本发明涉及一种软骨修复用复合多孔支架材料的制备方法，属于生物医用材料领域。
背景技术：
关节软骨是软骨之间的结合部分，由特异的细胞外基质包绕稀少的软骨细胞形成，具有复杂的生物力学特征和高度的耐用性，然而其自身修复能力有限，自然退变或创伤引起的缺损会导致其结构与功能上不可逆的损害。这主要是因为关节软骨中没有血供，且软骨细胞缺乏迁移能力，无法移动到损伤部位参与修复，且缺乏细胞分化所必须的母细胞及细胞迁移所必须的理想环境，因此软骨缺损难以自然修复。
目前临床上用于软骨损伤治疗的方法主要有微骨折术、软骨下骨钻孔术、软骨下骨磨削术、自体软骨移植和自体软骨细胞移植术等。然而，研究结果表明，这些方法只能暂时缓解疼痛等症状，最终结局还是修复部位的软骨退化或者坏死。随着组织工程技术的兴起，软骨缺损的修复已经有了一定的研究进展。
骨及软骨组织工程包括3个关键因素：生长因子、支架材料和种子细胞。其中支架材料的选择是骨及软骨组织工程的核心问题，而应用于临床是其最终目的，因此，理想的软骨支架材料应具备以下条件：
目前，骨及软骨组织工程支架材料主要分为三类：生物衍生材料、无机材料和高分子材料。天然衍生材料主要有胶原、几丁质、藻酸盐、纤维蛋白等，这类材料能促进细胞黏附、增殖并分泌基质，生物相容性好，但不易大规模生产并缺乏强度。无机材料主要是生物陶瓷类和生物活性玻璃。生物陶瓷主要有硫酸钙陶瓷、碳酸钙陶瓷、磷酸钙陶瓷及其同分异构体。以羟基磷灰石为代表的磷酸钙陶瓷是广泛应用的骨替代材料之一，它们都具有良好的生物相容性、生物降解性、骨传导性。但存在脆性大，柔韧性不够，在体内降解困难，影响了新骨的长入和后期改建等问题。以聚乳酸、聚羟基乙酸及其共聚物等为代表的高分子材料应用非常广泛。这类生物高分子材料具有良好的生物可降解性、生物相容性、安全无毒性及一定的力学性能，通过模塑、挤压、溶剂浇铸等技术可加工成各种结构形状。可根据需要制成纤维支架、多孔泡沫及管状结构等，从而使新生的骨组织具有理想的形态。然而，目前骨组织工程支架材料众多，每种支架材料各有其优缺点，现有的支架材料仅能达到理想支架材料要求的一部分，随着研究的不断深入，复合支架材料成为目前的研究热点之一。
聚乙烯醇（pva）是一种常见的分子结构规整，分子链柔顺的水溶性高分子,具有半结晶结构的白色的粉末状树脂。医用级聚乙烯醇对人体无毒，无副作用，并具有良好的弹性、亲水性和生物相容性，已广泛应用于软骨组织工程。
硫酸软骨素（cs）是一种由n-乙酰半乳糖胺和葡萄糖醛酸组成的硫酸化糖胺聚糖（gag），由于其抗炎，抗氧化和抗凋亡作用，数十年来被广泛用作骨关节炎的膳食补充剂。硫酸软骨素是许多结缔组织，特别是皮肤，骨骼，滑液和软骨的细胞外基质的主要成分，在医学上主要用于治疗关节疾病，具有止痛，促进软骨再生的功效，可以从根本上改善关节问题。
技术实现要素：
本发明提供一种软骨修复用复合多孔支架材料的制备方法，将天然高分子硫酸软骨素与人工合成高分子聚乙烯醇共混，并采用戊二醛的乙醇溶液接收纺丝纤维，通过静电纺丝技术制备具有1~20微米大孔的纳米纤维支架材料，其中聚乙烯醇含量为60%~90%，硫酸软骨素含量为10~40%，另外含结合水0.1%~2%。
一种软骨修复用复合多孔支架材料的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）在80℃~100℃下，按照聚乙烯醇与去离子水的质量体积比g:ml为5~10:100的比例，将聚乙烯醇溶于去离子水中，磁力搅拌2h~3h，记为a液；
（2）在室温下，按照硫酸软骨素与乙酸水溶液质量体积比g:ml为1~3:100的比例，将硫酸软骨素溶于体积浓度为4%~6%的乙酸水溶液中，记为b液；
（3）将a液和b液按照体积比为（1~3）:1混合，在室温下磁力搅拌2~3h，配制成纺丝液；
（4）采用真空干燥器对步骤（3）所得的纺丝液进行负压脱泡处理；
（5）采用戊二醛的乙醇溶液作为液体接收器，电源正极接针头处，负极接钢板，钢板设置在液体接收器底部，取步骤（4）所得的纺丝液进行静电纺丝得到纺丝纤维，纺丝纤维在液体接收器中静置2h后取出，水洗后冷冻干燥，得到软骨修复用复合多孔支架材料。
步骤（4）所述负压脱泡的条件为：在400~760mm汞柱的负压下脱泡10~20h。
步骤（5）所述戊二醛的乙醇溶液是戊二醛与乙醇按照体积比为1:99~249，将戊二醛和乙醇进行混合得到，所述戊二醛为质量分数25%戊二醛水溶液。
步骤（5）所述静电纺丝条件为：所用针头为17~20号，纺丝液的推进速度为0.1~0.2mm/min，正电压为16~20kv，针头与接收装置的距离为10~20cm。
步骤（5）所述冷冻干燥是在-35℃~-40℃干燥1~5h。
本发明的有益效果：
（1）本发明所用原料聚乙烯醇、硫酸软骨素均无细胞毒性，具有良好的生物相容性，并且通过改变两者之间的的配比，使静电纺丝的成丝性可调。
（2）本发明通过改变静电纺丝相关参数，能较好地控制纤维质量及纤维直径分布，且该结构适合细胞黏附生长以及营养物质运输。
（3）本发明所述方法制备得到的软骨修复支架厚度可调，通过纺丝时间即可实现。
（4）本发明采用戊二醛的乙醇溶液接收纺丝纤维，能实现边纺丝边交联，同时所得支架的耐水性提高。
附图说明
图1是本发明实施例2得到的软骨修复用复合多孔支架材料的显微形貌图；
图2是本发明实施例3得到的软骨修复用复合多孔支架材料的显微形貌图；
图3是本发明实施例3得到的软骨修复用复合多孔支架材料的红外光谱图；
图4是本发明实施例4得到的软骨修复用复合多孔支架材料的显微形貌图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。
实施例1
本实施例一种软骨修复用复合多孔支架材料的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）在80℃下，将1.5g聚乙烯醇溶于30ml去离子水中，磁力搅拌2h，配置成5%聚乙烯醇溶液，记为a液；
（2）将1ml冰乙酸加入24ml去离子水中，配制成4%的乙酸水溶液，在室温下将0.25g硫酸软骨素溶于该乙酸水溶液中，配置成1%硫酸软骨素的乙酸溶液，记为b液；
（3）将上述a、b溶液按照体积比为1:1混合，在室温下磁力搅拌2h，配制成共混静电纺丝液；
（4）采用真空干燥器对步骤（3）所得的纺丝液在400mm汞柱的负压下脱泡10h；
（5）将1ml25%戊二醛溶液加入249ml乙醇中作为液体接收器，采用17号针头，设定正电压为16kv，纺丝液的推注速度为0.1mm/min，针头与接收装置的距离为10cm，电源正极接针头处，负极接钢板，钢板设置在液体接收器底部，取步骤（4）所得的纺丝液进行静电纺丝，得到纺丝纤维，纺丝纤维在液体接收器中静置2h后取出，水洗3次后-35℃冷冻干燥5h，得到软骨修复用复合多孔支架材料。
本实施例得到的软骨修复用复合多孔支架材料纤维丝的直径分布在200~500nm，交联度为40%，拉伸强度为5.2mpa，细胞毒性为0级，即无细胞毒性。
实施例2
本实施例一种软骨修复用复合多孔支架材料的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）在85℃下，将2.4g聚乙烯醇溶于30ml去离子水中，磁力搅拌2h，配置成8%聚乙烯醇溶液，记为a液；
（2）将1ml冰乙酸加入19ml去离子水中，配制成5%的乙酸水溶液，在室温下将0.4g硫酸软骨素溶于该乙酸水溶液中，配置成2%硫酸软骨素的乙酸溶液，记为b液；
（3）将上述a、b溶液按照体积比为2:1混合，在室温下磁力搅拌2h，配制成共混静电纺丝液；
（4）采用真空干燥器对步骤（3）所得的纺丝液在560mm的汞柱的负压下脱泡15h；
（5）将1ml25%戊二醛溶液加入166ml乙醇中作为液体接收器，采用18号针头，设定正电压为18kv，纺丝液的推注速度为0.15mm/min，针头与接收装置的距离为15cm，电源正极接针头处，负极接钢板，钢板设置在液体接收器底部，取步骤（4）所得的纺丝液进行静电纺丝，得到纺丝纤维，纺丝纤维在液体接收器中静置2h后取出，水洗3次后-40℃冷冻干燥1h，得到软骨修复用复合多孔支架材料。
如图1所示，本实施例得到的软骨修复用复合多孔支架材料纤维丝的直径分布在150~400nm，交联度为47%，拉伸强度为6.5mpa，细胞毒性为0级，即无细胞毒性。
实施例3
本实施例一种软骨修复用复合多孔支架材料的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）在95℃下，将2.4g聚乙烯醇溶于30ml去离子水中，磁力搅拌3h，配置成8%聚乙烯醇溶液，记为a液；
（2）将1ml冰乙酸加入19ml去离子水中，配制成5%的乙酸水溶液，在室温下将0.4g硫酸软骨素溶于该乙酸水溶液中，配置成2%硫酸软骨素的乙酸溶液，记为b液；
（3）将上述a、b溶液按照体积比为3:1混合，在室温下磁力搅拌3h，配制成共混静电纺丝液；
（4）采用真空干燥器对步骤（3）所得的纺丝液在560mm的汞柱的负压下脱泡20h；
（5）将1ml25%戊二醛溶液加入124ml乙醇中作为液体接收器，采用19号针头，设定正电压为16kv，纺丝液的推注速度为0.20mm/min，针头与接收装置的距离为20cm，电源正极接针头处，负极接钢板，钢板设置在液体接收器底部，取步骤（4）所得的纺丝液进行静电纺丝，得到纺丝纤维，纺丝纤维在液体接收器中静置2h后取出，水洗3次后-36℃冷冻干燥3h，得到软骨修复用复合多孔支架材料。
如图2所示，本实施例得到的软骨修复用复合多孔支架材料纤维丝的直径分布在200~500nm，交联度为50%，拉伸强度为5.5mpa，细胞毒性为0级，即无细胞毒性，图3为红外光谱图，分析可知，软骨修复用复合多孔支架材料与pva的红外谱图相比没有发生明显的偏移，说明静电纺丝对pva的性质影响不大，而共混后cs的特征峰移动较大，这可能是由于静电纺丝过程中发生了分子链的缠结。
实施例4
本实施例一种软骨修复用复合多孔支架材料的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）在95℃下，将2.4g聚乙烯醇溶于30ml去离子水中，磁力搅拌3h，配置成8%聚乙烯醇溶液，记为a液；
（2）将1ml冰乙酸加入19ml去离子水中，配制成5%的乙酸水溶液，在室温下将0.4g硫酸软骨素溶于该乙酸水溶液中，配置成2%硫酸软骨素的乙酸溶液，记为b液；
（3）将上述a、b溶液按照体积比为3:1混合，在室温下磁力搅拌3h，配制成共混静电纺丝液；
（4）采用真空干燥器对步骤（3）所得的纺丝液在760mm的汞柱的负压下脱泡20h；
（5）将1ml25%戊二醛溶液加入99ml乙醇中作为液体接收器，采用19号针头，设定正电压为20kv，纺丝液的推注速度为0.20mm/min，针头与接收装置的距离为20cm，电源正极接针头处，负极接钢板，钢板设置在液体接收器底部，取步骤（4）所得的纺丝液进行静电纺丝，得到纺丝纤维，纺丝纤维在液体接收器中静置2h后取出，水洗3次后-38℃冷冻干燥2h，得到软骨修复用复合多孔支架材料。
如图4所示，本实施例得到的软骨修复用复合多孔支架材料纤维丝的直径分布在400~700nm，交联度为53%，拉伸强度为6.8mpa，细胞毒性为0级，即无细胞毒性。
实施例5
本实施例一种软骨修复用复合多孔支架材料的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）在100℃下，将3g聚乙烯醇溶于30ml去离子水中，磁力搅拌3h，配置成10%聚乙烯醇溶液，记为a液；
（2）将3ml冰乙酸加入47ml去离子水中，配制成6%的乙酸水溶液，在室温下将1.5g硫酸软骨素溶于该乙酸水溶液中，配置成3%硫酸软骨素的乙酸溶液，记为b液；
（3）将上述a、b溶液按照体积比为3:1混合，在室温下磁力搅拌3h，配制成共混静电纺丝液；
（4）采用真空干燥器对步骤（3）所得的纺丝液在560mm的汞柱的负压下脱泡20h；
（5）将1ml25%戊二醛溶液加入99ml乙醇中作为液体接收器，采用20号针头，设定正电压为20kv，推注速度为0.20mm/min，针头与接收装置的距离为20cm，电源正极接针头处，负极接钢板，钢板设置在液体接收器底部，取步骤（4）所得的纺丝液进行静电纺丝，得到纺丝纤维，纺丝纤维在液体接收器中静置2h后取出，水洗3次后-40℃冷冻干燥2h，得到软骨修复用复合多孔支架材料。
本实施例得到的软骨修复用复合多孔支架材料纤维丝的直径分布在200~500nm，交联度为54%，拉伸强度为7.0mpa，细胞毒性为0级，即无细胞毒性。