本发明属于医疗制备领域，特别涉及一种骨钙素制备帕金森氏病治疗药物的用途。
背景技术：
机体在衰老过程中通常伴随不同程度的骨密度下降和神经退行性变。骨质疏松和帕金森病(parkinson’sdisease，pd)是常见的老年共患疾病，临床研究表明pd是骨折风险增加的一个重要因素。骨质疏松源于成骨形成和破骨吸收之间平衡的打破，导致骨结构破坏、脆性增加和骨折风险增加；而帕金森病是最常见的神经退行性运动障碍疾病，影响约1％的60岁以上人群，该病与黑质致密层多巴胺能神经元显著丢失有关，表现为运动障碍、自主神经功能障碍、情绪改变、睡眠障碍等多方面异常。二者均严重影响老年人的身心健康和生活质量，给家庭和社会带来沉重负担。现有的治疗药物仅能在一定程度上改善pd的部分运动症状，并不能逆转神经退行性进程，且长期应用可导致症状波动和异动症等并发症的出现。因此，寻找到这两种老年退行性疾病之间的内在联系和共同靶点，可为pd发病机制提供新的理解，为pd防治提供新的思路。
骨钙素(osteocalcin，ocn)是成骨细胞分泌的小分子多肽，是反映成骨细胞功能的一个重要指标。近年来越来越多的研究关注到ocn的多重生理功能，其不再单纯地被认为是一个经典的骨形成标记物，更是全身能量代谢的重要调节物质，能改善胰岛素抵抗、增强胰岛素分泌、改善糖耐量和血脂谱，调控棕色脂肪组织分化，影响男性生殖腺的功能和发育。还有研究发现ocn可抑制游离脂肪酸诱导的内皮细胞凋亡。
karsenty等人的研究使我们对ocn的生理功能有了进一步的突破性认识，研究结果表明ocn可通过血脑屏障(bloodbrainbarrier，bbb)，调节所有单胺类神经递质水平以及维持出生后的神经发生，同时母源性ocn也可通过胎盘调控胎鼠大脑发育。目前针对ocn在中枢神经系统中发挥功能的研究极少且主要局限在海马：外源性给予ocn可缓解老年鼠的认知功能障碍以及焦虑样行为，最新的研究进一步发现了ocn在海马的受体为gpr158，成骨细胞产生的ocn可通过bbb，结合于海马ca3区神经元的gpr158受体，通过gαq/ip3和bdnf信号通路发挥调节小鼠焦虑相关行为及空间学习记忆能力的作用。那么疑问随之而来，ocn是否能在除海马以外的其他脑区发挥调控作用？
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种骨钙素制备帕金森氏病治疗药物的用途。ocn作为一种成骨细胞合成分泌的多肽类激素，并没有将其应用来治疗pd的先例。本发明开拓性地第一次建立了ocn与pd治疗的关系，为pd防治提供新的方向，为深入探讨骨与中枢神经系统之间的相互调控关系奠定新的基础。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
第一方面，本发明涉及一种骨钙素在制备预防或治疗帕金森氏病的药物中的用途。
第二方面，本发明涉及一种骨钙素在制备降低黑质纹状体多巴胺能神经元损伤药物中的用途。
优选的，骨钙素通过akt/gsk通路作用于多巴胺能神经元。
优选的，所述药物以骨钙素为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成制剂使用。
优选的，所述制剂分别选自注射液、皮下埋植剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、缓释剂中的一种。
通过q-pcr和westernblot明确在大鼠黑质、纹状体、海马、皮质、小脑、脑干均表达有目前唯一已知的ocn的两种受体：gprc6a和gpr158，且co-ip明确ocn在大鼠纹状体主要与gpr158结合，这方面尚未有研究报道。这提示ocn可能可结合于黑质纹状体、影响神经递质的释放，鉴于pd病理上正是由于黑质致密层多巴胺能神经元显著丢失、黑质纹状体da不足引起，因此，本发明首次提出：ocn可能会通过作用于中脑多巴胺能神经元从而对pd发挥一定的保护作用。
具体而言，本发明以单侧纹状体(st)或前脑内侧束(mfb)注射6-ohda的250-290gsd大鼠为pd模型，将实验大鼠随机分为sham组、6-ohda组、6-ohda+低剂量ocn组和6-ohda+高剂量ocn组，通过观察各组大鼠的开放场(openfieldtest，oft)、圆筒(cylindertest)、躯体摇摆(elevatedbodyswingtest，ebst)等行为学实验表现，黑质、纹状体中多巴胺能神经元的变化，以及体外ocn对6-ohda损伤pc12细胞的作用，明确ocn可显著改善pd大鼠的运动功能障碍、多巴胺能神经元损伤，且ocn对多巴胺能神经元的保护作用依赖于akt/gsk通路。因此，ocn可用作制备治疗pd的药物。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：开拓性地第一次建立了ocn与pd治疗的关系，发现ocn可作为一种可通过血脑屏障的小分子多肽类激素，可作为一种全新的防治pd发生发展的药物。
附图说明
图1是腹腔注射ocn可改善pd大鼠的运动功能障碍的示意图；其中(a)开放场实验中sham组、6-ohda组、4ug/kgocn+6-ohda组、40ug/kgocn+6-ohda组在造模后4周内运动距离的变化；(b)4周内四组rearing次数的变化；(c)开放场实验中四组的运动路线代表图；(d)圆筒实验中四组左前肢的使用比例；(e)躯体摇摆实验中四组向左摇摆的次数比例；
图2是纹状体注射ocn可改善pd大鼠的运动功能障碍的示意图；其中(a)开放场实验中sham组、4ugocn+sham组、6-ohda组、0.4ugocn+6-ohda组、4ugocn+6-ohda、1ugngf+6-ohda组运动距离的变化；(b)六组rearing次数的变化；(c)开放场实验中六组的运动路线代表图；(d)圆筒实验中六组左前肢的使用比例；(e)躯体摇摆实验中六组向左摇摆的次数比例；
图3是腹腔和纹状体注射ocn均可改善pd大鼠的多巴胺能神经元丢失情况的示意图；其中，(a)腹腔注射四组sham、6-ohda、4ug/kgocn+6-ohda、40ug/kgocn+6-ohda黑质th免疫组化染色；(b)腹腔注射四组th+细胞定量分析；(c)腹腔注射四组纹状体westernblot中th水平；(d)纹状体注射六组sham组、4ugocn+sham组、6-ohda组、0.4ugocn+6-ohda组、4ugocn+6-ohda、1ugngf+6-ohda组黑质th免疫组化染色；(e)纹状体注射六组th+细胞定量分析；(f)纹状体注射六组纹状体westernblot中th水平；
图4是ocn可通过akt/gsk通路减轻6-ohda造成的pc12凋亡的示意图；其中，(a)(b)(c)(d)(e)分别是流式细胞技术检测control组、6-ohda组、ocn组、ocn+6-ohda组和ocn+6-ohda+ly294002组凋亡细胞情况；(f)凋亡细胞(r2，av+/7-aad+，thelatephaseapoptoticcellsandr4，av+/7-aad-，theearlyphaseapoptoticcells)定量分析；(g)cck8法检测各组的细胞活性；(h)westernblot检测各组akt/gsk通路变化。
具体实施方式
下面结合实例，对本发明作进一步说明：
实施例
本实施例涉及一种骨钙素制备帕金森氏病治疗药物的用途。具体机理研究试验如下：
所使用的大鼠：250-290g雄性、健康清洁级sd大鼠，购于上海斯莱克实验动物有限公司。
sd大鼠饲养条件：环境温度22±0.5度，12小时/12小时明暗交替。
实验数据用均数±标准误表示，多组之间比较采用anova，p＜0.05被认为有统计学意义。
腹腔注射ocn观察其对pd大鼠的保护：40只大鼠随机平均分为4组，即sham组、6-ohda组、4ug/kgocn+6-ohda、40ug/kgocn+6-ohda组。pd模型采用右侧前脑内侧束(mfb)双点注射6-ohda造模，6-ohda使用浓度为4ug/ul，每点注射4ul，共32ug。具体来说，造模前30min大鼠腹腔注射25mg/mldesipramine预防去甲肾上腺素能神经元损伤。1％戊巴比妥钠0.8ml/kg麻醉大鼠，备皮，固定于立体定位仪。消毒大鼠头皮，正中纵向切开头皮、充分暴露颅骨，用棉签蘸取3％双氧水，使前囟清晰显示。以前囟为标准点，将立体定位仪坐标轴调零，根据以下坐标轴，注射6-ohda(前囟后3.7mm，矢状缝右侧1.7mm，颅骨骨膜下7.8mm，门齿线.2.4mm；前囟后4.4mm，矢状缝右侧1.2mm，颅骨骨膜下7.8mm，门齿线.2.4mm)。根据上述坐标在大鼠颅骨上确定两个注射位点，用转子转通两个位点颅骨，暴露硬脑膜，用10ul哈密尔顿微量注射器吸取4ul配置好的6-ohda溶液，缓慢将注射针头根据参数插入参数，按1ul/min的速度注射6-ohda，留针10min，然后将针头缓慢的抽出；同样的方式注射第二个位点。针头抽出后，缝合头皮，消毒，编号后放入饲养笼中。
ocn的干预方式是在6-ohda注射造模前2天提前腹腔注射4ug/kg和40ug/kg的ocn，并在造模后持续注射一周，每天一次。造模后4周内连续观察行为学变化及一系列分子生物学改变。
纹状体注射ocn观察其对pd大鼠的保护：66只大鼠随机平均分为6组：sham组、4ugocn+sham组、6-ohda组、0.4ugocn+6-ohda组、4ugocn+6-ohda组、1ugngf+6-ohda组。pd模型采用右侧纹状体(st)单点注射6-ohda造模，6-ohda使用浓度为5ug/ul，注射4ul，共20ug。造模步骤基本同前，纹状体坐标为前囟后0.7mm，矢状缝右侧3mm，颅骨骨膜下5mm，门齿线2.4mm。
ocn的干预方式则是在注射6-ohda前4小时提前注射0.4ug和4ug的ocn，单次给药。造模后6周观察行为学变化及一系列分子生物学改变。
上述干预完成后，进行行为学评估，主要针对运动功能，包括开放场、圆筒和躯体摇摆实验。后取材，elisa检测大鼠脑脊液和血清中ocn水平；免疫组化检测黑质多巴胺能神经元th染色；westernblot检测纹状体th蛋白表达；免疫荧光检测纹状体星形胶质细胞和小胶质细胞状态等。
细胞模型采用6-ohda干预pc12细胞建立，通过用不同剂量的6-ohda对pc12细胞进行干预，观察6-ohda导致50％左右细胞的致死剂量，从而筛选出实验所需的最佳6-ohda使用剂量100um。ocn的干预方式为ocn(1-100ng/ml)预处理pc12细胞2h，然后6-ohda干预(100μm)24h。后cck8法测细胞活性，流式细胞技术检测细胞凋亡，westernblot检测akt/gsk通路及凋亡变化。
实验结果：
1.腹腔注射ocn可改善pd大鼠的运动功能障碍。在探究ocn的外周性保护作用实验中(图1)，开放场实验显示6-ohda组大鼠造模后4周内运动距离逐渐下降，而其他三组未观察此变化；组间比较显示与6-ohda组相比，4ug/kgocn+6-ohda组和40ug/kgocn+6-ohda组在造模后第3周和第4周运动距离明显增加(图1a、1c)；如图1b所示，尽管4组大鼠之间rearing次数未发现有明显统计学差异，但6-ohda组大鼠造模后四周内rearing次数有逐渐下降的趋势，ocn干预后此趋势消失(图1b)；在圆筒实验中，相较于sham组，6-ohda组大鼠左前肢触壁频率明显下降，ocn干预后相较于6-ohda组左前肢触壁频率明显增加，4ug/kgocn+6-ohda组达到统计学差异(图1d)；躯体摇摆实验中6-ohda组大鼠较对照组向左摇摆次数明显增加，ocn后干预后这种向左摇摆的现象有所减轻，但未达到统计学差异(图1e)。
2.纹状体注射ocn可改善pd大鼠的运动功能障碍。在探究ocn的中枢保护作用实验中(图2)，开放场实验显示6-ohda组大鼠运动距离较对照组明显下降，而4ugocn以及1ugngf干预后均可使其运动距离增加(图2a、2c)。尽管没有统计学差异，但相较于sham组，6-ohda组rearing次数有下降趋势，ocn和ngf干预后可减轻这种趋势(图2b)。圆筒实验中6-ohda组左前肢触壁频率明显降低，ocn后左前肢触壁频率有增加的趋势(图2d)。躯体摇摆实验中各组未见明显差异(图2e)。
3.ocn可减轻pd大鼠黑质纹状体的多巴胺能神经元丢失。mfb双点6-ohda注射导致右侧黑质～90％的th+神经元丢失，腹腔注射40ug/kgocn后可显著减轻这种丢失，使右侧黑质th+神经元恢复到左侧的～40％(图3a、3b)；6-ohda组大鼠右侧纹状体th蛋白表达显著低于左侧，腹腔注射ocn后可增加右侧纹状体th蛋白表达(图3c)。纹状体单点注射6-ohda导致右侧黑质～50％的th+神经元丢失，纹状体预注射4ugocn可显著减轻这种丢失，使右侧黑质th+神经元恢复到左侧的～80％，1ugngf也可减轻右侧黑质th+神经元丢失(图3d、3e)；6-ohda组大鼠右侧纹状体th蛋白表达显著低于左侧，纹状体预注射ocn和ngf均可增加右侧纹状体th蛋白表达(图3f)。
4.ocn可通过akt/gsk通路减轻6-ohda造成的pc12细胞凋亡。流式细胞结果显示相较于对照组，100um6-ohda处理pc12细胞24h后凋亡细胞明显增多，而100ng/mlocn预处理2h可明显降低凋亡细胞数量，而在加入pi3k抑制剂ly294002后这种保护作用明显降低(图4a-f)；同样，100um6-ohda干预pc12后细胞活性明显下降，100ng/mlocn预处理可明显改善pc12细胞活性，而加入ly294002后这种保护作用变得不再明显(图4g)；westernblot结果显示相较于对照组，6-ohda干预组p-akt、p-gsk蛋白表达明显下降，ocn和ngf预处理可明显增加二者的表达，而ly294002可阻断ocn的该保护作用(图4h)。
综上所述，本发明的研究结果表明pd大鼠存在脑脊液中ocn降低的现象，外源性给予ocn可改善pd大鼠的运动功能障碍、减轻其黑质纹状体多巴胺能神经元丢失，且在体外能通过akt/gsk通路减轻6-ohda造成的pc12细胞凋亡。ocn作为一种可通过血脑屏障的小分子多肽类激素，可成为一种全新的防治pd发生发展的药物。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。