本发明属于药物制剂领域，特别涉及一种聚合离子液体(pil)和聚电解质(paa)包裹修饰的氧化石墨烯(go)载药及其制备方法。
背景技术：
氧化石墨烯(go)是由单层碳原子以sp2杂化形式存在的二维(2d)蜂窝状晶格结构口，其表面具有羟基、羧基和环氧基团以及大量的含氧极性基团，是亲水性材料，表面改性的go可在高盐溶液和生理溶液中稳定。go结构中的碳原子与药物结构形成稳定的化学键，所以通过π-π共轭和疏水相互作用可以吸附大量的生物活性分子。go及其衍生物作为载体转运如酶、蛋白和药物等正处在研究热点。然而，go在盐溶液和生理溶液中很容易絮凝而聚集。因此，迫切需要通过功能化修饰，得到在生理溶液中能够稳定存在的氧化石墨烯载药体系。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种聚合离子液体和聚电解质修饰的氧化石墨烯载药体系及其制备方法，该方法操作简单，反应条件温和。复合载药材料载药量高，稳定性好，具有缓释和ph敏感的释放特性。
本发明采用如下技术方案：一种修饰的氧化石墨烯载药递送体系，所述修饰的氧化石墨烯载药递送体系，是以氧化石墨烯为载体负载药物x获得氧化石墨烯复合物go-x，在氧化石墨烯复合物go-x的表面层层包裹带正电荷的聚合离子液体pil和带负电荷的聚丙烯酸paa制得的paa-pil/go-x。
优选的，所述的药物x包括但不限于阿霉素(dox)或紫杉醇(ptx)或莪术醇(cur)。
优选的，所述的聚合离子液体pil为聚1-乙烯基-3-乙基咪唑溴盐、聚1-烯丙基-3-乙基咪唑溴盐、聚1-乙烯基-3-丁基咪唑溴盐或聚1-乙烯基-3-乙基咪唑氯盐。更优选的，所述的聚合离子液体pil为聚1-乙烯基-3-乙基咪唑溴盐。
一种修饰的氧化石墨烯载药递送体系的制备方法，包括如下步骤：
1)搅拌下，将药物x溶于溶剂中，并缓慢滴加到氧化石墨烯go的水溶液中，通过超声将药物x负载到氧化石墨烯go上；离心，沉淀物用溶剂洗涤，冻干，得氧化石墨烯复合物go-x。
优选的，按质量比，药物x:go＝1:0.2～1:5；更优选的，药物x:go＝1:0.5。
优选的，溶剂为水、甲醇、乙醇或dmso。
优选的，超声时间为5-60min，更优选的，超声时间为30min。
2)将go-x复溶后，在缓慢搅拌下滴加到45℃的聚合离子液体pil溶液中，混合均匀后，搅拌反应，按质量比，获得pil/go-x。
优选的，go:pil＝1:1～1:20。更优选的，go:pil＝1:16。
优选的，所述的搅拌反应为：遮光，100rpm，搅拌0.1～5h。
3)搅拌下，将聚丙烯酸paa溶液滴加到pil/go-x溶液中，于45-70℃下，加热搅拌反应1h，之后室温反应12h，得到paa-pil/go-x。
优选的，go:paa＝1:1～1:20。更优选的，go:paa＝1:16
上述的一种修饰的氧化石墨烯载药递送体系paa-pil/go-x在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的有益效果是：
1、聚合离子液体(polymericionicliquid，pil)由离子液体单体聚合而成，是一类兼具离子液体与聚合物的优点的新型功能高分子物质，具有比普通离子液体更高的热稳定性和更多吸附位点。本发明，将聚合离子液体与石墨烯复合，增加了石墨烯的亲水性和分散性，得到稳定性更高的复合物，同时能避免石墨烯由于π-π电子堆积作用和范德华力作用而团聚的现象。石墨烯与聚合离子液体相结合，赋予了石墨烯良好的，增加在生理溶液中的溶解度和稳定性。
聚电解质(paa)是一种十分有效的肠道吸收促进剂。其作用机制可能是其阳离子部分与细胞表面的糖蛋白阴离子部分相互作用，或与上皮紧密连接内部的负电荷区相互作用，导致紧密连接蛋白的结构重组而打开紧密连接。聚电解质具有毒性小、酶活性抑制强的黏膜黏附能力、口服后不易被消化道吸收、能长时间发挥吸收促进作用等特点。
2、本发明，以氧化石墨烯(go)为药物载体，依靠π-π共轭吸附作用，将抗癌药物非共价键吸附于go表面，不改变其原有物理化学及生物学性质，go巨大的比表面积能显著提高药物的载药率。
3、本发明，利用层层自主装技术，在go表面分别包裹带正电荷的pil和带负电荷的paa，最终得到paa-pil/go-x。可以保护药物在消化道内的被降解和破坏，稳定性好。能够延缓药物的释放速率，长效释放，提高药物的生物利用度。
4、本发明，药物具有ph敏感的释放特性，paa和pil的双层包裹使药物在胃中稳定，在肠道中释放，使药物的耐酸能力得到了改善，有利于药物的吸收，提高了药物的靶向性，从而增强了其生物利用度。
因此，采用pil和paa层层包裹的方式修饰的氧化石墨烯载药体系，具有水溶性好，稳定性强，有ph敏感的释放特性。可以使药物在胃中稳定，在肠道中释放，增加药物的吸收效果，提高生物利用度，从而增强其抗肿瘤疗效。
附图说明
图1为实施例1中dox紫外扫描图谱。
图2为实施例1中dox标准曲线。
图3为实施例1中paa-pil/go-dox的粒径分布图。
图4为实施例1中paa-pil/go-dox的zeta电位图。
图5为实施例1中paa-pil/go-dox的透射电镜图。
图6为实施例2中paa-pil/go-dox与go-dox的药物体外累积释放曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进一步阐述，但需要指出的是，本发明的保护范围不应受这些实施例的任何限制。
实施例1一种修饰的氧化石墨烯载药递送体系paa-pil/go-dox
(一)制备氧化石墨烯复合物go-dox
1、方法如下：
1)称取50mg的氧化石墨烯go于烧杯中，加入100ml纯净水，通过超声使其充分溶解。
2)称取10mgdox加入到盛有10ml蒸馏水的烧杯中溶解。
3)在磁力搅拌的条件下，将dox的水溶液缓慢滴加到go的水溶液中，通过超声将药物负载到氧化石墨烯go上。
4)用高速离心机在10000rpm下高速离心20min，除去游离的dox。反复用纯净水洗涤沉淀后，再次离心。收集下层沉淀物，沉淀物加水复溶，得到go-dox。
2、包封率的计算
go-dox载药体系的包封率，采用紫外色谱法测定药物含量。
1)dox检测波长的确定
称取dox对照品适量并溶于蒸馏水中，在300nm-800nm区间使用紫外分光光度计对其进行全波长扫描，记录紫外吸收光谱如图1所示。由紫外光谱图可知，dox在480nm处有最大吸收，考虑到空白材料在此处无吸收，因此选用波长480nm作为dox的检测波长。
2)dox标准曲线的建立
精密称取dox对照品25mg适量于500ml容量瓶中，加入ph7.4的pbs缓冲液定容至刻度线，制备成浓度为50μg/ml的母液。将上述母液用pbs逐渐稀释浓度分别为5μg/ml，10μg/ml，15μg/ml，20μg/ml，25μg/ml，50μg/ml的系列标准溶液，以pbs为空白对照在480nm处测定吸光值。dox标准曲线的回归方程为：y＝0.0159x+0.0191(x为浓度，y为吸光度，相关系数r＝0.9996)，标准曲线见图2。在5-50μg/ml范围内，dox浓度与吸光度具有良好的线性关系。
3)包封率测定：取已知体积的上清液置于25ml容量瓶中，加水至刻度线，并取1ml置于10ml的ep管中待测定。在1)的紫外色谱条件下进行测定，记录数据，并代入2)标准曲线公式，计算出的上清液的药物浓度为c1，总药量则为c0。包封率按照如下公式计算。
包封率(ee)＝(c0-c1)/c0×100％
3、go-dox的处方工艺考察
以包封率为考察指标，将go-dox的制备过程进行优化筛选。通过单因素考察(超声时间和药质比)来确定载药试验的最佳处方工艺。
1)超声时间对包封率的影响
如表1改变制备方法中步骤3)的超声时间，并分别做4批次。在试验的超声环节，通过选择不同的超声时间，分别为(5min，15min，30min和60min)。超声结束后将各溶液以10000rpm离心20min，取上清液并测定其药物含量以计算试验包封率。其包封率结果如表1。
表1超声时间对药物包封率的影响
由表1可知，超声时间对于载药的包封率有显著的影响，超声时间为30min时，达到最大包封率，因此选用超声时间为30min。
2)药物/载体比例对包封率的影响
如表2改变dox和go的质量比，并分别做4批次。在试验的投料环节，通过选择不同的药物/载体比例分别为(1:2，1:1，1:0.5，1:0.2)。超声30min，将各溶液以10000rpm离心20min，取上清液并测定其药物含量，并计算包封率。其包封率结果如表2。
表2药质比对药物的包封率和载药量的影响
由表2可见，按质量比，药物:载体＝1:0.5时，包封率为87.58％，达到良好的载药效果，故选择药物与载体的质量比为1:0.5为最佳处方工艺。
(二)制备pil/go-dox
制备方法包括如下步骤：将go-dox加水复溶后，在缓慢搅拌下滴加到45℃的pil溶液中，混合均匀后，超声反应，将pil与go通过电荷相互吸引结合。反应结束后离心、洗涤、干燥，得pil/go-dox。
考察不同反应条件对制备pil/go-dox的影响，筛选最优处方工艺。
1、pil与go质量比的影响
作为筛选的，体积相同情况下，go-dox溶液浓度1mg/ml，pil(聚1-乙烯基-3-乙基咪唑溴盐溶液)浓度分别为1mg/ml、5mg/ml、16mg/ml。比较不同的pil与go质量比对复合材料的影响，如表3。
表3质量比对pil/go-dox的影响
由表3可见，最优选的，pil与go质量比为，pil:go(m:m)＝16:1。
2、聚合离子液体(pil)种类对pil/go-dox的影响
(1)取100mlgo-dox溶液(1mg/ml)，在100rpm搅拌下，滴加到45℃的100ml聚1-乙烯基-3-乙基咪唑溴盐溶液(16mg/ml)中，遮光，超声反应20min和100rpm搅拌反应3h；反应完成后，10000离心5min、纯水洗涤后重复离心、干燥获得所述的pil/go-dox。
(2)取100mlgo-dox溶液(1mg/ml)，在100rpm搅拌下，滴加到45℃的100ml聚1-烯丙基-3-乙基咪唑溴盐溶液(16mg/ml)中，遮光，超声反应20min和100rpm搅拌反应3h；反应完成后，10000离心5min、纯水洗涤后重复离心、干燥获得所述的pil/go-dox。
(3)取100mlgo-dox溶液(1mg/ml)，在100rpm搅拌下，滴加到45℃的100ml聚1-乙烯基-3-丁基咪唑溴盐(16mg/ml)中，遮光，超声反应20min和100rpm搅拌反应3h；反应完成后，10000离心5min、纯水洗涤后重复离心、干燥获得所述的pil/go-dox。
(4)取100mlgo-dox溶液(1mg/ml)，在100rpm搅拌下，滴加到45℃的100ml聚1-乙烯基-3-乙基咪唑氯盐(16mg/ml)中，遮光，超声反应20min和100rpm搅拌反应3h；反应完成后，10000离心5min、纯水洗涤后重复离心、干燥获得所述的pil/go-dox。
表4不同离子液体的影响
由表4可见，综合比较(1)～(4)中pil/go-dox的性状，最为优选的是(1)聚1-乙烯基-3-乙基咪唑溴盐溶液制备的pil/go-dox。
(三)制备paa-pil/go-dox
1、制备方法，包括如下步骤：
1)称取5mg的氧化石墨烯go于烧杯中，加入100ml纯净水，通过超声使其充分溶解。
2)称取10mgdox加入到盛有10ml蒸馏水的烧杯中溶解。
3)在磁力搅拌的条件下，将dox的水溶液缓慢滴加到go的水溶液中，超声30min，将药物负载到氧化石墨烯go上。
4)用高速离心机在10000rpm下高速离心20min，除去游离的dox。反复用纯净水洗涤沉淀后，再次离心。收集下层沉淀物，加水复溶，得到go-dox。
5)取100mlgo-dox溶液(1mg/ml)，在100rpm搅拌下，缓慢滴加到100ml45℃的聚1-乙烯基-3-丁基咪唑溴盐(16mg/ml)中，遮光，超声反应20min和100rpm搅拌反应3h，得pil/go-dox溶液。
6)在搅拌下，将100mlpaa溶液(16mg/ml)滴加到pil/go-x溶液中，于60℃下加热搅拌反应1h，之后室温反应12h，得到修饰的氧化石墨烯载药制剂paa-pil/go-dox。
2、paa-pil/go-dox的考察
1)粒径与zeta电位
将paa-pil-go/dox溶解于蒸馏水中，振摇混匀。测量粒径和zeta电位以及pdi值。结果如下图3、图4所示。由图可知，paa-pil/go-dox的粒径在750nm左右，且pdi值约为0.23，小于0.3，粒径均匀，分布良好。zeta电位为-34.1mv，说明表面带有负电荷能侧面说明制剂外层为paa显负电性。并且其绝对值大于20mv，由于具有较大的静电斥力，药物粒子不易聚沉，因此稳定性良好。
2)透射电镜试验
制样：取约1mlpaa-pil/go-dox溶液，将其稀释20倍，用枪头吸取100μl，滴到200目的铜网上；并配置2％的磷钨酸，用氢氧化钠调节ph至6.4-7.0，然后吸取100μl磷钨酸，缓慢的滴到铜网上，凉干，测定。结果如图5所示。从图中可以看出，go-dox以黑色片状存在，外层包裹物的黑色片层为paa和pil片层，粒径大约在750nm左右，未出现聚集现象。
实施例2paa-pil/go-dox的体外释放研究
(一)paa-pil/go-dox制备
1)称取5mg的氧化石墨烯go于烧杯中，加入100ml纯净水，通过超声使其充分溶解。
2)称取10mgdox加入到盛有10ml蒸馏水的烧杯中溶解。
3)在磁力搅拌的条件下，将dox的水溶液缓慢滴加到go的水溶液中，超声30min，将药物dox负载到氧化石墨烯go上。
4)用高速离心机在10000rpm下高速离心20min，除去游离的dox。反复用纯净水洗涤沉淀后，再次离心。收集下层沉淀物，加水复溶，得到go-dox。
5)取100mlgo-dox溶液(1mg/ml)，在100rpm搅拌下，缓慢滴加到100ml45℃的聚1-乙烯基-3-丁基咪唑溴盐(16mg/ml)中，遮光，超声反应20min和100rpm搅拌反应3h，得pil/go-dox溶液。
6)在搅拌下，将100mlpaa溶液(16mg/ml)滴加到pil/go-x溶液中，于60℃下加热搅拌反应1h，之后室温反应12h，得到修饰的氧化石墨烯载药制剂paa-pil/go-dox。
2、体外释放试验方法包括如下步骤：采用透析法探究go-dox的体外释放的情况。采用紫外分光光度法测定释放介质中dox浓度。分别取1ml制备好go-dox和paa-pil/go-dox，于透析袋中(mwco:8000da，分别以不同ph条件下(ph2.3，ph7.4)放入盛有10ml(0.1％(w/v)sds的pbs缓冲液作为透析介质)的烧杯中，转速设为100r/min，分别在0.25h，0.5h，1h，2h，4h，8h，12h，24h，48h取样1ml，同时补充同样的新鲜释放介质1ml。并用0.45μm的滤头进行过滤，按照实施例1中的色谱条件进样测定，测量dox的含量，并计算出相应时间点的累积释放量。做出时间-累积释放量曲线如图6。由释放曲线可知，将不同ph条件的累积释放量作为对比，其中药物在酸性条件下释放量高于中性条件，表现出了一定的ph敏感性。其原因主要可能是：dox具有羟基，氨基等官能团，而go有羟基、羧基，在酸性条件下，使药物与go形成的氢键断裂，所以药物释放量大于其他环境。ph7.4中性条件，dox上的羟基、氨基可与go上羟基、羧基形成氢键，结合稳定。而paa-pil/go-dox中dox被包裹上聚电解质后，使得其在ph2.3的条件下与与ph7.4的累计释放量相当。不同ph条件下的释放变化情况一致，说明在双层的包裹下，制剂组中的dox得到了很好的保护。在酸性的环境下，双层包裹明显使药物的耐酸性得到了改善，从而提高了药物的口服生物利用度。