本发明属于生物技术领域，涉及一种用于烧烫伤的快速修复液及其制备方法。
背景技术：
有研究报道，严重创伤、大面积烧伤、整形术后的创面覆盖已经成为了一个十分重要的问题，除了患者自体植皮外，人们采用过同种异体植皮，以及其他相关修复材料来覆盖创面，但是无论自体或异体皮肤移植均受到供体来源和免疫排斥反应的限制。亟待寻找一种理想的无排斥反应、促进皮肤损伤修复、促进皮肤再生的天然药物。
干细胞具有独特的分化潜能，能治愈组织难以自愈的创伤，能治疗临床上难以治愈的疾病，干细胞是一种具有自我复制功能和多分化潜能的早期未分化细胞，医学界称之为“万用细胞”。干细胞具有各种各样的生物学特性，最主要的是具有自我更新和多向分化潜能及无限增殖能力。干细胞还具有分泌多种细胞因子的能力，人表皮细胞生长因子(EGF) 、人角质细胞生长因子（KGF）、人成纤维细胞生长因子（FGF）、人血小板样衍生生长因子（PDGF）、纤维连接蛋白（FN）等。
间充质干细胞 (mesenchymal stem cells，MSC) 是一组源于基质的异质细胞群，可以从人体大多数组织获取。大量实验研究显示，间充质干细胞具有表皮细胞分化潜能，可促进受创皮肤的愈合。骨髓源性间充质干细胞由于存在病毒污染的隐患，且随着供者年龄增长，其细胞数量和扩增、分化能力出现明显下降趋势，不适合批量制备。而表皮干细胞是存在于表皮基底层和毛囊根部之间的间隙中一种皮肤干细胞，作为皮肤组织的特异性干细胞，不仅能够维持皮肤新陈代谢的主要功能细胞，还与创面的修复紧密相关，在创面环境中分化为角质化细胞，转移至皮肤创面而修复皮肤创面。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明提供一种用于烧烫伤的快速修复液及其制备方法，该快速修复液能够促进表皮细胞生长，缩短创口愈合时间。使用常规分离获得的干细胞，经分子克隆技术“过表达”人纤维连接蛋白（fibronectin，FN）。利用富含各种自分泌的细胞因子和过表达FN的该干细胞培养上清，应用于烧烫伤患者和久治不愈溃疡创面的修复治疗。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种用于烧烫伤的快速修复液，包括含有表皮细胞生长因子、人角质细胞生长因子、人成纤维细胞生长因子、人血小板样衍生生长因子和纤维连接蛋白干细胞的培养上清液。
本发明所述培养上清液的浓度为大于或等于1×1010个/ml。
本发明提供一种用于烧烫伤的快速修复液在烧烫伤患者和久治不愈溃疡创面的修复治疗中的应用。
本发明提供一种用于烧烫伤的快速修复液在外伤创面、预防疤痕的形成中的应用。
本发明提供一种用于烧烫伤的快速修复液的制备方法，包括以下步骤：
⑴、常规间充质干细胞的分离，获取间充质干细胞；
⑵、利用分子克隆技术，将纤维连接蛋白基因导入步骤⑴获得的间充质干细胞进行过表达；按实验室常规步骤⑴中获得的脐带间充质干细胞进行转染；次日，换新鲜的含800μg/mlG418的opti-MEM换液，继续培养一周；
⑶、收集细胞培养上清，并检测其培养上清液中纤维连接蛋白的表达情况；包括以下步骤：
①将细胞扩增传代至大约二十代后，细胞数量≥1010；
②换成新鲜的无血清干细胞培养基，继续培养3天；
③收集细胞培养上清，混匀；
④取小样用于ELISA检测试剂盒测定上清中FN的表达水平；
⑤根据检测结果，将剩余样品无菌分装为含纤维连接蛋白10μg/每支,并进行冷冻干燥，即为成品。
上述方案中，相关内容解释如下：
纤维连接蛋白（FN）：大量的研究和临床应用已证明，FN在伤口的修复和愈合中起着十分重要的作用，是促进伤口愈合的关键物质；国外已进行了人血浆FN在烧伤、创伤、败血症、感染等方面的应用研究。Nishida通过动物实验证明：将FN涂到大鼠皮肤的伤口表面其愈合速度明显加快。对患有营养型角膜溃疡的病人，以眼药形式对病人进行治疗，用药2天后，表皮便开始大量增生。三周后，溃疡完全消失，未产生疤痕及副作用。向溃疡处涂了FN，可以与伤口处胶原结合形成FN防护层，既有利于上皮细胞的迁移和增殖来修复伤口，又防止病菌的感染。中国医学科学院基础医学研究所等单位的研究结果也证明：将FN与一些介质配合作为外用药膏治疗受机械创伤和烧伤，伤口愈合时间比对照组减少1/3-1/2，无感染、无疤痕、无任何副作用。
表皮细胞生长因子（EGF）：研究发现，EGF能促进上皮细胞、成纤维细胞的增殖；增强表皮细胞的活力；延缓表皮细胞的老化，使肌肤各组成成份保持最佳生理状态；刺激细胞外一些大分子(如透明质酸和胶原白等)的合成与分泌、滋润皮肤，是决定肌肤活力和健康的源泉。
人血小板样衍生生长因子（PDGF）：血小板衍生生长因子PDGF是祛皱抗衰的新秀，作用于真皮层的成纤维母细胞法，达到很好抗衰除皱效果。诱导受损的上皮细胞与内皮细胞分裂增殖；促进血管的形成与再生，为创伤修复提供保证。对于延缓衰老有明显疗效；能刺激血管平滑肌细胞、成纤维细胞、胶质细胞的分裂增生；能够促进肌纤维母细胞产生胶原，尤其是I型及Ⅲ型胶原；促进皮肤细胞的生长与更新，提升皮肤组织的生理活性与新陈代谢水平，增强皮肤细胞的免疫力与自我修复能力。
人成纤维细胞生长因子（FGF）：用于日常摩擦、刮伤、烫伤、摔伤等所致的新鲜创面快速修复；日光照射和滥用低值化妆品及环境污染引起的皮肤发红、褪皮、变薄、敏感等快速修复；皮肤早衰、萎黄、皱纹、松弛等快速修复；皮肤粗糙，气候变化使皮肤干燥、皮肤灰黄、晦暗无光、脱屑等修复。
人角质细胞生长因子（KGF）：能特异刺激上皮细胞的新陈代谢等生理过程，包括细胞的再生、分化和迁移等；组织特异性强，稳定，安全性好。KGF只作用于上皮细胞，通过其特异性受体在刺激上皮细胞生长的同时，能启动上皮细胞对皮下间质组织的协调信号反馈，促进新组织的形成，安全性好，无潜在的副作用；对新生或老化的上皮细胞均有刺激生长分裂作用；具有明显的除疤痕和抗辐射损伤的作用。
本发明使用常规分离获得的干细胞，经分子克隆技术“过表达”人纤维连接蛋白（FN）。利用富含各种自分泌的细胞因子和过表达FN的该干细胞培养上清，应用于烧烫伤患者和久治不愈溃疡创面的修复治疗。涉及一种可用于烧烫伤的快速修复液。该发明简便易行，适用于不同来源的干细胞培养上清的大规模生产，制备“烧烫伤快速修复因子”。并将该类产品应用于烧烫伤患者和久治不愈溃疡创面的修复治疗。为干细胞应用于医学转化事业提供一条新的路径。
具体实施方式
以下通过具体实施方式进一步描述本发明，但本发明不仅仅限于以下实施例。
实施例：
一种用于烧烫伤的快速修复液，包括含有表皮细胞生长因子、人角质细胞生长因子、人成纤维细胞生长因子、人血小板样衍生生长因子和纤维连接蛋白干细胞的培养上清液。
所述培养上清液的浓度为大于或等于1×1010个/ml。
一种用于烧烫伤的快速修复液在烧烫伤患者和久治不愈溃疡创面的修复治疗中的应用。
一种用于烧烫伤的快速修复液在外伤创面、预防疤痕的形成中的应用。
一种用于烧烫伤的快速修复液的制备方法，包括以下步骤：
⑴、常规间充质干细胞的分离，获取间充质干细胞；
以人脐带间充质细胞分离为例，采用改良组织块贴壁法制备人脐带间充质干细胞。
⑵、利用分子克隆技术，将纤维连接蛋白基因导入步骤⑴获得的间充质干细胞进行过表达；委托构建hFN-PUC57真核表达质粒；通过脂质体Lipofectamine®20000包裹已构建好的hFN-PUC57真核表达质粒，按实验室常规用步骤⑴中获得的脐带间充质干细胞进行转染；同时设无质粒的脂质体对照；次日，换新鲜的含800μg/ml G418的opti-MEM换液，继续培养一周；一周后镜下观察发现脂质体对照孔细胞完全死亡，而转染孔细胞有较多的成克隆状生长的细胞团；用不含G418的培养液按常规进行大量扩增。
⑶、收集细胞培养上清，并检测其培养上清液中纤维连接蛋白的表达情况；包括以下步骤：
①将细胞扩增传代至大约二十代后，细胞数量≥1010；
②换成新鲜的无血清干细胞培养基，继续培养3天；
③收集细胞培养上清，混匀；
④取小样用于ELISA检测试剂盒测定上清中FN的表达水平；
⑤根据检测结果，将剩余样品无菌分装为含纤维连接蛋白10μg/每支,并进行冷冻干燥，即为成品。
成品检测方法：
第一步：选择10-12周龄的昆明鼠10只，用电烙铁在其腹壁两侧进行烫伤模型建立。应注意力争让两侧烫伤程度和面积一致；次日开始，一侧用100μl培养用的培养基（新鲜，未曾接触细胞）涂抹，作为对照组；另一侧用100μl的无菌注射用水溶解冻干成品，并进行涂抹，作为实验组。
结果：实验组于第四天及开始结痂，第七天开始脱痂,十天100%痊愈；对照组第四天其创面依然有少许渗出液，十五天尚有3/10的小鼠创面依然未能愈合；
结论：本发明涉及一种可用于“烧烫伤快速修复因子”具有快速修复烧烫伤的功效。
第二步：利用第一步中，检测后三只未能愈合的小鼠，重新使用用100μl的无菌注射用水溶解的冻干成品，并进行涂抹；
结果：三天后即发现创面均结痂，七天后开始脱痂，并愈合；
结论：本发明涉及一种可用于“烧烫伤快速修复因子”具有快速修复烧烫伤的功效，并且对久治不愈的溃疡创面的依然具有修复治疗作用。
在此描述并且要求保护的本发明不限于在此披露的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。预期任何等效方面都处于本发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员而言从前述描述将变得清楚。此类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。