等鞭金藻多肽IZP-2在制备预防和治疗酒精性肝损伤的药物、保健品中的用途的制作方法

本发明涉及多肽领域，尤其涉及等鞭金藻多肽izp-2在制备预防和治疗酒精性肝损伤的药物、保健品或饮食补充剂中的用途。

背景技术

湛江等鞭金藻(isochrysiszhangjiangensishu1992)，是一种分布广泛的微小型海洋浮游单细胞藻类，属于金藻门chrysophyta，金藻纲chrysophyceae，等鞭金藻目isochrysidales，等鞭金藻科isochrysidaceae。因为其个体小，繁殖快，营养丰富，脂肪含量达26.35％，细胞壁不含纤维素，易被贝类幼虫捕捉吞食和消化吸收，是海产经济双壳类动物幼虫良好的基础饵料。然而，目前对湛江等鞭金藻的生物活性方面的开发及研究都较少。

酒精性肝病(alcoholicliverdisease,ald)为长期大量饮酒所致肝脏损伤性疾病，在饮酒人群中具有较高的发生率，其导致脂肪性肝变及肝癌是一种常见的肝损伤变性，有研究表明，过量饮酒已成为当今世界范围内一个重要的公共卫生问题。嗜酒者的肝脏、神经系统疾患的发病率比一般人群高20％。虽然很多学者都致力于酒精性肝病的研究，但依然缺乏有效的治疗方法。之前的相关研究表明氧化应激在发病过程中发挥了重要作用，同时，关于氧化应激的研究也逐渐被学者们重视，研究抗氧化机制是否存在对酒精性肝损伤具有保护作用成为研究的一大热点，并为肝损伤的预防和治疗提供理论依据。

肝癌细胞株(hepg2)是研究酒精性肝损伤的良好模型，其生命力强，容易培养繁殖，并广泛应用于肝细胞毒性和代谢类研究。

目前，还没有关于湛江等鞭金藻多肽对酒精诱导的细胞损伤保护作用及其机制的研究。

技术实现要素：

为了解决上述现有技术中的问题，本发明提供了以下技术方案：

在一个方面，本发明提供一种等鞭金藻多肽izp-2在制备预防和治疗酒精性肝损伤的药物、保健品或饮食补充剂中的用途，其中等鞭金藻多肽izp-2的氨基酸序列为phe-glu-ile-his-cys-cys-gly。

进一步地，所述等鞭金藻多肽izp-2源自湛江等鞭金藻(isochrysiszhangjiangensishu1992)。

进一步地，所述等鞭金藻多肽izp-2能够抑制酒精诱导的hepg2细胞损伤。

进一步地，所述等鞭金藻多肽izp-2的浓度大于等于10μm。

进一步地，所述等鞭金藻多肽izp-2能够抑制dna在氧化反应中的断裂。

进一步地，所述等鞭金藻多肽izp-2能够降低细胞内ros含量。

在另一方面，本发明提供一种等鞭金藻多肽izp-2在体外清除自由基的用途，其中所述等鞭金藻多肽izp-2的氨基酸序列为phe-glu-ile-his-cys-cys-gly。

在另一方面，本发明提供一种等鞭金藻多肽izp-2在体外抑制酒精诱导的hepg2细胞损伤的用途，其中所述等鞭金藻多肽izp-2的氨基酸序列为phe-glu-ile-his-cys-cys-gly。

在另一方面，本发明提供一种等鞭金藻多肽izp-2在体外抑制dna在氧化反应中的断裂的用途，其中所述等鞭金藻多肽izp-2的氨基酸序列为phe-glu-ile-his-cys-cys-gly。

在另一方面，本发明提供一种等鞭金藻多肽izp-2在体外清除细胞内ros的用途，其中所述等鞭金藻多肽izp-2的氨基酸序列为phe-glu-ile-his-cys-cys-gly。

在本发明中，通过建立酒精损伤hepg2细胞模型，致力于探究湛江等鞭金藻提取物多肽izp-2对酒精诱导的人肝癌细胞株hepg2损伤的保护作用，为藻类活性多肽的开发提供理论依据。实验通过测定多肽izp-2的dpph自由基清除率；在体外培养hepg2细胞，用酒精诱导细胞损伤，建立细胞模型，通过mtt法筛选合适的样品浓度、酒精处理浓度；采用dna琼脂糖凝胶电泳以及荧光染色实验评价其抗氧化性。结果显示，10、20、50、100μmol/l的多肽样品对细胞不具毒性；以1mol/l的酒精浓度作用后，随着多肽浓度的增加，实验组的细胞活力增强，说明多肽对细胞具有保护作用且呈浓度依赖型；随样品浓度的增加，dna条带亮度增加，对dna的保护作用增强；多肽izp-2对活性氧簇具有一定的清除能力。综上，湛江等鞭金藻提取物多肽izp-2在一定程度上对酒精损伤的hepg2细胞有氧化应激的保护作用，具有深入研究的与开发的前景。

在本发明中，术语“基本”或“基本上”并不排除“完全”的意思。如一个成分“基本上不含”y，也可以是完全不含有y。在限定具体数值的情况下，是指该具体数值具有以该具体数值为基础的上下浮动的范围，浮动范围可以是该具体数值的+/-5％，+/-4％，+/-3％，+/-2％，+/-1％，+/-0.5％，+/-0.2％，+/-0.1％，+/-0.05％，+/-0.01％等。如果需要，“基本”或“基本上”可以以上浮动范围代替或从本发明定义中删除。

“含有”既包括提到的因素，也允许包括附加的、不确定的因素。

“大约”、“约”、“左右”在限定具体数值的情况下，是指该具体数值具有以该具体数值为基础的上下浮动的范围，浮动范围可以是该具体数值的+/-5％，+/-4％，+/-3％，+/-2％，+/-1％，+/-0.5％，+/-0.2％，+/-0.1％，+/-0.05％，+/-0.01％等。

“和/或”表示由其连接的多个术语可以各自单独地使用，也可以相互任意地组合。

本发明中，为简明起见而使用的数值范围不仅包括其端点值，也包括其所有的子范围和此范围内所有的单独的数值。例如，数值范围1-6不仅包括子范围，例如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等，也包括此范围内单独的数值，例如1、2、3、4、5、6。

附图说明

图1示出了多肽izp-2对hepg2细胞相对活力的影响；

图2示出了酒精对hepg2细胞相对活力的影响，其中与空白组比较(0mol/l)，p<0.05；

图3示出了酒精作用hepg2细胞后结晶紫的变化；

图4示出了酒精作用后hepg2细胞形态图，其中a-h酒精浓度依次为0、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5mol/l；

图5示出了多肽izp-2对hepg2细胞的保护作用；

图6示出了hepg2dna琼脂糖凝胶电泳结果；

图7示出了hepg2细胞荧光染色结果，其中(a)为空白组，(b)为对照组，(c)-(f)为实验组。

具体实施方式

在下面描述和图解本发明的示例性实施方案。为了清楚和准确，下面讨论的所述示例性实施方案可以包括优选的步骤、方法和特征，本领域普通技术人员将可以认识到，这些优选的步骤、方法和特征不是落在本发明范围内的必要条件。

在下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。在下述实施例中所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。

在下述实施例中，所用的等鞭金藻多肽izp-2由杭州丹港生物科技公司提供，氨基酸序列为phe-glu-ile-his-cys-cys-gly，分子量为807.95，纯度为≥98％，保存温度≤-20℃，使用时用超纯水配成所需浓度使用。

在下述实施例中，实验数据用统计软件进行分析并作图，以x±sd表示，进行方差分析及多重比较；p<0.05(*)表示存在显著性差异，(**)表示显著性差异明显，(***)表示存在极显著性差异。

实施例1：dpph自由基清除能力的测定

实验原理：dpph(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)，即1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基。分子中存在苯环的π键和多个-no2，使得氮自由基能够稳定存在。其有机醇溶液呈现紫色，在517nm波长处具有最大光吸收。当自由基清除剂提供一个电子与dpph自由基的孤对电子配对，自身紫色变为黄色，dpph被清除。此时在517nm波长处的吸光度a值变小，其变化程度与自由基清除程度呈线性关系，即自由基清除剂的清除能力越强，吸光度越小，因此dpph比色法为清除自由基活性的检测提供了简便且理想的模型。

实验过程：称取0.1972gdpph试剂，用95％的乙醇溶解配制成100mmol/l的溶液，再梯度稀释成0.1mmol/l的溶液使用。设置实验组，加入dpph溶液50μl，再分别加入不同浓度的样品溶液，样品终浓度分别为10、20、50、100μmol/l，混合均匀后在常温下避光反应30min，在517nm波长处测定吸光值(a1)；空白组为50μl95％的乙醇溶液代替dpph溶液加入50μl超纯水，在517nm波长处测定吸光值(a2)；对照组为50μl超纯水代替样品加入到50μldpph溶液，在517nm波长处测定吸光值(a3)。按以下公式计算dpph自由基清除率，结果见表1。

dpph自由基清除率/％＝[a3-(a1-a2)]/a3×100％

表1：多肽izp-2对dpph自由基的清除能力

由表1可知，实验组不同浓度的多肽izp-2的dpph自由基清除率均在80％以上，具有较强的抗氧化能力。

实施例2：多肽izp-2对hepg2细胞相对活力的影响

2.1酒精损伤细胞模型条件的确定及多肽浓度的确定(mtt法)

实验原理：mtt法是以活细胞代谢物还原剂mtt{3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-yl)-3,5-di-phenytetrazoliumromide}噻唑蓝为基础。其是一种接受氢离子的黄色化合物染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶的作用下，生成蓝紫色的formazan(甲瓒)结晶，甲瓒结晶的生成量仅与活细胞数目成正比(因为死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，无还原功能)。还原生成的甲瓒结晶可以用二甲基亚砜溶液(dmso)来溶解，溶液颜色深浅与其含量成正比，利用酶标仪测定490-570nm的光密度od值，以反映出活细胞数目。

2.2样品毒性筛选

实验分组：空白对照组(正常细胞+培养液)、实验组(多肽样品，4个浓度梯度)，每组设置3个复孔；样品的终浓度分别是10、20、50、100μmol/l。

处理过程：将对数生长期细胞进行消化，用dmem培养液进行稀释，调整细胞密度，每孔100μl接种于96孔板中，在5％co2，37℃恒温培养箱孵育24h至细胞贴壁。弃去96孔板中的旧培养基，加入100μl的新鲜培养基，分别加入各浓度的样品，放入co2培养箱培养24h。培养结束后，弃去旧培养基，加入1mg/mlmtt溶液100μl/孔，继续孵育4h，小心吸去mtt,加入100μldmso溶液，于摇床上避光孵育10min，在570nm下测定od值。

根据下式计算hepg2细胞相对活力(％)，得出细胞相对活力以确定样品是否具有毒性。实验结果见图1。

hepg2细胞相对活力(％)＝实验组od值/空白组od值×100％

图1数据表明，实验组与空白组的细胞相对活力没有显著差异，没有发生细胞活力的骤降，也没有出现实验组浓度增加至某一值时，细胞活力显著降低，说明实验设置的10、20、50、100μmol/l样品浓度较为理想，细胞均能耐受，即该多肽对细胞没有毒性，可继续进行实验。

2.3酒精浓度筛选

实验分组：空白对照组(正常细胞+培养液)、实验组(酒精，6个浓度梯度)，每组设置5个复孔；样品的终浓度分别是0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5mol/l。

浓度效应实验：将处于对数生长期的细胞消化后，用dmem培养液将其吹打成单个细胞，制备的hepg2细胞悬液以1×10⁴个/孔，100μl接种于96孔板中，孵育24h。按实验组分别加入各浓度酒精溶液，放入co2培养箱培养24h。培养结束后，弃去旧培养基，加入1mg/mlmtt溶液100μl/孔，继续孵育4h，吸弃mtt,加入dmso溶液100μl/孔，于摇床上避光孵育10min，在570nm下测定od值。计算细胞相对活力，确定酒精的最佳作用浓度，以进行下一步实验，结果见图2。同时在倒置显微镜下拍摄细胞形态图，结果见图3。图4则示出了不同浓度酒精作用后hepg2细胞形态图。

图2数据表明，不同浓度的酒精会不同程度地破坏细胞，随着酒精浓度的递增，与空白组相比，显著性差异越大，细胞损伤愈严重。

图3亦表明，从左往右酒精浓度依次增大,活细胞数量越少，用mtt试剂作用后生成的结晶紫越少，颜色越浅，直观看出酒精破坏作用的程度。

图4的图a-h表明，随着酒精浓度的递增，依次是0、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5mol/l，细胞数量逐渐减少。空白组a数量最多，生长旺盛，铺满整个观察视野，排列紧密，轮廓清晰，细胞呈现梭形或多角形，形态较为一致，可观察到清晰的细胞核；随着损伤程度增加，可以观察到细胞聚集成团，体积变小，形状不规则，细胞间隙变大，边界模糊，贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落，有类似于凋亡阶段的特征出现。

2.4样品对细胞的保护作用

实验分组：空白对照组(正常细胞+培养液)、对照组(正常细胞+培养液+酒精)、实验组(多肽样品，4个浓度梯度，酒精)，每组设置6个复孔；样品的终浓度分别是10、20、50、100μmol/l，酒精浓度是1mol/l。

实验过程：将处于对数生长期的细胞消化后，加入dmem培养液将其吹打成单个细胞，制备的hepg2细胞悬液以1×10⁴个/孔，100μl接种于96孔板中，孵育24h。弃去96孔板中的旧培养基，加入100μl/孔的新鲜培养基，实验组中分别加入各浓度的样品，放入co2培养箱培养1h；在实验组和对照组中加入17.1mol/l的无水乙醇，每孔5.7μl。使酒精浓度为1mol/l，放入co2培养箱培养24h。弃去旧培养基，加入1mg/mlmtt溶液100μl/孔，继续孵育4h；吸弃mtt,加入dmso溶液100μl/孔，于摇床上避光孵育10min，在570nm下测定od值。计算细胞相对活力，评估样品对酒精损伤的hepg2细胞损伤的保护能力。结果见图4。

图4数据表明，在用1mol/l的酒精破坏细胞后，即对照组中细胞活力显著降低，而实验组中4个浓度的样品对细胞具有一定的保护作用，浓度越大，保护作用相对增强。

实施例3：琼脂糖凝胶电泳

实验原理：琼脂糖凝胶电泳广泛应用于核酸分析中，是核酸研究中不可缺少的重要分析手段。核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液中，磷酸基团全部解离，而碱基不解离，核酸分子因而带负电荷，电泳时向正极迁移。琼脂糖是一种聚合链线性分子，主要是从海洋植物琼脂中提取并经糖基化修饰所得，使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功能，使得构像和大小不同的核酸分子的迁移率出现较大差异,以达到分离的目的。

3.1dna提取

取对数生长期的细胞hepg2，消化制成细胞悬液后转移至30ml离心管中，离心1000rpm/10min，弃去上层培养基后加入10mlpbs缓冲溶液离心1000rpm/10min，弃去上清液。加入0.2mol/l的醋酸钠350μl，用移液枪打匀后转移至微量离心管中，再依次加入25μlsds(10％)、10μl蛋白酶k(10mg/ml)、25μl核糖核酸酶(0.5mg/ml)。在37℃涡旋45min后,加入苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)410μl后涡旋30s，离心12000rpm/10min，小心用移液枪吸取上层dna约380μl至一新微量离心管，加入-20℃的无水乙醇600μl，离心12000rpm/5min。弃去上清液,干燥，加入50μl溶液te，溶解待用。

3.2dna电泳

制备1％琼脂糖凝胶：称取0.7g琼脂糖于锥形瓶中，加入70ml超纯水，微波炉加热1min至透明清澈的溶液状，待冷却至50-60℃时倒入制胶板，控制厚度为3-5mm为佳，插上合适梳子，待用。待凝胶完全凝固后，缓慢向上轻轻拔掉梳子齿，在电泳槽中加入500ml电泳液，小心放入凝胶。设置实验组(4个样品浓度)，分别加入dna4μl，加入浓度依次为10、20、50、100μmol/l的样品4μl，反应10min后，加入14μl硫酸亚铁溶液(300μmol/l)、14μl过氧化氢溶液(0.1mmol/l)，反应10min后，加入4μledta(130mmol/l)终止反应，同时设置空白组(dna+超纯水)和对照组(不加样品)。点样时以溶液：上样缓冲液＝4:1的比例混匀依次上样，20μl/孔。将电泳仪的正负极与电泳槽的正负极相连，设置电泳条件：100v，30min，进行电泳。电泳结束后，用染料gv(goldview)染色，在凝胶成像系统中观察dna条带的变化。结果见图6。

从图6可以看到，从左到右分别为对照组，空白组，实验组，实验组样品浓度依次为10、20、50、100μmol/l。对照组的dna条带基本无法识别，说明dna被破坏严重；空白组中可见完整的dna条带，明亮且清晰；实验组中随浓度的增加，dna条带愈加清晰，保护作用依次增强。

实施例4：细胞内活性氧簇(ros)的测定

实验原理：活性氧(reactiveoxygenspecies,ros)是生物体内产生的超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基、一氧化氮(no)等活性含氧化合物的总称，参与细胞生长增值、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理病理过程，且研究表明ros可能与细胞癌变有密切关系。实验采用dcfh-da荧光探针进行荧光检测。dcfh-da本身没有荧光，可以自由进出细胞膜，进入细胞后可以被细胞内的酯酶水解生成dcfh。dcfh不能透过细胞膜，从而使探针很容易标记到细胞内。在活性氧存在的条件下，dcfh被氧化生成荧光物质dcf，荧光强度与细胞内活性氧水平成正比，检测dcf的荧光便可知道细胞内活性氧的水平。

实验过程：将处于对数生长期的细胞消化后，用dmem培养液将其吹打成单个细胞，制备的hepg2细胞悬液以1×10⁴个/孔，200μl接种于24孔板中，孵育24h。弃去24孔板中的旧培养基，加入200μl/孔的新鲜培养基，实验组中分别加入各浓度的样品，放入co2培养箱培养1h；在实验组和对照组中加入11.67μl/孔17.1mol/l的无水乙醇，使得酒精浓度为1mol/l，放入co2培养箱培养12h。弃去旧培养基，用pbs缓冲溶液小心清洗细胞3min/次，重复3次；加入200μldcfh-da试剂(10μmol/l)，置于37℃恒温培养箱中孵育20min。弃去dcfh-da试剂，用pbs缓冲溶液小心清洗细胞3min/次，重复3次。于荧光倒置显微镜下观察并拍照。结果见图7。

如图7所示，在荧光倒置显微镜下可观察到，空白组(a)基本无荧光效果，说明细胞生长状态良好，未受到损伤；对照组(b)受到酒精损伤后，出现了明显的荧光强度增强；(c)-(f)经不同多肽浓度处理，随着多肽浓度的增加，可观察到的荧光强度逐渐减弱，表示细胞内的活性氧簇(ros)含量减少，即说明多肽具有一定的ros清除能力，且多肽浓度与清除能力呈现一定的量效关系。

酒精为肝细胞损伤的常用造模药物，本发明以hepg2细胞作为模型探讨多肽对肝脏细胞的氧化应激的保护作用。可以发现，在酒精损伤的作用下,代谢酒精的过程破坏了正常的细胞氧化环节,从而使肝脏受到不同程度地损伤。根据现有的研究结果，自由基与衰老、癌症等各种急性或慢性疾病紧密相关，具有自由基清除活性物质的研究和开发逐渐深入，抗氧化多肽与多种跟自由基相关的疾病都有重要的防治作用[duans,caim,dongz,etal.engineeredricehavingalcoholismreliefandliverprotectionfunction,andpreparationmethodthereof,us20150118336a1[p].2015]。

因为dpph自由基结构稳定，化学反应易于控制，已成为体外快速定量测定物质抗氧化特性的较好方法。以上实验设置多肽izp-2浓度为10、20、50、100μmol/l，4个浓度多肽的dpph自由基清除率均在80％以上，具有很强的自由基清除能力，表明多肽izp-2具有很强的抗氧化活性。mtt法结果显示，多肽作用hepg2细胞后，细胞相对活力无显著降低，样品对细胞无毒性作用；0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5mol/l的酒精对hepg2细胞有不同程度地损伤作用，当浓度达1mol/l时细胞活力降低约50％，与空白组具有显著性差异，以此浓度作为酒精损伤细胞模型中的最适浓度；不同浓度多肽对1mol/l酒精损伤的细胞有不同的保护作用，多肽浓度越高，细胞活力越高。

实验中琼脂糖凝胶电泳结果显示，对照组dna被芬顿反应破坏降解，实验组不同多肽浓度可观察到有亮度差异的条带，多肽浓度为100μmol/l时，与对照组存在显著性差异，这说明多肽izp-2对hepg2细胞dna有保护作用。荧光染色结果，荧光强度由大到小依次为：空白组>实验组>对照组，荧光强度越强，ros的水平越高，说明多肽有一定的活性氧的清除能力，此结论与多肽的dpph自由基清除率较高的结论基本相一致。由此可知，湛江等鞭金藻多肽izp-2有较强的抗氧化活性，在一定程度上能保护酒精损伤的hepg2细胞。

酒精依赖和滥用已经成为我国日渐严重的医疗和社会问题,体内酒精的主要代谢场所是肝脏。原发性肝癌是我国的多发病，为最常见的恶性肿瘤之一。肝癌在临床诊断时多为中晚期，手术治愈几率大大降低。近年来，许多研究学者对治疗肝癌的其他新技术和新方法疗效的研究依然不理想，开发新型的药物或功能食品作为肝癌综合治疗的重要方法日益受到重视和肯定。本发明结果表明等鞭金藻多肽izp-2对酒精性肝细胞损伤有保护作用，一定程度上是因为其具有较强的抗氧化活性，能够捕捉和清除体内自由基。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。