本发明涉及到人体面部美容、护肤保健及其皮肤抗衰老美容化妆品等相关学科领域，具体涉及一种可用于面部皮肤美容、并可经皮渗透和透皮吸收的穿膜肽携带乙酰基六胜肽(穿膜肽一乙酰基六胜肽)纳米乳及其制备方法。
背景技术：
1、皮肤屏障功能及其透皮吸收的相关技术背景
人体皮肤(skin)是覆盖在体表的最大组织器官，它不仅具有保护整个机体、并具有分泌、排泄、感知及代谢等生理功能，而且它也是人体外部最重要的天然屏障，可使机体内各种组织和器官免受外界物理性、化学性、机械性和病原微生物性等物质浸入机体和侵害身体，同时还防止体内的水分、电解质以及其他物质流失体外。事实上，人体皮肤具有的这些生理功能(包括皮肤屏障功能)与其特殊的组织结构密切相关。因为人体皮肤组织由外向内分为三层，即表皮层、真皮层和皮下组织。最外层的表皮层微观结构由内向外又可分为基底细胞层、棘细胞层、颗粒层、透明层和角质层(但面部皮肤组织表皮层尚无透明层结构)。人体表皮厚度约为0.070-0.120mm，主要由角朊细胞和树枝状细胞组成。在表皮层，各种功效成分的经皮渗透和透皮吸收主要与角朊细胞的角化过程及其程度有关。皮肤组织中间层的真皮层，则是位于表皮与皮下组织之间的结构组织，与同属于结缔组织的胶原纤维和弹力纤维共同交织为网状纤维。在电镜下，真皮层呈纤维网状结构，胶原纤维与弹力纤维相互交织、纵横交错，中间充满了无定形的基质，并有皮肤附属器及丰富的神经、血管和淋巴管等。皮肤组织最下层的皮下组织位于则真皮之下，是一种含有大量的脂肪细胞的疏松的组织。在皮下组织中有汗腺、血管、淋巴管神经等。通常，皮肤组织中的真皮层中存在丰富的毛细血管，功效成分如渗透到达真皮后可很快被吸收，而吸收透皮功效成分又能很快进入血液循环。而表皮最外层的角质层由于角质化程度高、含水量低并且被脂质的细胞外基质所包裹，是各种功效成分进入皮肤组织内的主要屏障。因此，各种功效成分经皮渗透和透皮吸收的关键因素之一，主要是在于它们如何透过皮肤组织最外层的角质层。
理论上讲，体外各种功效成分经皮渗透和透皮吸收主要有两种可能的途径：(1)通过表皮途径，透过角质层和表皮各层进入真皮被毛细血管吸收进入体循环，这是功效成分经皮渗透和透皮吸收的主要途径。在这途径中，药物可以穿过角质层细胞到达活性表皮，也可以通过角质层细胞间隙到达活性表皮。由于角质层细胞扩散阻力太，所以功效成分主要由细胞间扩散通过角质层。角质层细胞间是类脂分子形成的多层脂质双分子层，类脂分子的亲水部分结合水分子形成水性区，而类脂分子的烃链部分形成疏水区，极性药物分子经角质层细胞间的水性区渗透，而非极性药物分子经由疏水区渗透。(2)通过毛囊、皮脂腺和汗腺等途径：即功效成分有可能通过人体皮肤组织的附属器，如毛囊、皮脂腺和汗腺等途径经皮渗透和透皮吸收，从而发挥相应的生物学作用和生理学功能。
从美容功能化妆品的功效作用讲，其美容功能的发挥和获得，与其中功效成分的经皮渗透和透皮吸收有着密切关联，而有关经皮渗透和透皮吸收的作用机制目前主要包括以下几种假说：第一，通过物理法作用直接破坏皮肤角质层的完整性，使得功效成分通过皮肤上的破损处直接进入角质层以下，如采用离子电渗促透、电穿孔促透、超声波促透、激光促透、微针促透、热灼伤、磨皮等等；第二，通过化学法作用使得皮肤角质层中类脂双分子层的有序排列发生变化，一定程度上增加类脂双分子层的流动性，药物分子得以从角质层疏松间隔中顺利通过，如二甲基亚砜、氮酮类化合物、脂质体、氨基酸及其衍生物、表面活性剂、树枝状大分子、挥发油类薄荷油、桉叶油、松节油等以及一些天然产物等，另外还有萜烯类、生物碱类、内酯类、醇类等也能使得功效成分渗透进入皮肤；第三，通过物理或化学作用提高皮肤表面角蛋白与水的结合能力，改变皮肤角质层的水合作用，而功效成分随着水合作用渗透进入皮肤；第四，通过物理或化学作用影响皮肤附属器官，如促透剂渗入皮脂腺管内溶解皮脂或腺腔壁上皮脂性分化细胞，降低皮脂腺管内的疏水性，促进离子型药物透过皮肤。促透剂通过软化角质层扩大汗腺和毛囊开口，从而有利于功效成分通过皮肤并进一步吸收。而目前所采用的经皮渗透和透皮吸收的相关方法均与其相关。
经皮传递给药或皮肤外用途径给药虽然遇到人体皮肤天然屏障的技术瓶颈，但它也代表了一种目的药物和功效成分非常有价值的运输通道和渗透途径。经皮传递给药或皮肤外用途径给药相对于其他给药方式更加简单和便捷，也更加安全和方便。同时，这种方式也更少痛苦，还可避免肝脏首过效应，并降低注射针管再利用对疾病传播的风险。尤其是，在医学美容和化妆品领域，加快促进功效成分的经皮渗透和透皮吸收具有重要意义和应用价值。
2、纳米乳及其应用的相关技术背景
纳米乳(nanoemulsion，ne)之概念最早起源于上世纪四十年代，由schulman和hoar等首次提出；1959年schulman又提出将纳米乳(ne)正式命名为“微乳(microemulsion，me)”这一分散体系的概念，由此纳米乳(ne)或称之为微乳(me)的命名一直沿用至今。然而它真正在医药学界将其作为经皮途径给药的药物传递载体应用，其实是在1974年由aitwood博士等学者率先发现、研究、应用和公开报道。上世纪90年代，ne或me作为透皮给药系统已成为医学和药剂学研究的热点，2000年以后，ne或me便成为当今国际上医药学界具有巨大应用潜力的研究领域，2006年起便开始在护肤保健及功效美容化妆品领域正式出现。
ne或me虽其科学形成机制和透皮作用机理错综复杂，但它们的基础体系组成和构成成分主要是由水相、油相、乳化剂/助乳化剂或者表面活性剂/助表面活性剂等伪三元相液体共同组成，将这伪三元相液体按照科学设计和实验确定的适当比例关系，便可在常温条件下采用相关仪器和方法配制、而形成热力学稳定的胶体分散体系。通常情况下ne或me基础体系的外观清澈透明、微带乳光、且分散性好、流动性佳、液体黏度低、各向同性，其粒径分布均匀、直径范围在10～110nm之间。ne或me是迄今为止尚无一种ne或me形成机制能完整和确切地阐述和解释ne或me体系形成的科学理论，诸如ne或me体系负界面张力形成机制、混合膜形成理论、几何排列理论和r比理论等都很难非常科学、完整和准确地解释和阐明之，当今同学科领域普遍认为和认同的负界面张力形成机制可谓目前认为较为科学和合理的理论及其解释。这种负界面张力形成理论的核心及其关键点，在于ne或me在自发和自主形成的动态过程之中，其界面张力机制起着至关重要的作用，即乳化剂或表面活性剂能够引起水包油(o/w)界面张力的下降，加入适量助乳化剂或助表面活性剂又能促使o/w界面张力继续下降，直至达到界面张力为负值即负界面张力。这种负界面张力促使体系自发扩张界面，从而不断增加乳化剂或表面活性剂和助乳化剂或助表面活性剂吸附在界面，直至界面张力逐步平衡并达到界面张力值回复至零。正是由于上述瞬间出现的负界面张力形成，从而诱导体系界面自发扩张和自主形成了ne或me。而当ne或me逐步形成聚结时，它的界面面积也逐步减小，进而又将形成新的负界面张力，这种新的负界面张力又促使体系界面张力值回复至零，从而抗衡ne或me的聚集，以维持和支撑ne或me的稳定性。
随着ne或me形成机制及其学术理论的不断阐明，它们已被认为是目前最为优良的经皮药物或功效成分传递载体之一。它们不仅具备诸多应用特点和作用优势，可以提高不同属性功效药物成分的溶解度、融合度和承载量，而且还可通过其伪三元相液体形成的ne或me体系对表皮角质层、颗粒层、棘细胞层及其皮肤附属器等有效作用，进而促进、增加和加快不同属性功效药物成分的经皮渗透和透皮吸收，从而发挥功效药物成分最大的生物学作用。功效成分的高效生物学作用与其生物利用度及其经皮渗透和透皮吸收量密切相关。因此，以ne或me作为高效经皮给药传递载体，目前不仅已广泛应用于诸多新型药物制剂之中，而且也开始在一些高档美容护肤功效化妆品中应用。包括皮肤美白、祛斑、修复、抗皱、营养、保湿、防晒、脱敏、抗敏、抗衰老、抗氧化、镇痛麻醉、止血纳米乳等，使功效纳米乳在皮肤护理、美容保健和医学美容及微创美容整形中应用出现了一个新的高峰和流行趋势。
3、穿膜肽及其应用的相关技术背景
穿膜肽(cell-penetratingpeptide，cpp)是目前尚未在皮肤美容化妆品应用的可经皮给药传递载体，它在医药领域是一类能确定携带目的蛋白或多肽类药物等功效成分并能促进其透过皮肤的短肽，这种短肽具有携带功能和经皮传递功能，可谓目前携带多肽类功效成分经皮渗透和透皮吸收最理想的经皮传递载体之一。它目前尚未见对皮肤有任何损害或刺激及过敏反应，本身也无单独的药理活性和作用，且它有相对稳定的分子结构和理化性质，并有与其所携带目的蛋白或多肽类药物等功效成分良好的连接和较好的匹配及相容性；它对靶部位起效较快、作用较久等特点和优势，是目的蛋白或多肽类药物等通过皮肤表面途径进入全身循环的又一简单、方便和有效的经皮渗透和透皮吸收途径之一，也是对传统给药方式和透皮途径另一种有益补充，未来可望在一些高新、高档、高效功能型皮肤抗老化、护肤保健及美容化妆品等制剂研发和应用中发挥作用，具有广阔的开发应用前景和可期的社会经济效益。
穿膜肽或透皮肽的生物学功能、天然构象、分子结构和氨基酸组成基本类似。有文献报道，穿膜肽可通过携带生物大分子的目的药物(蛋白、多肽、核酸及更大的颗粒聚合物等)直接穿透细胞膜而进入不同类型细胞中，甚至可携带某些生物大分子物质直接穿过血脑屏障。对穿膜肽作用机制研究发现，它不仅在37℃可被活细胞主动或被动摄取，且能在4℃时进入活细胞内，这种穿膜机制被认为它是一个非受体、非能量依赖和非胞吞的动力学机制。近年来，有学者提出一种新的穿膜机制，认为其入胞效应是基于网格蛋白所介导的内吞作用，网格蛋白包裹内凹膜使之从细胞膜中脱离并直接进入细胞质，这一过程可能与细胞表面带负电荷的葡萄糖胺聚糖与带有正电荷的穿膜肽发生正负电荷相互吸引和作用，而这种穿膜肽表面带正电荷的氨基酸残基与细胞膜表面带负电荷的蛋白聚糖或氨基葡聚糖(如硫酸乙酰肝素、肝素等)直接静电作用是其穿膜效应及被细胞摄入内所必需的关键因素之一。有关穿膜肽的穿膜机制用于解释穿膜肽结合分子量大于3万道尔顿的目的药物的跨膜现象被认为是一种非特异性大囊泡形成的脂筏性细胞内吞效应，且这种细胞内吞作用由肌动蛋白丝引发和介导。而富含精氨酸残基的穿膜肽中的聚精氨酸可与小分子目的药物直接结合，并通过其静电作用或氢键连接效应促使其穿透胞膜而进入细胞内，当聚精氨酸与细胞表面负电荷结合后可形成离子对，并在膜电位影响下易位并跨过胞膜进入胞质，然后再将穿膜肽结合的目的药物释放到胞质中发挥其生物学作用。
穿膜肽可携带大分子蛋白或多肽类药物等功效成分穿透具有双脂质结构的胞膜进入细胞中，而透皮肽则可携带同样或类似的目的药物或功效成分穿过表皮层进入真皮内。机体生物膜及细胞膜均为双层脂质结构，皮肤最外层脂质膜虽由脂肪酸、胆固醇和神经酰胺组成，但实际上也是脂质且均带负电荷，这种结构同样适合穿膜肽的作用机制。透皮肽很可能是为这些目的蛋白或多肽等大分子功效成分或高分子药物创建一个短暂性开放的经皮传递通道使其达到全身血液循环。曾有学者将环孢霉素共价连接到细胞穿膜肽聚精氨酸七聚物，发现其经皮渗透和透皮吸收这种药物的能力和控制急性炎症反应的效果均有显著提升，而未经穿膜肽修饰的环孢霉素的经皮渗透和透皮吸收和抑制急性炎症反应的能力均相差甚远。另有研究也发现，将特定模拟蛋白或多肽成分与富含精氨酸的胞内载体肽非共价结合后，这些胞内载体肽在非共价结合形式下也同样具有增强运输及促进这些大分子模拟蛋白或多肽药物的经皮渗透和透皮吸收能力。这类具有穿透细胞膜和透皮增强效果的多肽亦称为蛋白转导域不仅能穿透细胞膜、并还能携带某些目的药物进入皮肤组织之中。透皮肽和穿膜肽(转导域)有一共同结构特征，即均富含有带正电荷的精氨酸和赖氨酸残基，且均能运输结合肽、寡聚核苷酸和脂质体等穿过哺乳动物细胞膜。这种特殊的富含精氨酸的结构还可能通过其精氨酸侧基与细胞膜中的带电成分因电荷作用而产生直接穿过皮质膜的作用，它通过瞬时打开皮肤表面的磷脂膜，形成一个极性瞬时通道，使携带功效成分经皮渗透和透皮吸收至皮内，从而发挥功效成分的生物学作用和生理学功能。而穿膜肽等碱性蛋白转导域则被认为是依靠细胞的胞饮方式连同共价连接的多肽或蛋白药物一起进入哺乳动物细胞内，而这种细胞胞饮的内吞形式则可能是依赖于细胞膜凹陷、膜上受体和网格蛋白等实现的。不仅如此，目前还有学者将体内噬菌体展示技术应用于透皮增强剂的研究，并找到了一条由11个氨基酸组成的能高效运输蛋白质类药物透皮的活性短肽。将该短肽与胰岛素在生理盐水中简单混合并涂于糖尿病模型大鼠皮肤上便可产生良好的降糖效果。此外，这种短肽还能帮助其他多种蛋白或激素透过皮肤屏障进入皮肤组织中。初步机理研究显示，这种短肽可能在作用于皮肤组织，并通过其正负电荷结合后暂时性打开皮肤屏障的脂质膜及其相应通道(包括细胞间隙和毛囊途径等)后携带大分子蛋白或多肽药物透过皮肤而进入循环。另有学者发现一条能增加皮肤通透性的天然成孔肽，其与皮肤表面活性剂协同应用时能增强皮肤的通透性和渗透性。另有学者设计用多肽固相合成法人工合成了该肽类似物，并针对已有透皮肽进行分子结构改造，即改变透皮肽中氨基酸残基的组成，运用赖氨酸或精氨酸扫描，增加其阳离子数量及改变位置，也可达到提高经皮渗透和透皮吸收效果的效果。由此，研究者认为，原本无法或难以经皮给药的大分子蛋白及多肽类和核酸类药物在共价连接到细胞穿膜肽聚精氨酸七聚物时，均有可能穿透皮肤质膜的功能和效果，而且有可能协助经过共价连接的那些看似经皮渗透和透皮吸收率很低或理论上认为难以经皮渗透和透皮吸收的蛋白或多肽类功效成分和目的药物也可能进入皮肤组织而发挥良好的生物学作用和临床治疗效果。这种理论依据和实验结果，不仅为经皮给药提供了一种创新途径，而且也给功能型美容化妆品、特别是某些含有大分子生物活性功效成分(蛋白质、多肽、酶、核酸类)等功能型美容化妆品的研发和应用提供了一个全新思路和研究方法及新型产品。
4、美容胜肽及其应用的相关技术背景
肽类(peptide)也有学者称之为胜肽，主要分为多肽和寡肽，其均是由两个或两个以上氨基酸缩合并以肽链或酰胺键相连的一类生物活性物质，它们是蛋白质的中间产物，也是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的片段。肽类物质与生物体内其它物质相比，其最大的特点是它们具有很高的生物活性和生物多样性，因此也被称之为生物活性多肽。肽类或胜肽均是由20余种天然氨基酸通过肽链以不同的排列方式和形态构成，即从两肽到多肽的复杂线性和环形结构形成，它们均是源于蛋白质中间产物及天然构象的多功能化合物，也是构成生命的最基本和重要的物质之一，它们以天然生物活性的作用方式在机体发挥着重要的生物学效应，且体内各种生命活动、代谢进程和生理机能等，也几乎都是受特定氨基酸序列组成的活性多肽或蛋白质所主导和调控。而且，多肽或胜肽的种类、含量和生物活性与人体皮肤组织结构和功能也密切相关，并在一定条件下发挥着十分重要的生物学作用和生理功能，如皮肤组织及其细胞分裂、增殖、分化、趋化、迁移、聚集、新生血管生成、微循环、色素形成以及皮肤组织蛋白合成及调控等。
在医学美容和化妆品及精细化工领域，通常将由两个氨基酸组成的寡肽称为二胜肽，而由3个氨基酸组成的则称之为三胜肽，依次类推，可分为四胜肽、五胜肽、六胜肽......，等。特别是随着多肽合成技术不断发展以及不同数量氨基酸所组成的胜肽对皮肤作用及其功能被不断揭示，使各种结构的胜肽逐步开始用于面部美容和护肤保健及延缓皮肤衰老与抗皮肤老化之中，尤其是一些生物学作用独特、氨基酸组成数量较少、分子结构简单、分子量小、十胜肽以下的胜肽，如五胜肽、六胜肽、七胜肽、八胜肽、九胜肽及其衍生物棕榈酰五肽-3、乙酰基六肽-3、乙酰基四肽-5、棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-3和肌肽等应用美容化妆品中不断问世，并风靡一时、风光一阵。
然而，20世纪八十年代曾有学者提出过蛋白质水解片段或者蛋白碎片的概念，亦即将大分子蛋白质物质通过蛋白酶水解或者发酵工程方法将其水解为多肽或者寡肽。不过由于这些大分子蛋白质经水解后降解的产物复杂、衍生的多肽因分子量不一其种类繁多。由于难以选择多肽片段和序列，则多肽的分类和种类均难以确定，主动选择和明确多肽名称困难，单一多肽的提纯更有难度。因此这些水解或发酵的蛋白质分解产物或衍生物，实际上就是各种蛋白质、多肽和氨基酸的混合物尚不能称之为真正的美容胜肽纯品。真正意义上与皮肤美容相关的那些美容胜肽，最早可追溯到1973年由lorenpickart博士等人发现的铜肽(亦称之为铜胜肽)，这种铜肽不仅可减少疤痕组织生成，同时还能刺激受损皮肤组织主动愈合，而且美国学着还发现了这种铜胜肽可改善皮肤衰老状况，他们将它应用于人体皮肤修复、抗皱及头发增生等。此外，还有一些美容胜肽，主要包括：(1)信号类胜肽：棕榈酰三肽-1，棕榈酰三肽-5，棕榈酰五肽-3，肉豆蔻酰五肽-11，棕榈酰六肽，六肽-9等；(2)神经递质抑制类胜肽：二肽类蛇毒素，五肽-3，乙酰基六肽-3，乙酰基八肽-1等；(3)承载类胜肽：铜胜肽等；(4)其他抗皱类胜肽：棕榈酰二肽-5，六肽-8或六肽-10等。其中应用最广泛、作用最突出的六胜肽，亦称之为乙酰基六胜肽-3，其商品名为argireline，又被称为类肉毒杆菌毒素，它是由6个氨基酸组成的胜肽，由于它能减缓肌肉收缩力，让肌肉松弛，减少或抑制动态皱纹的发生与消除细纹。
5、类肉毒毒素(六胜肽)及其应用的相关技术背景
六胜肽目前也被医学美容界称之为“类肉毒杆菌素”或“类肉毒毒素”，其人工合成衍生物为乙酰基六胜肽-3，英文名称是acetylhexapeptide-3，其商品名是argireline，它是目前美容胜肽之中应用最广泛的皮肤抗皱功效成分之一。六胜肽是一种化学合成的皮肤外用抗皱功效成分，其皮肤抗皱机制与注射抗皱所使用的a型肉毒毒素基本相同，即六胜肽类似面部皮肤肌肉的松弛剂，能选择性作用于外周胆碱能神经(运动神经)末稍，在神经肌肉接点突触处(作用最强点)抑制突触前膜释放神经介质乙酰胆碱，有效阻断神经介质的传递，而引起肌肉松弛性麻痹，使肌纤维不能收缩，肌肉张力下降，肌痉孪缓解，面部表情肌无法发挥作用，从而使脸部肌肉放松，减少或消除面部表情肌运动形成的皱纹，达到平抚动态纹、静态纹及细纹的目的。同时，类肉毒毒素(六胜肽)还能有效预防儿茶酚胺过度释放所产生的皱纹，减少面部肌肉重复牵动所形成的皱纹，从而有效舒缓并抑制额头抬头纹、鱼尾纹、眉间纹、鼻横纹、鼻背纹及皱纹周边肌肉的收缩与活动，帮助肌肉放松，使肌肤弹性组织回复柔顺平滑的线条，进一步减少或消除脸部细纹。随着年龄增长，老化皮肤的胶原纤维变直，纤维蛋白束与皮肤表而越加平行，皮肤伸展余地大为减少，弹性减低，皮肤变松垂无张力而出现皱纹。lipotec公司最早研发的argireline早在2002年获得了国际专利，并证实这种argireline能局部阻断神经传递肌肉收缩信息，影响皮囊神经传导，使脸部肌肉放松以抚平动态纹、静态纹及细纹。lipotec公司甚至认为argireline应用后的效果可与a型肉毒毒素媲美，却又避开了注射a型肉毒毒素的痛苦和使用成本高昂的缺点。几乎在同时，sederma公司也出品了也是目前应用最广的美容抗皱胜肽---棕榈酰五胜肽-3(palmitoylpentapeptide-3)，但该美容胜肽与六胜肽的抗皱作用机制有所不同，它是通过在局部刺激和促进i型和iii型胶原蛋白和纤维黏连蛋白的生成，从而增加皮肤厚度以及减少细纹。乙酰基六胜肽(argireline)所以具有对抗面部动态皱纹的功能，主要是因为它能在面部阻断神经传递肌肉收缩信息，影响皮囊神经传导，使脸部肌肉放松，以抚平动态纹、静态纹及细纹，甚至有学者认为，它经皮外用可避开以往肉毒毒素必须注射的风险和使用成本偏高的不足和缺陷。因此，乙酰基六胜肽(argireline)是美容胜肽里应用最广泛的产品之一，也是迄今为止一直被美容化妆品行业认为是最具应用潜力和前景及生命力的皮肤抗衰老及面部抗皱化妆品之一。目前使用的六胜肽大多是由6个氨基酸合成的胜肽，人工合成时可以芴甲氧羰基(fmoc)作为a氨基的保护基，通过其对酸的稳定性及易与碱作用的特点，可应用碱性化合物作脱保护剂。故采用fmoc作为氨基酸的保护基，将六胜肽的第一个氨基的羧基以共价键的形式与固体载体氨基树脂(rjnkamidembharesin)相连，以形成产物fmoc-arg(pbf)-rinkamidembharesin为多肽合成的起点，在载体树脂上使要合成的多肽进行逐个延伸缩合接肽反应，最终合成er-6-nh2肽链，将其酸解脱去树脂可得到目标产物的粗品，然后再对粗品进行鉴定和纯化可得到最终产品。
6、相关技术目前存在的缺陷或不足：
皮肤外用药物的最佳治疗效果和功能型化妆品的最佳美容功效均与其中添加的目的药物和功效成分密切相关，而这些添加的目的药物和功效成分的关键节点只有最大限度经皮渗透和透皮吸收才有可能发挥最佳的生物学作用和应用效果。目前国内外市场上作为皮肤外用药物和美容化妆品用途的凝胶剂不仅屡见不鲜，而且种类繁多，举不胜举。虽然，这些凝胶剂与传统的乳剂和膏霜剂相比具有某些特点和优势，也完全符合人体皮肤外用和面部涂抹的质量标准，并也完全符合一般凝胶剂的良好外观和理化特性，而且外涂的舒展性和舒适度也都很好，但这些普通的凝胶剂，不仅其粒径较大，而且也不具备促进其中功效成分和药物经皮渗透和透皮吸收的特点，因此，实际应用时是很难达到预期理想的治疗作用和美容功效。
纳米乳作为目前认为良好的经皮给药传递载体之一，其理论研究和应用研究方面的成果不断问世，有些甚至已取得了阶段性成果和突破性进展，特别是纳米乳分散系统的粒径超微、并已达到纳米级标准、且微粒分布均匀、分散良好、增溶和包容效果俱佳，尤其是，它加快促进其中目的药物和功效成分经皮渗透和透皮效果较好等特点和优势，备受人们关注和重视、喜爱和青睐。然而，目前最为经典的纳米乳基础体系大多数是由油相、水相、表面活性剂/助表面活性剂等伪三元相液体组成，形成的纳米乳体系在皮肤外用和面部涂抹后的明显油腻感、些微刺激性和刺痛感、不悦异味、涂抹欠舒适以及制剂长期存放稳定性欠佳等不足或缺陷突出，特别是，为了达到并维持界面张力为负值即负界面张力而不断增加乳化剂或表面活性剂和助乳化剂或助表面活性剂吸附在界面，使经典纳米乳基础体系中含有较高浓度表面活性剂/助表面活性剂，此纳米乳液相对敏感性皮肤刺激性，尤其是对诸如蛋白类或多肽类功效成分的破坏性等，已成为纳米乳在皮肤外用制剂和美容化妆品领域应用的技术瓶颈和主要障碍。而且，纳米乳的经皮渗透和透皮吸收效果还受到诸多因素影响和干扰，包括其组成成分、构成比例、功效成分种类和载药量及渗透浓度梯度等，这也是目前纳米乳制剂需要解决和克服的诸多问题和难题。
传统皮肤抗皱化妆品中功效成分功大多是一些从动植物和海洋生物中生化提取的营养剂和保湿剂等，而具有一定生物活性的皮肤抗皱胜肽(六胜肽)的添加，为皮肤抗皱生物化妆美容品提供了全新研发方向和思路。目前六胜肽已作为肉毒毒素替代品用于高档美容化妆品及皮肤美容和抗皱产品中，它作为类肉毒杆菌素虽是目前美容胜肽中效果较为肯定、且应用最广、分子量较小的美容胜肽之一，如经皮给药确实可到达相应作用部位，其应用于面部皮肤一定时间后可通过抑制snare接受体合成，抑制肌肤儿茶酚胺和乙酰胆碱过度释放而发挥局部阻断神经传递肌肉收缩，影响皮囊神经传导，使面部肌肉松弛，从而抑制或减轻动、静态皱纹及面部细纹等作用。但在其应用中仍存在一些缺陷和问题，如它作为水溶性多肽虽分子量很小，但仍难透过皮肤发挥其应有的生物学效应，即使采用一些能促进其透皮吸收的促渗透剂协助，仍无法达到理论上的预期效果，临床表现为抗皱反应较为缓慢，疗效不显著。而且，六胜肽所属肽类结构使其在普通水溶性介质或水剂液体中稳定性较差，其功能基团和活性中心在水剂中易降解破坏。将它添加至目前传统制剂(如水剂，精华液，乳剂，霜剂，膏剂，凝胶剂等)应用在皮肤表面或进行面部涂抹，均难以经皮渗透和透皮吸收等问题，特别是，六胜肽在皮肤应用时所要求作用的靶部位更深，其经皮渗透和透皮吸收的效果必须更好才能发挥其应有的生物学作用和生理学功能。
透皮肽或穿膜肽均属于肽类结构，其在水溶性介质或液体制剂之中的稳定性同样较差，在水剂之中也容易降解或破坏；而且单纯的透皮肽或穿膜肽其本身并无特别的药理活性和疗效作用；另外，透皮肽或穿膜肽必须连接或携带某些高效的目的药物和功效成分并与之匹配才能发挥相应的生物学效应和生理学功能。特别是，将其作为皮肤美容化妆品中功效成分连接之载体应用目前尚未见报道，且其连接或携带皮肤美容功效成分之后在体外经皮渗透和透皮吸收的实际效果等实验研究目前也尚未见报道。
为此，本发明设计一种既可减少上述应用技术不足或缺陷，又适合现代皮肤美容应用，且还可更好经皮途径渗透和透皮吸收的制剂，即一种穿膜肽携带乙酰基六胜肽(穿膜肽-六胜肽)纳米乳及其制备方法。
技术实现要素：
本发明的目的主要是针对背景技术中存在的诸多不足或缺陷加以弥补、改进、提高和创新。本发明的具体内容是提供一种不仅可经皮渗透和透皮吸收、且分子结构和生物活性更加稳定的一种穿膜肽携带乙酰基六胜肽(穿膜肽-乙酰基六胜肽)纳米乳及其制备方法。为了实现上述目的，本发明采用的具体设计和技术方案如下：
1、本发明设计
本发明技术分为两部分：第一，完成穿膜肽携带乙酰基六胜肽(穿膜肽-乙酰基六胜肽)分子结构和人工合成方法的设计与合成；第二，完成穿膜肽携带乙酰基六胜肽(穿膜肽-乙酰基六胜肽)纳米乳原料组成及其比例与制备方法的设计与制备。
2、本发明技术
按照本发明的设计思路，本发明的一种穿膜肽-乙酰基六胜肽纳米乳及其制备方法采用的技术方案和具体实施方式分为两部分。
第一部分是本发明的穿膜肽携带乙酰基六胜肽(穿膜肽-乙酰基六胜肽)分子结构和人工合成方法及分析鉴定：
本发明采用化学固相合成法人工合成的穿膜肽-乙酰基六胜肽的氨基酸分子结构序列为ac-eemqrrygrkkrrqrrr。其人工化学合成路线及工艺流程为：选用树脂载体为二氯树脂，其树脂上的活性位点为卤素氯，多肽固相合成首先需要把树脂溶胀，再将第一个氨基酸的c端羧基与树脂上的活性位点氯反应，待首个氨基酸接在树脂上以后，进行脱水缩合接第二个氨基酸，缩合完成后再脱fmoc保护。按照设计的氨基酸序列重复操作，依次接完其余的氨基酸并完成n端的乙酰化，最后用切割试剂把多肽从树脂上切割下来，形成裸露的羧基。其具体制备方法如下：(1)树脂的溶胀：称取二氯树脂1.5g(合成目的肽为0.08mmol，所用二氯树脂的取代度为0.4mmol/g，按照7.5倍过量，则所需的二氯树脂质量为0.08/0.4*7.5＝1.5g)，放入反应柱里，然后在反应柱里加入20毫升dcm，振荡30min，活化待用。(2)连接首个氨基酸：通过沙芯抽滤掉dcm溶剂，加入1.05倍树脂摩尔量的fmoc-l-arg(pbf)-oh，再加入10倍树脂摩尔量的diea，最后加入少量的dmf溶解，振荡1h。反应完后用dmf和dcm交替清洗6遍。(3)脱保护：加入20毫升20％哌啶/dmf溶液，5min后抽掉。再加入20毫升20％哌啶/dmf溶液，振荡15min。(4)分析检测：抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，吡啶，苯酚各一滴，105℃-110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应，可以继续接下一个氨基酸，如果不变色则为阴性，需要重新脱保护。(5)首次清洗：依次用15毫升dmf，15毫升甲醇，15毫升dmf分别清洗两次。(6)缩合反应：加入3倍树脂摩尔量的fmoc-l-arg(pbf)-oh，3倍树脂摩尔量的hbtu，均用少量的dmf溶解，立刻加入10倍树脂摩尔量的diea，反应30min。(7)第二次清洗：依次用15毫升dmf，15毫升甲醇，15毫升dmf分别清洗两次。(8)肽链的延伸：按以上方法重复操作，依次接完剩余的氨基酸。
表1、人工合成过程中所用到的氨基酸情况
(9)乙酰化(ac)反应和肽的缩合：乙酰化是穿膜肽-乙酰六胜肽最后一个部分，在反应柱里加入3倍树脂摩尔量的乙酸酐，3倍树脂摩尔量的吡啶，反应30min。ac接上后，整条肽的合成就反应完成了。进入最后的收缩阶段，由于ac没有fmoc保护，所以此处就无需脱保护了。肽的收缩：用dmf洗涤反应3遍，dcm洗涤反应3遍，甲醇洗涤反应3遍，最后抽干肽树脂。(10)氨基酸侧链脱保护与树脂切割：穿膜肽-乙酰六胜肽的氨基酸序列为ac-eemqrrygrkkrrqrrr，其中含有的侧链保护基有：pbf、trt、boc、tbu，这几种保护基在酸性条件下不稳定，而切割树脂用的是tfa，所以脱保护和切割树脂可以同时进行。配置切割液15ml，其中各组分的体积比为：tfa(94.5％)、水(2％)、edt(2.5％)、tis(1％)。将树脂装入烧瓶中，恒温(30℃)振荡2h。将裂解液用氮气尽量吹干，然后倒入离心管中，缓慢倒入乙醚。封口并放入离心机中离心5min，倒掉上清液，下方为白色固体。再用乙醚洗6次，然后常温挥干，即得粗品肽。(11)高效液相(hplc)的纯化：①溶解：将粗品肽放入器皿中，用30-50ml浓度为50％的乙腈水溶液完全溶解，可以稍微超声2min。②过滤：用0.45μm滤膜过滤溶解液。③分析：取3μl溶液用分析级hplc分析粗品以便于后续制备。流动相是水和乙腈，时间30min，梯度洗脱，先将hplc用起始梯度平衡5min然后进样，起始梯度为：水95％，乙腈5％，结束梯度为：水5％，乙腈95％。④制备：将溶解好的样品做进样准备及纯化。制备hplc平衡10min，起始梯度为：水95％，乙腈5％，结束梯度为：水25％，乙腈75％，梯度时间40min。收集从检测器出来的样品。⑤鉴定：将收集下来的样品进行取样并进行纯度和质谱的鉴定分析。(12)分析鉴定：①质谱鉴定分析：利用esi-ms进行质谱鉴定，即测得合成肽的实际分子量，并将其实际分子量数值与其理论分子量2431.8进行对比分析，质谱分析实际测得的分子量误差均在允许误差正负2内或者两者分子量完全一致，即可证明成功合成了穿膜肽-乙酰六胜肽。②hplc分析：采用lc3000型高效液相色谱仪，色谱分析条件：c18，反相，4.6mm*150mm，梯度洗脱。起始梯度为5％a+95％b，结束梯度为30％a+70％b，时间是30min，流速为1.0ml/min，紫外检测波长为214nm，进样量为10μl。流动相a为0.1％三氟乙酸在100％乙腈，流动相b为0.1％三氟乙酸在100％水。观察其纯品经hplc分析分析最高峰及面积最大峰，以检测出穿膜肽-乙酰基六胜肽达到的纯度。
第二部分是一种穿膜肽携带乙酰基六胜肽(穿膜肽-乙酰基六胜肽)纳米乳的原料组成比例和制备方法及透皮试验：
1)一种穿膜肽-乙酰基六胜肽纳米乳及其制备方法，其特征在于它是由以下原料组成及其重量百分比范围如下：
肉豆蔻酸异丙酯7.32％-10.75％、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯17.53％-20.12％、聚甘油脂肪酸酯5.84％-6.71％、重蒸馏水64.54％-68.97％、穿膜肽-乙酰基六胜肽0.01％-0.2％。
2)根据权利要求1所述的一种穿膜肽-乙酰基六胜肽纳米乳制备的各原料优选的最佳重量百分比是：
肉豆蔻酸异丙酯7.66％、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯17.53％、聚甘油脂肪酸酯5.84％、重蒸馏水68.87％、穿膜肽-乙酰基六胜肽0.1％。
一种穿膜肽携带乙酰基六胜肽(穿膜肽-乙酰基六胜肽)纳米乳的制备方法如下：
1)按照穿膜肽-乙酰基六胜肽纳米乳原料的配比，将肉豆蔻酸异丙酯作为油相(a)备用；
2)按穿膜肽-乙酰基六胜肽纳米乳原料的配比，将乙酰六胜肽、适量蒸馏水混合使之完全溶解，再加蒸馏水使之作为水相(c)备用；
3)按穿膜肽-乙酰基六胜肽纳米乳原料的配比，将辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯、聚甘油脂肪酸酯等于3∶1的比例，置于另一容器之中，充分搅拌均匀，使之形成s/c混合物(b)备用；
4)再按油相(a)∶s/c混合物(b)∶水相(c)等于7.66∶23.37∶68.97的比例，分别取s/c混合物(b)、水相(c)依此加入油相(a)容器中；
5)在室温条件下，选用定时恒温磁力搅拌器，并以200rpm·min-1的转速磁力搅拌30min，即可得到这种穿膜肽-乙酰基六胜肽纳米乳。
6)经过马尔文粒径分析仪的检测结果显示：马尔文粒径测定结果显示乙酰基六胜肽纳米乳的平均粒径介于24.62-163.2nm之间。
7)franz法透皮实验研究显示：穿膜肽-乙酰基六胜肽纳米乳中穿膜肽-乙酰基六胜肽的透皮率为0.066％-0.18％。
3、本发明特征
(1)我们根据医用或药用穿膜肽或透皮肽具有基本类似的理化性质和生物学特点，即其理化性质稳定、穿膜或透皮效果明显等生物学特点，成功将一种具有穿皮和穿膜效果俱佳的穿膜肽与乙酰基六胜肽连接并人工合成了这种具有经皮渗透和透皮吸收作用的穿膜肽携带乙酰基六胜肽(穿膜肽-乙酰基六胜肽)。
(2)我们将这种目前国内外诸多研究证实既有穿透皮肤表面屏障质膜、又有穿过细胞膜双脂质层结构的穿膜肽携带乙酰基六胜肽(穿膜肽-乙酰六胜肽)作为可添加到皮肤美容化妆品之中的生物活性成分及功效目的多肽，然后再将其与目前研究证实并被普遍认为本身就具有高效经皮给药传递系统之一的纳米乳体系匹配使用，并同时发挥穿膜肽和纳米乳的双重效应，使它们之间科学合理地发挥共济协同和联合增效作用，从而可使目前普遍公认具有良好的皮肤美容抗皱效果的美容六胜肽形成更好的经皮渗透和透皮吸收的态势和功能。
(3)为了克服大多数多肽类物质(包括美容胜肽及六胜肽等)在水溶液或其它液相中的相对不稳定性及其易于降解并失去其生物学活性及功效作用的特点，我们不仅采用经过乙酰化的乙酰基六胜肽替代裸的六胜肽，且将其用穿膜肽连接或修饰，而且还将穿膜肽-乙酰基六胜肽制备成纳米乳剂型，即穿膜肽-乙酰基六胜肽纳米乳，使其中的美容功效成分乙酰基六胜肽既能维持其良好的生物学活性和生理学功能，又能保持其良好的经皮渗透和透皮吸收功能。而且，比较单纯的水剂，穿膜肽-乙酰基六胜肽在纳米乳制剂之中更不易降解，其生物活性及保存时间和有效期限较其在单纯水剂中更长和更久。
(4)由于这种穿膜肽-乙酰基六胜肽纳米乳是基于纳米乳基础体系和纳米乳现代技术制备，因此，其较常规或传统方法制备的液体制剂的粒径更微小、分布和分散更均匀，其外观和感官更优良，外用涂抹更舒适。
(5)由于这种穿膜肽-乙酰基六胜肽纳米乳，既采用了高效经皮传递载体纳米乳基础体系，其功效成分乙酰基六胜肽又结合或连接了一种既能穿皮、又能穿膜的穿膜肽，因此，它具有更好的经皮渗透和透皮吸收效果。
(6)由于这种穿膜肽-乙酰基六胜肽纳米乳具有更好的经皮渗透和透皮吸收效果，因此其功效成分乙酰基六胜肽的美容生物学功效将可更好发挥和体现。
4、本发明创新点
(1)本发明所设计和合成的可添加到美容化妆品中的穿膜肽连接并携带乙酰基六胜肽(穿膜肽-乙酰基六胜肽)及将其作为人体皮肤美容功效成分和目的多肽应用，目前国内外尚未见报道、也无同类产品，因此，本发明具有创新性。
(2)本发明所设计和制备的伪三元相纳米乳基础体系中添加的含有穿膜肽连接并携带乙酰基六胜肽(穿膜肽-乙酰基六胜肽)的美容功效纳米乳，使乙酰基六胜肽活性更稳定，经皮渗透和透皮吸收效果更好，目前国内外尚未见报道、也无同类产品，因此，本发明具有创新性。
5、本发明的有益效果
(1)本发明的美容功效成分六胜肽为目的多肽，其分子结构经过乙酰化修饰成乙酰基六胜肽，在美容化妆品中应用理化性质应更稳定，生物学作用应更好。
(2)本发明将穿膜肽与乙酰基六胜肽连接，使得目的功效成分之乙酰基六胜肽经皮渗透和透皮吸收作用可提高，实际应用时的美容效果可提升。
(3)乙酰基六胜肽添加至以往传统制剂(如水剂，精华液，乳剂，霜剂，膏剂，凝胶剂等)中面部外用，均难以达到预期经皮渗透和透皮吸收效果。而本发明将穿膜肽与乙酰基六胜肽连接，并将其与高效经皮传递载体纳米乳体系进行匹配与组合，不仅穿膜肽可发挥穿皮效果，且纳米乳体系也可发挥经皮传递乙酰基六胜肽的促渗作用，两者优势互补、作用相济，可使目的药物和功效成分之六胜肽的经皮渗透和透皮吸收作用更好，其实际应用时的美容效果理应更佳。
(4)本发明纳米乳中的基础纳米乳体系已经过伪三元相图优选，采用的水相比例有所提高、油相比例有所降低，以此新的空白纳米乳基础体系进行配制，其质地更细腻、分散更均匀、颗粒更微小、粒径达纳米级标准、纳米微粒分布良好，提高了其面部涂布的舒适性。
(5)本发明的纳米乳类型均为水包油型，可使穿膜肽携带目的药物和功效成分之乙酰基六胜肽的溶解性、增溶性和包容性效果更好。
(6)本发明配制的纳米乳体系之中，其表面活性剂/助表面活性剂或者说乳化剂/助乳化剂添加剂量较以往纳米乳文献(包括专利文献)中使用的表面活性剂/助表面活性剂或者说乳化剂/助乳化剂添加剂量明显减少，因此其面部涂抹的刺痛感和皮肤刺激性明显下降、使用安全性明显提高。
(7)本发明的纳米乳类型不仅为水包油型，而且其中伪三元相中的油相和表面活性剂/助表面活性剂的添加比例也均明显减少，因此，以往纳米乳的油腻感和异味感基本消除，面部涂抹的满意度明显提高。
(8)乙酰六胜肽和穿膜肽均属于多肽类结构的生物活性成分，其在水溶性介质或水剂中稳定性较差、其功能基团和活性中心在水剂中容易降解或破坏。而本发明的纳米乳制剂形似微球，可使诸如蛋白类或多肽类功效成分的穿膜肽携带目的药物和功效成分之乙酰基六胜肽包裹其中，使其稳定性提高，理化特性的破坏性明显减低，因此，其面部涂抹的生物学作用和效果理应提升。
(9)本发明的穿膜肽-乙酰基六胜肽纳米乳的组成成分、构成比例、功效成分种类和载药量及渗透浓度梯度等，更加有利于其经皮渗透和透皮吸收，这也部分解决了以往液态制剂需要解决和克服的诸多问题和难题。
(10)无论是穿膜肽、还是透皮肽，其本身均并无特别的美容功效或药效作用，本发明巧妙地将穿膜肽连接或携带了具有美容功能的目的药物和功效成分-乙酰基六胜肽，使其既具有透皮功能，又具有美容功能。
(11)此外，本发明与现有化妆品剂型相比还具有以下有益效果：①应用本发明技术配制的这种纳米乳较其它化妆品剂型的稳定性更高，且其有效期延长；②应用本发明配制的这种纳米乳中的主要功效成分透皮吸收效果更好，其透皮吸收率更高；③应用本发明技术配制的这种纳米乳其应用的安全性更好；④应用本发明技术配制的这种纳米乳是在室温下制备，因此对于不耐热的穿膜肽-乙酰基六胜肽的生物活性及生物学作用更好；⑤应用本发明技术配制的这种纳米乳的感观性更好，实际使用舒适性更佳。⑥应用本发明技术配制的这种纳米乳的配制成分精简、制备工艺简单、实际操作容易、制备高效快速、不需要特殊仪器设备，不需要外界提供能量、不需要加热，又不污染环境。降低了资源消耗和浪费，也使产品成本大大降低。
由此可见，本发明发明不仅克服和解决了上述与本发明相关的背景技术在现代皮肤美容和皮肤护理中应用的诸多不足或缺陷，而且，通过本发明技术还能取得更多有益的效果或效益。
附图说明：
图1为一种穿膜肽-乙酰基六胜肽人工合成的工艺流程及技术路线图。
图2为穿膜肽-乙酰六胜肽的分子结构示意图。
图3为穿膜肽-乙酰基六胜肽的质谱鉴定分析检测鉴定图谱。
图4为穿膜肽-乙酰基六胜肽的hplc分析检测图谱。
图5为穿膜肽-乙酰基六胜肽纳米乳制备的工艺流程及技术路线图。
图6为穿膜肽-乙酰基六胜肽纳米乳的粒径分布测定分析图。
图7为穿膜肽-乙酰基六胜肽纳米乳的透皮吸收率。
具体实施方式举例
实施举例之一：
本发明中穿膜肽携带乙酰基六胜肽(穿膜肽-乙酰基六胜肽)的制备方法：
1实验部分
1.1主要原料和试剂
fmoc-arg(pbf)-oh(精氨酸)、fmoc-gln(trt)-oh(谷氨酰胺)、fmoc-lys(boc)-oh(赖氨酸)、fmoc-gly-oh(甘氨酸)、fmoc-tyr(tbu)-oh(酪氨酸)、fmoc-met-oh(甲硫氨酸)、fmoc-glu(tbu)-oh(谷氨酸)、ac(乙酸酐∶吡啶＝1∶1)、2-chlorotritylchlorideresin(2氯树脂)、dmf(n，n-二甲基甲酰胺)、dcm(二氯甲烷)、乙腈、hbtu(苯并三氮唑-n，n，n’，n’-四甲基脲六氟磷酸酯)、diea(n，n-二异丙基乙胺)、tfa(三氟乙酸)、tis(三异丙基硅烷)、edt(1，2-乙二硫醇)、乙醚、哌啶、乙醇、茚三酮、苯酚、吡啶。
1.2主要仪器
tdl-50(台式低速大容量离心机)(常州梅香仪器有限公司)、hy-2(调速多用振荡器)(常州朗越仪器制造有限公司)、fd-1a-50(真空冷冻干燥机)(南京普森仪器设备有限公司)、shz-d(iii)型(循环水真空泵)(邦西仪器科技有限公司)、电子天平(常州锐品精密仪器有限公司)、多肽合成仪、工业氮气、lc3000型高效液相色谱仪(北京科瑞海科学仪器有限公司)、agilent6120lc/ms.
1.3固相合成方法及步骤
1.3.1合成路线工艺流程：本发明选用的树脂载体为2氯树脂，树脂上的活性位点为卤素氯，多肽固相合成首先需要把树脂溶胀，再将第一个氨基酸的c端羧基与树脂上的活性位点氯反应，待首个氨基酸接在树脂上以后，进行脱水缩合接第二个氨基酸，缩合完成后再脱fmoc保护。按照设计的氨基酸序列重复操作，依次接完其余的氨基酸并完成n端的乙酰化，最后用切割试剂把多肽从树脂上切割下来，形成裸露的羧基。
1.3.2树脂的溶胀：称取二氯树脂1.5g(合成目的肽为0.08mmol，所用二氯树脂的取代度为0.4mmol/g，按7.5倍过量，则所需的二氯树脂质量为0.08/0.4*7.5＝1.5g)，放入反应柱里，然后在反应柱里加入20毫升dcm，振荡30min，活化待用。
1.3.3连接首个氨基酸通过沙芯抽滤掉dcm溶剂，加入1.05倍树脂摩尔量的fmoc-l-arg(pbf)-oh，再加入10倍树脂摩尔量的diea，最后加入少量的dmf溶解，振荡1h。反应完后用dmf和dcm交替清洗6遍。
1.3.4脱保护加入20毫升20％哌啶/dmf溶液，5min后抽掉。再加入20毫升20％哌啶/dmf溶液，振荡15min。
1.3.5检测抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，吡啶，苯酚各一滴，105℃-110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应，可以继续接下一个氨基酸，如果不变色则为阴性，需要重新脱保护。
1.3.6首次清洗依次用15毫升dmf，15毫升甲醇，15毫升dmf分别清洗两次。
1.3.7缩合加入3倍树脂摩尔量的fmoc-l-arg(pbf)-oh，3倍树脂摩尔量的hbtu，均用少量的dmf溶解，立刻加入10倍树脂摩尔量的diea，反应30min。
1.3.8第二次清洗：依次用15毫升dmf，15毫升甲醇，15毫升dmf分别清洗两次。
1.3.9肽链的延伸按照以上方法重复操作，依次接完剩余的氨基酸。
表2、本发明中合成穿膜肽-乙酰基六胜肽所用到的氨基酸
1.3.10ac的反应和肽的收缩乙酰化是穿皮肽-六胜肽最后一个部分，在反应柱里加入3倍树脂摩尔量的乙酸酐，3倍树脂摩尔量的吡啶，反应30min。ac接上后，整条肽的合成就反应完成了。进入最后的收缩阶段，由于ac没有fmoc保护，所以此处就无需脱保护了。肽的收缩：用dmf洗涤反应3遍，dcm洗涤反应3遍，甲醇洗涤反应3遍，最后抽干肽树脂。
1.3.11氨基酸侧链脱保护与树脂的切割穿皮肽-六胜肽的氨基酸序列为ac-eemqrrygrkkrrqrrr，其中含有的侧链保护基有：pbf、trt、boc、tbu，这几种保护基在酸性条件下不稳定，而切割树脂用的是tfa，所以脱保护和切割树脂可以同时进行。配置切割液15ml，其中各组分的体积比为：tfa(94.5％)、水(2％)、edt(2.5％)、tis(1％)。将树脂装入烧瓶中，恒温(30℃)振荡2h。将裂解液用氮气尽量吹干，然后倒入离心管中，缓慢倒入乙醚。封口并放入离心机中离心5min，倒掉上清液，下方为白色固体。再用乙醚洗6次，然后常温挥干，即得粗品肽。
1.3.12hplc纯化(1)溶解将粗品肽放入器皿中，用30-50ml浓度为50％的乙腈水溶液完全溶解，可以稍微超声2min。(2)过滤用0.45μm滤膜过滤溶解液。(3)分析取3μl溶液用分析级hplc分析粗品以便于后续制备。流动相是水和乙腈，时间30min，梯度洗脱，先将hplc用起始梯度平衡5min然后进样，起始梯度为：水95％，乙腈5％，结束梯度为：水5％，乙腈95％。(4)制备将溶解好的样品做进样准备。制备hplc平衡10min，起始梯度为：水95％，乙腈5％，结束梯度为：水25％，乙腈75％，梯度时间40min。收集从检测器出来的样品。
1.3.13鉴定将收集下来的样品进行取样并做纯度和质谱的鉴定。
2分析鉴定
2.1质谱鉴定分析：利用esi-ms对本发明穿膜肽-乙酰基六胜肽的实际分子量进行质谱鉴定，通过质谱检测分析共得到5个带有不同电荷的目标峰，分别为：
[m+3h]3h+质核比为811.4，其实测分子量为811.4*3-3＝2431.2，
[m+4h]4h+质核比为608.9，其实测分子量为608.9*4-4＝2431.6，
[m+5h]5h+质核比为487.4，其实测分子量为487.4*5-5＝2432.0，
[m+6h]6h+质核比为406.3，其实测分子量为406.3*6-6＝2431.8，
[m+7h]7h+质核比为348.4，其实测分子量为348.4*7-7＝2431.8。而穿膜肽-乙酰基六胜肽的理论分子量也正好为2431.8。通常质谱实际测得分子量与理论分子量的允许误差在±2。而本发明穿膜肽-乙酰基六胜肽的理论分子量与实际分子量两者一致，由此可证明本发明合成的正是穿膜肽-乙酰基六胜肽。本发明穿膜肽-乙酰六胜肽的质谱鉴定分析检测鉴定图谱(详见附图说明之图3)。
2.1高效液相(hplc)分析检测：本发明采用lc3000型高效液相色谱仪，色谱分析条件：c18，反相，4.6mm*150mm，梯度洗脱。起始梯度为5％a+95％b，结束梯度为30％a+70％b，时间是30min，流速为1.0ml/min，紫外检测波长为214nm，进样量为10μl。流动相a为0.1％三氟乙酸在100％乙腈，流动相b为0.1％三氟乙酸在100％水，对穿膜肽-乙酰基六胜肽进行hplc分析检测，其检测结果表明：本发明穿膜肽-乙酰基六胜肽纯品经hplc分析确定保留时间8.219的最高峰为面积最大峰，此处为该合成产物可达到的纯度，该合成产物峰通过其积分可计算出其纯度已达到98.76％。本发明穿膜肽-乙酰六胜肽的hplc分析检测图谱(详见附图说明之图3)。
具体实施举例之二：
一种穿膜肽-乙酰基六胜肽纳米乳及其制备方法(以配制100g为例)：
1.主要原料：
①主要制备原料：肉豆蔻酸异丙酯(ipm)，辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(labrasol)，聚甘油脂肪酸酯(plurololeiquecc497)，重蒸馏水；②主要功效成分：穿膜肽-乙酰基六胜肽；
2.主要配制器材
十万分之一电子天平、万分之一电子天平、千分之一药物天平、液体快速混合器、定时恒温磁力搅拌器、石英管玻璃双重蒸馏水器、大容量低温离心机、无菌过滤器、各种规格容器、烧瓶、烧杯。
3.主要制备过程
①用千分之一药物天平准确称取7.66g重量的肉豆蔻酸异丙酯，立即置于经过洗消过的100ml洁净三角烧瓶之中。并用记号笔清楚标记为油相(a)
②再用十万分之一的精密分析天平分别称取穿膜肽-乙酰基六胜肽100mg置于同一个经过洗消灭菌的100ml洁净的三角烧瓶之中。直接加入40ml的重蒸馏水至上述盛有各种功效成分的100ml三角烧瓶之中，加盖，并将此三角烧瓶迅速置于液体快速混合器上；打开液体快速混合器，并将其调至ii档，充分混合均匀使之完全溶解，3-5min后，关闭液体快速混合器，取下三角烧瓶，并用彩色记号笔清楚标记为水相(c)。
③按照事先已设计好的辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯：分别准确称取17.53克辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯和5.84克聚甘油脂肪酸酯，并将两者置于经过洗消过的100ml洁净三角烧瓶之中；加盖，并将此三角烧瓶迅速置于液体快速混合器上，打开液体快速混合器，并将其调至ii档，充分混合均匀，使之形成乳化剂/助乳化剂(s/c)混合物，3-5分钟后，关闭液体快速混合器，取下三角烧瓶，并用记号笔清楚标记为s/c混合物(b)。
④最后，再按油相(a)∶s/c混合物(b)∶水相(c)等于7.66∶23.37∶68.97的比例，取水相(c)直接加入至上述油相(a)中的100ml三角烧瓶中；然后，再取辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯和聚甘油脂肪酸酯充分混合形成的s/c混合物(b)直接加入至上述油相(a)和水相(c)混合的100ml三角烧瓶中。
⑤立即选用定时恒温磁力搅拌器在室温25℃条件下，以200rpm·min-1的转速磁力搅拌30min。
⑥关闭定时恒温磁力搅拌器，取下100ml三角烧瓶，经观察其外观为清亮、透明、流体性好、分散性好、有明显可见的乳光，即为100g的这种穿膜肽携带乙酰基六胜肽纳米乳。
本发明所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式所进行的描述，并非对本发明构思和范围进行限定，在不脱离本发明设计思想的前提下，本领域中工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的保护范围，本发明请求保护的技术内容，已经全部记载在权利要求书中。