力层，诱导培养3天左右。
(6)将形成的后弹力层与角膜内皮细胞层转膜，转至步骤七中已形成的人造角膜的上皮细胞层、前弹力层和基质层这前三层膜上，使组织结构由下至上依次是上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮细胞层，df-k培养基中37℃5％co2细胞培养箱中继续培养3天。
九、人造角膜的透明培养
步骤(八)df-k培养基培养3天后，换成钙浓度为0.15-1.5mm的k-sfm培养基对人造角膜进行透明培养，培养4天后便在体外形成完整的人造角膜，人造角膜进行组织结构分析，如图6所示，显示其含有上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮细胞层五层结构，结果证实其结构与自体角膜结构一致。十、人造角膜的塑形
利用0.2％-8.0％聚甲基丙烯酸羟乙酯、1.0％-10％聚甲基丙烯酸甲酯和0.6％-2.0％硅凝胶对其塑形16h后，可以临床移植用于治疗因角膜疾病导致的失明。
实施例2.人自体角膜细胞制备人造角膜
收集受体在角膜疾病治疗过程中废弃的角膜，对其进行体外人角膜相关细胞扩增培养。从医院拿到的废弃的人角膜后，在实验室无菌超净工作台中先将角膜上皮细胞层、前弹力层及基质层一起与后弹力层和角膜内皮细胞分离开来。然后利用混合酶法分别把人角膜上皮细胞和角膜内皮细胞分离出来。分离过程采用现有技术即可。之后分别进行人角膜上皮细胞和人角膜内皮细胞的体外扩增培养。待人角膜上皮细胞和人角膜内皮细胞培养到第3代时便可以开始进行人源人造角膜的制备。该部分方法与实施例1相同。
利用第3代人角膜上皮细胞做人造角膜上皮细胞单片层，将收集到的人角膜上皮细胞用df-k培养基重悬，接种于6孔板中，6孔板放入37℃5％co2细胞培养箱中培养，每天换液培养至细胞致密。之后进行dispase酶液的配制，并将酶液在37℃水浴锅中进行预热。将6孔板中的废旧培养液弃掉，用无菌的pbs清洗2遍。加入dispase酶液进行人源角膜细胞单层片消化。将消化下来的6片人角膜细胞单层片叠放在一起，转移到带transwell的新的6孔板中继续培养。并向transwell中加入ⅰ型胶原纤维诱导因子培养液诱导人角膜上皮细胞层的上皮细胞合成并分泌胶原纤维至细胞外，并在细胞外形成紧致的致密层，进而形成前弹力层。待前弹力层形成后加入含角朊硫酸盐、软骨素硫酸盐、dmem、f12、碳酸氢钠、腺嘌呤、eop、氢化可的松等成分的角化介质培养基继续培养，并在前弹力层上加入约200万角膜上皮细胞，培养8天左右即可形成角膜基质层，约占角膜厚度的90％。与此同时进行人造角膜内皮细胞层的培养：利用第3代人角膜内皮细胞做人角膜内皮细胞单片层，将收集到的角膜内皮细胞用df-k培养基重悬，接种于6孔板中的transwell膜上，并将6孔板放入37℃5％co2细胞培养箱中培养，每天换液培养至细胞致密。待人角膜内皮细胞在膜支架上培养成单层内皮细胞层后，加入含有血清和胶原纤维诱导因子α的df-k培养基，诱导培养内皮细胞产生胶原纤维构成后弹力层。将后弹力层与角膜内皮细胞转膜，转至人造角膜的前三层膜上，37℃5％co2细胞培养箱中继续培养。df-k培养基培养3天左右换成含钙的k-sfm培养基对人源人造角膜进行透明培养，培养5天左右便可在体外形成完整的人造角膜。该部分方法与实施例1相同。
本发明方法可以成功制备人造角膜，可以预期将该人造角膜移植能治疗角膜疾病导致的失明。