本发明涉及生物组织工程技术领域，具体涉及一种生长因子可控的人工组织器官软体支架制备方法。
背景技术：
当下由于疾病、衰老、事故、战争等导致的器官衰竭或组织损坏的临床病例逐年递增，医学上常采用器官移植、人工替代物及药物等方法来治疗组织器官病变；但是，用于移植的异体器官供不应求，而且移植中易发生免疫排斥反应，患者必须长期使用抗免疫药物，因此移植成功率比较低。而人工替代支架结构可控、生物相容性良好，利于体外活体组织器官的培养，增大了移植可能性。
人体组织器官属于软组织，是由不同的组织细胞按一定的次序联合形成具有一定功能的组织结构。在组织器官修复过程中，组织化促进生长因子如胰岛素、胰高血糖素、表皮生长因子、肝细胞生长因子(hgf)、肝细胞再生刺激因子(hss)、碱性成纤维细胞因子及血管内皮细胞生长因子不仅能够促进体外培养组织细胞的生长、分化、增殖及生物学性能的维持，同时将可溶性信号因子与生物支架结合能够触发并刺激细胞三维培养物的血管形成。除此之外，组织器官内部血管分布高度密集，这还要求促血管因子能够按照一定的浓度梯度分布参与组织修复。
传统的生物支架制造方法如溶液浇铸/粒子沥出法、热致相分离法和静电纺丝法等，在构造生物组织支架上存在一定缺陷，难以实现自然组织的结构和功能。首先，支架制造过程中有高温、紫外光照及有机溶剂等因素，严重影响生长因子与细胞的活性，不利于生长因子、细胞参与支架的构建。其次，这些方法不能对支架结构的孔径、孔隙率进行有效控制，导致种植于支架的细胞游离在支架表面，分布不均匀，无法实现生长因子的浓度梯度可控，而且方法可重复性差。
例如，公开号cn104888277a的专利公开了一种细胞-生物支架复合体及其3d打印成型方法，该方法先在生物支架表面设置纳米纤维层，再在纳米纤维层上设置含生长因子的生物细胞悬液。该专利很好地解决了细胞-支架复合体的打印的问题，但是该方法只是在支架表面设置含生长因子的细胞悬液，并没有考虑支架内部生长因子的分布及其浓度梯度可控的问题。公开号cn103120808a的专利公开了一种三维软体支架的制备方法，该方法将组织细胞悬浮液与水凝胶按照一定体积比均匀混合，通过自制生物成型机打印，实现器官软体组织支架的制备。该专利采用了活体组织细胞与凝胶制备支架，而且能够有效地控制软体支架的微结构和外形，但该方法仅是打印细胞与凝胶的混合物，无法实现软体支架内部生长因子精确分布的需求。
技术实现要素：
为解决现有技术存在的问题，保证生长因子及组织细胞活性，又能实现生长因子在软体支架结构中的精准分布，本发明在现有的人工软体组织支架成型方法基础上，以构建具有生长因子梯度分布的软体支架为设计目标，提出了一种基于多个喷头协作打印的，生长因子浓度梯度可控的人工软体组织支架制备方法。
本发明的思路原理是：
首先通过计算机辅助设计建模，设计并控制支架外型和内部结构、尺寸、孔隙率等；其次，以水凝胶材料作为生物支架，水凝胶具有高分子多孔网络体系，利于细胞粘附及生长增殖，性质柔软且可塑性强，便于加工获得所需的组织或器官形状。在打印过程中，整个支架采用多个喷头协作打印的方式，先打印一层水凝胶基体材料，再在上面打印一层组织细胞，交联之后按照一定浓度梯度分布要求打印生长因子，实现水凝胶材料、细胞、生长因子的分层叠加，最后打印出满足生长因子浓度梯度可控的三维软体支架结构，既能保证生长因子和细胞的活性，又能实现软体组织支架内部生长因子浓度梯度分布的准确可控。
本发明的技术方案为：
所述一种生长因子可控的人工组织器官软体支架制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：获取待打印的人工组织器官软体支架三维模型，并对三维模型进行分层切片处理，获取分层截面数据。
步骤2：向步骤1中分层截面数据中导入对应的生长因子浓度梯度数据。
在不同的组织器官修复过程中，参与调节的生长因子如胰岛素、胰高血糖素、表皮生长因子、肝细胞生长因子、肝细胞再生刺激因子、碱性成纤维细胞因子及血管内皮细胞生长因子等的浓度分布是不同的，其中具体的生长因子的浓度梯度数据依据具体的组织器官的血管分布、结构功能等因素来确定。
步骤3：制备水凝胶支架基体材料，基体材料包括去离子水、海藻酸钠、明胶，其中海藻酸钠的质量分数为2％～5％，明胶的质量分数为0.8％～1.2％；根据组织器官的细胞密度制备具有对应细胞密度的软体组织细胞悬液；所述细胞悬液包括dmem细胞培养液、血清和患者自体的器官组织细胞；并依据不同组织器官的血管分布、结构功能制备具有相应调节作用的生长因子蛋白悬液。
这里海藻酸钠以及明胶的质量分数限定较为重要，海藻酸钠质量分数低于设定范围会导致软骨支架固化后强度低、弹性差；浓度高于设定范围能够提升强度和弹性，但是会缩小微孔直径，不利于细胞生存。而明胶质量分数低于设定范围，难以促进软骨支架快速固化；明胶质量分数高于设定范围，也会缩小软骨支架微孔直径，不利于细胞生存。
步骤4：将软体组织细胞悬液装入第一压电打印喷头储液腔，将生长因子蛋白悬液装入第二压电打印喷头储液腔，将水凝胶支架基体材料装入挤压打印喷头储液腔。
步骤5：按照步骤1中的分层截面数据控制挤压打印喷头打印一层水凝胶支架，然后采用质量分数3％～5％的雾化氯化钙溶液对水凝胶支架进行固化。
步骤6：按照步骤1中的分层截面数据控制第一压电打印喷头在固化后的水凝胶支架上打印一层软体组织细胞。
步骤7：按照步骤2中的生长因子浓度梯度数据控制第二压电打印喷头在固化后的水凝胶支架上打印一层生长因子，并通过控制第二压电打印喷头的打印频率，实现同一分层截面中不同区域生长因子浓度梯度分布。
步骤8：重复步骤5～步骤7，直至所有分层打印完毕，支架制作完成。
进一步的优选方案，所述一种生长因子可控的人工组织器官软体支架制备方法，其特征在于：步骤3中的软体组织细胞悬液内细胞密度为对应组织器官中细胞密度的110％-140％。
这里控制悬液细胞密度为对应组织器官中细胞密度的110％-140％，主要是因为申请人发现，如果简单的按照组织器官中细胞密度直接配置相应密度的细胞悬液，则会在打印过程中，因为需要打印大量的细胞悬浮液而增加打印时间，减小细胞存活率；所以需要在组织器官中细胞密度的基础上，提高一定密度来配置细胞悬液，但细胞密度又不能过高，实验发现，密度过高会增加细胞培养的难度，同时打印过程中造成一个液滴中含有多个细胞等问题，影响打印精度。
进一步的优选方案，所述一种生长因子可控的人工组织器官软体支架制备方法，其特征在于：步骤5中采用挤压打印喷头打印水凝胶支架前，先将挤压打印喷头喷嘴处的低温水凝胶排出后，再进行打印；步骤6中采用第一压电打印喷头打印细胞之前的空闲期间，保持细胞悬液低频振荡，且每隔30s～40s将第一压电打印喷头喷嘴处的细胞悬液排出至废液槽。
这里进行进一步限定的主要原因是，申请人在实际使用过程中发现，如果仅仅是简单的一层水凝胶一层细胞一层生长因子往复打印，由于挤压喷头和压电喷头处于交替工作状态，在挤压打印空闲期，喷嘴冷却导致喷嘴处水凝胶固化，再次打印时难以同之前打印的组织结合；在细胞打印空闲期：细胞悬液停止运动造成细胞沉降，不仅导致细胞悬液内细胞分布不均匀，还容易造成细胞堆积堵塞压电喷头；为解决上述问题，提出了上述限定特征。
进一步的优选方案，所述一种生长因子可控的人工组织器官软体支架制备方法，其特征在于：步骤1中三维模型分层切片的层间距为△h，△h等于挤压打印喷头的喷嘴直径。
进一步的优选方案，所述一种生长因子可控的人工组织器官软体支架制备方法，其特征在于：待打印的人工组织器官软体支架为肝组织支架，生长因子为成纤维细胞生长因子和肝细胞生长因子。
进一步的优选方案，所述一种生长因子可控的人工组织器官软体支架制备方法，其特征在于：步骤2中，对于肝组织支架的每个分层截面，截面表层、中层、内层中成纤维细胞生长因子以及肝细胞生长因子的浓度梯度分布比均为1:2:3；截面表层、中层、内层的面积比为1:2:3。
进一步的优选方案，所述一种生长因子可控的人工组织器官软体支架制备方法，其特征在于：肝组织支架每个分层截面表层的成纤维细胞生长因子的浓度为1-100μg/ml，表层的肝细胞生长因子的浓度为5-10ng/ml。
进一步的优选方案，所述一种生长因子可控的人工组织器官软体支架制备方法，其特征在于：压电打印喷头的打印频率不超过3khz。
这里对打印频率进行进一步限定的主要原因是，过高的打印频率会导致喷头堵塞。
进一步的优选方案，所述一种生长因子可控的人工组织器官软体支架制备方法，其特征在于：对于每个分层截面，控制第二压电打印喷头分别以1khz,2khz,3khz的频率打印截面表层、中层、内层的生长因子蛋白悬液。
有益效果
与现有技术相比，本发明具有显著的优点：
本发明提出的一种生长因子浓度梯度可控的人工组织器官软体支架制备方法，制备过程中，采用压电式打印喷头分层、定点喷洒生长因子蛋白悬液，精确控制生长因子在支架材料中的定点分布；同时使用挤压式打印喷头打印高黏度的水凝胶材料，使用压电式打印喷头打印组织细胞，利于组织细胞在水凝胶基体上的的黏附及生长。
本发明突破了传统组织工程技术空间分辨率低的局限性，打印全程无高温高压环境，保证了生长因子和细胞的活性，在微观上构建适宜组织细胞生存的微环境，不仅能够促进器官、血管相关组织细胞在支架上的黏附、增殖及分化，也能促进营养物质在支架内的运输和代谢废物的排出，使复杂组织和器官的体外再培养成为可能。
本发明提出的人工三维软体支架制备方法，可针对不同患者的需求进行设计，有助于提高支架与细胞的复合效率，缩短软体支架体外培养周期，同时制备出的软体支架也可作为模拟组织器官进行体外检测药物毒性及其他医学和生物学测试。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
肝脏由多种细胞组成并且具有复杂血管网络结构，是机体最重要的生命器官之一。在组织器官修复过程中，碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)作为体内最有效的促血管生成因子，能够触发并刺激细胞三维培养物的血管形成。肝细胞生长因子(hgf)能够促进细胞分裂、细胞运动及血管内皮细胞增生和新生血管形成,调节胶原纤维的合成和炎性反应，具有肝脏损伤后启动肝再生的功能。本实施实例采用生长因子为成纤维细胞生长因子和肝细胞生长因子，制备肝组织支架。
具体的生长因子浓度梯度可控的人工软体支架制备包括以下步骤：
步骤1：采用ct或mri对被替换肝脏组织进行扫描，经计算机处理后获取被替换肝脏组织软体支架三维模型，并对三维模型进行分层切片处理，获取分层截面数据。其中，将三维模型总共分为厚度相同的n层，第i层的截面面积为ai，层间距为△h，△h等于挤压喷头喷嘴直径，即△h＝0.3mm。
步骤2：向步骤1中不同分层截面数据中导入对应的生长因子浓度梯度数据。
依据肝脏组织血管分布密度由表层至深层逐渐增大，组织内部促血管生成因子的浓度也应对应升高；设置被替换肝脏组织软体支架三维模型表层、中层、内层中成纤维细胞生长因子以及肝细胞生长因子的浓度梯度的分布比均为1:2:3；其中模型的表层、中层、内层的面积比为1:2:3，肝脏组织模型表层的成纤维细胞生长因子的浓度为1-100μg/ml，肝脏组织模型表层的肝细胞生长因子的浓度为5-10ng/ml。
步骤3：制备水凝胶支架基体材料，基体材料包括去离子水、海藻酸钠、明胶，其中海藻酸钠的质量分数为3％，明胶的质量分数为1％。
制备细胞密度为1×106/ml的肝组织细胞悬液；所述肝组织细胞悬液包括dmem细胞培养液、血清和患者自体的肝组织细胞，细胞培养液与血清的质量比为2-6:1。取用患者自体肝组织细胞进行培养，经过多次传代达到需求数量，使用前用胰蛋白酶进行消化，并加入到dmem培养液中从而制备出细胞密度为1×106/ml的肝组织细胞悬液。
制备碱性成纤维细胞生长因子蛋白悬液，所述成纤维细胞生长因子采用基因工程重组的碱性成纤维细胞生长因子(rh-bfgf)，悬液浓度为1-100μg/ml；肝细胞生长因子悬液浓度5-10ng/ml。
步骤4：将软体组织细胞悬液装入第一压电打印喷头储液腔，将生长因子蛋白悬液装入第二压电打印喷头储液腔，将水凝胶支架基体材料装入挤压打印喷头储液腔。设置初始值i＝1，启动打印设备。
步骤5：按照步骤1中的分层截面数据控制挤压打印喷头打印一层水凝胶支架，然后采用质量分数4％的雾化氯化钙溶液对水凝胶支架进行固化，即使水凝胶支架发生交联反应而定型。
步骤6：按照步骤1中的分层截面数据控制第一压电打印喷头在固化后的水凝胶支架上打印一层软体组织细胞。
步骤7：按照步骤2中的生长因子浓度梯度数据控制第二压电打印喷头在固化后的水凝胶支架上打印一层生长因子，并通过控制第二压电打印喷头的打印频率，实现同一分层截面中不同区域生长因子浓度梯度分布。
由于过高的打印频率会导致喷头堵塞，所以限定压电打印喷头的打印频率不超过3khz。这里对于每个分层截面，控制第二压电打印喷头分别以1khz,2khz,3khz的频率打印截面表层、中层、内层的生长因子蛋白悬液，实现生长因子浓度梯度分布。压电喷头采用赛尔128系列喷头。
步骤8：重复步骤5～步骤7，直至所有分层打印完毕，支架制作完成。
需要注意的是，步骤5中采用挤压打印喷头打印水凝胶支架前，先将挤压打印喷头喷嘴处的低温水凝胶排出后，再进行打印；步骤6中采用第一压电打印喷头打印细胞之前的空闲期间，保持细胞悬液低频振荡，且每隔30s～40s将第一压电打印喷头喷嘴处的细胞悬液排出至废液槽。
采用该特征的主要原因是，申请人在实际使用过程中发现，如果仅仅是简单的一层水凝胶一层细胞一层生长因子往复打印，由于挤压喷头和压电喷头处于交替工作状态，在挤压打印空闲期，喷嘴冷却导致喷嘴处水凝胶固化，再次打印时难以同之前打印的组织结合；在细胞打印空闲期：细胞悬液停止运动造成细胞沉降，不仅导致细胞悬液内细胞分布不均匀，还容易造成细胞堆积堵塞压电喷头；为解决上述问题，提出了上述限定特征。
支架制作完成后，取出支架，将该器官软体组织支架复合物置于生物反应器，连接到体外动态灌流系统平台中，加入预热的培养液后进行动态培养。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。