一种神经管畸形模型的构建方法及应用与流程

本发明涉及动物模型构建技术领域，具体涉及一种神经管畸形模型的构建方法及应用。

背景技术

神经管畸形(neuraltubedefects，ntds)是一种严重的中枢神经系统的先天性畸形，在我国北方，尤其是在山西省发生率可高达10.2‰。神经管畸形的病因复杂，多项研究表明神经管畸形是由基因与环境因素因素相互作用引起的，如环境、营养、代谢、有机溶剂等与神经管畸形的发生息息相关。多项研究发现，叶酸代谢异常引起的高同型半胱氨酸(homocysteine，hcy)水平升高是引起出生缺陷的重要危险因素之一，而高同型半胱氨酸导致神经管畸形的机制目前尚不明确。

同型半胱氨酸是甲硫氨酸代谢的中间产物，主要通过两条途径进行代谢，约一半的同型半胱氨酸通过甲基化途径(甲硫氨酸循环)重新合成甲硫氨酸；约另一半的同型半胱氨酸经胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase，cbs)的催化生成半胱氨酸。当体内同型半胱氨酸水平升高后，可在氨基酰-trna合成酶(metrs)的编辑或矫正过程中，形成结构更加稳定的同型半胱氨酸硫代内酯(htl)，同型半胱氨酸及其衍生物的聚积，对发育中的神经管具有毒性。既往的研究表明，高同型半胱氨酸有胚胎毒性并可诱导鸡胚产生神经管畸形。同型半胱氨酸卵黄微量注射(注射体积为50μl，剂量范围为0.125～16μmol)，可观察到神经管畸形的产生，并与剂量呈正相关，且补充叶酸使神经管畸形发生率显著下降。同时也有研究表明在鸡胚发育第2天(e2)用20μmold-lhcy滴加在胚胎内膜上会造成神经管畸形的发生，还有研究表明在鸡胚发育的早期应用20μmol同型半胱氨酸硫代内酯(homocysteinethiolactone，htl)滴加在卵黄膜上也可使鸡胚产生神经管畸形，在8+/9阶段的神经管畸形的发生率为24％。

目前，本领域技术人员致力于构建一种具有高胚胎致畸率、同时具有高存活率的神经管畸形模型，以期用于研究高同型半胱氨酸导致神经管畸形的发病机制。

技术实现要素：

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种神经管畸形模型的构建方法及应用。其技术方案如下：

本发明在第一方面提供了一种神经管畸形模型的构建方法，包括以下步骤：

步骤1、收集经人工授精的鸡蛋，清洁后放入孵化器中进行孵育；

步骤2、将鸡蛋孵育至鸡胚的神经板开始闭合后，采用鸡胚神经沟注射方法向鸡蛋内注射同型半胱氨酸硫代内酯；

步骤3、将处理后的鸡蛋继续孵化，观察鸡胚的表型，筛选出成功的神经管畸形模型。

在一个较优实施例中，上述鸡蛋采用白来航种鸡鸡蛋。

优选地，上述步骤1中的孵育条件为：孵化温度38℃，相对湿度55-65％，90°转角，30分钟间隔自动翻蛋。

优选地，上述步骤2中，注射同型半胱氨酸硫代内酯的具体时间为鸡蛋孵化28h时。

优选地，上述步骤2中，同型半胱氨酸硫代内酯的浓度为0.5mm，注射体积优选为5μl。

优选地，上述步骤2中，鸡胚神经沟注射方法具体为在体视显微镜下用显微注射器将同型半胱氨酸硫代内酯药液缓慢注射到鸡胚神经沟中。

在一个较优实施例中，上述同型半胱氨酸硫代内酯药液于药物处理前1h配制，将同型半胱氨酸硫代内酯溶于台式液(tyrodebuffer)中，并加入适量酚红，充分混匀待用。台式液的成分为：1mm葡萄糖，3.5mm氯化钾，100mm氯化钠，0.02mm磷酸二氢钠和12mm碳酸氢钠。

优选地，上述步骤3中，在神经管闭合后的e5时取鸡胚观察表型。

本发明在另一方面还提供了上述构建方法在研究高同型半胱氨酸导致神经管畸形的发病机制中的应用。

采用本发明提供的神经管畸形模型构建方法，神经系统的畸形率达50％，胚胎的存活率高达87.5％，是目前最佳的观察神经管畸形的造模方法。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。所以凡是不脱离本发明所公开的原理下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。

以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。

附图说明

图1示出了本发明较优实施例中使用0.5mm同型半胱氨酸硫代内酯神经沟注射鸡胚的结果图；

图2示出了本发明较优实施例中的鸡胚神经管发育关键时间点图；

图3示出了本发明较优实施例中使用0.5mm同型半胱氨酸硫代内酯神经沟注射鸡胚在不同发育时期胚胎的形态。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

本实施例中主要采用了以下材料：

白色莱杭鸡种蛋(中国农业大学小牧场，中国)；同型半胱氨酸硫内酯(l-homocysteinethiolactonehydrochloride，sigma，usa)；台式液(tyrodebuffer)；酚红(北京化工厂)；孵化器(日本showafuranki公司)。主要仪器有光学和解剖显微镜、全自动孵化箱、微量注射器、牙钻机及开蛋器等。

神经管畸形动物模型的具体制备方法如下：

收集经人工授精的白来航种鸡鸡蛋，选取表面光滑，形状椭圆，大小适中的种蛋用清水洗去表面的粘液和粪便，并用0.1％新洁尔灭清洗后放入孵化器中进行孵育，孵育条件为孵化温度38℃，相对湿度55-65％，90°转角，30分钟间隔自动翻蛋，继续孵化，此时记为e0。将孵化约27h的鸡种蛋取出用酒精棉擦拭表面消毒后,上下轻轻晃动使胚胎脱离内层壳膜，于种蛋赤道部近钝端处标记开孔，使用牙科钻在标记点附近磨去直径约3-4mm左右的蛋壳，使用镊子小心揭去蛋壳膜，暴露胚胎。镜下检出活胚，弃除未受精及未发育蛋后将种蛋80枚随机分为10组，(a)、正常对照组和9个实验组：(b)、10μmolhtl胚胎滴注，(c)、20μmolhtl胚胎滴注，(d)、40μmolhtl胚胎滴注，(e)、10μmolhtl胚盘注射，(f)、20μmolhtl胚盘注射，(g)、40μmolhtl胚盘注射，(h)、0.1mmhtl神经沟注射，(i)、0.5mmhtl神经沟注射，(j)、1mmhtl神经沟注射。胚胎滴注方法为将htl药液通过蛋孔滴加到胚胎表面。胚盘注射为用穿刺针将htl药液注入到胚盘下腔中。神经沟注射方法为发明人首次使用，由于鸡胚的神经板从27h开始闭合，所以发明人选择在种蛋孵化28h时注射药物，神经管闭合后的e5观察表型。具体操作为在体视显微镜下用显微注射器将htl药液缓慢注射到鸡胚神经沟中，因溶液颜色呈淡红色，故注射时可于注射后观察到胚胎神经沟浸泡于药液之中。对照组不作药物处理，观察到活胚后即用封口薄膜封闭开口，标记。然后将处理过的种蛋放回孵化器，钝端向上，继续孵化。药物处理前1h配制不同浓度的htl溶液，将htl溶于台式液中，并加入适量酚红，充分混匀。在神经管闭合后的e5时取胚胎，观察胚胎的表型并记录。在本实施例中，各剂量组的最小样本数为至少8个受精蛋，在其他实施例中，对有意义的剂量组及胚胎神经管发育的不同时期e2、e3、e5、e8扩大样本量进一步验证实验结果。

为了探索不同htl处理方法对鸡胚神经管畸形发生的影响，发明人使用了胚胎滴注、胚盘注射和神经沟注射三种方法处理孵化28h的鸡胚，在注射后第三天(e5)取样观察胚胎。结果如表1所示，三种方法中，胚胎滴注法的胚胎存活率较高，但神经管畸形率较低。低浓度对神经管发育几乎没有影响，随着浓度增加，神经系统畸形率可达25％。胚盘注射法比胚胎滴注法致畸率增加，且神经系统的畸形率增加至37.5％，但随着注射浓度的提高，胚胎的存活率下降至62.5％，且致畸率增加，但是神经系统的畸形率增加并不明显。采用神经沟注射的胚胎致畸率明显增加，且神经系统的畸形率更加明显。浓度在0.5mm时胚胎的存活率高达87.5％，且神经系统的畸形率达50％，是迄今为止最佳的胚胎处理方法。

表1、三种不同htl方法e5鸡胚存活率和致畸率的比较

在鸡胚动物模型研究中，处理方法多为蛋壳内膜滴注和卵黄微量注射及卵黄膜滴注。这些处理方法都是利用鸡胚的营养吸收器官卵黄囊的作用，使药物间接作用于胚胎。胚胎滴注药物滴加在细胞清中，药物经过扩散后与胚胎细胞接触，药物浓度较低，导致畸形并不明显。胚盘注射时药物注射在胚盘下腔，有更多的药物作用于早期胚胎细胞，胚胎受影响较大，存活率较低，伴非神经系统畸形增加。htl神经沟注射，操作更精细，药物作用部位更准确，htl可直接作用于胚胎的神经管，对神经管发育的影响更直接。e5的神经管畸形率可达到41.5％，较胚胎滴注和胚盘注射的畸形率更明显。从表1中可以看出神经沟注射的最佳注射浓度为0.5mm，在该浓度神经系统畸形率较高且胚胎的存活率也处在较高水平。

实施例2

为了探索0.5mmhtl神经沟注射对鸡胚神经管畸形的影响，发明人扩大样本量进行0.5mmhtl神经沟注射，注射体积为5μl，对照组注射含酚红的台式液，注射结果如图1所示。根据如图2所示的神经管发育的关键时间点，在神经管闭合前的e2、神经管闭合后的e3、e5和e8取胚胎进行观察。

在胚胎发育的e2时，胚胎的畸形率为59.1％，出现脑发育异常和神经沟闭合异常表型，部分胚胎伴有躯体形态异常。e3时，脑发育明显异常，畸形率为50％，出现了脊柱裂、短尾畸形及体节发育异常，死胎率为9.09％。在e5时，胚胎畸形率为56.6％，主要出现脑发育不良，畸形率高达32％，也出现了脊柱裂短尾畸形等异常表型。e8时，畸形率为50％，出现了脑发育异常及脊柱裂，具体情况见表2。由图3可见，在e2时可看到神经管出现三处异常膨大(三个箭头所指)，e3时脑部整体发育异常，中脑和后脑明显偏小伴末脑缺失。e5脑部整体发育畸形，中脑部未充盈形成正常脑泡伴后脑末脑缺失。e8出现明显的脊柱裂。

表2、0.5mmhtl神经沟注射不同发育时期的表型及其发生率

根据胚胎的发育情况，发明人总结出2-5d是神经管形成的关键时期，第27h时神经管开始闭合，第33h时，神经前孔已闭合，55h时神经管已完全闭合。本发明在28h时神经沟注射htl，药物会直接影响神经管的形成，在神经管闭合前后出现异常表型，在e2、e3、e5和e8时期都观察到了不同的神经管畸形。

本发明首次采用精准的鸡胚神经沟注射方法，实验结果表明htl神经沟注射这种新的处理方法可以有效地诱导鸡胚神经管缺陷的发生，弥补了现有处理方法胚胎死亡率高和神经系统畸形率低的问题，可用于研究高同型半胱氨酸导致神经管畸形的发病机制，具有重要的应用价值。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。