本发明属于医药技术领域，特别涉及奥索拉明在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
恶性肿瘤已经成为人类最大的健康的杀手，一些常见肿瘤，如乳腺癌、肺癌、和胃癌等发病率居高不下，并有逐步升高的趋势。为了战胜肿瘤，人们开发出了多种治疗方案，包括手术切除、放疗、化疗，以及近年来兴起的靶向药物及免疫细胞治疗。但是，由于肿瘤高转移、易耐药的特点，这些治疗手段都有面临一个共同问题：费用昂贵、副作用大，对大多数病人而言，仅能延长很有限的生存期，因此，改进空间依然很大，需要更多新药和治疗方法，可以为不同患者提供更多的治疗方案组合，进一步改善疗效，降低毒副作用和治疗费用。
近年来，老药新用成为药物研发领域的新热点。迄今为止，已有一千多种化合物被批准用于临床治疗各种不同的疾病。随着研究的进展，人们发现部分药物除了对已批准的适应症具有显著的疗效之外，有些药物具有多重作用靶点，如著名的多功能药物包括阿司匹林(haemmerlem,stonerl,menterdgetal.(2018)theplateletlifelinetocancer:challengesandopportunities.cancercell.)、二甲双胍(fengy,kec,tangqetal.(2014)metforminpromotesautophagyandapoptosisinesophagealsquamouscellcarcinomabydownregulatingstat3signaling.celldeath&disease5,e1088.)、黄连素(maol,chenq,gongketal.(2018)berberinedeceleratesglucosemetabolismviasuppressionofmtordependenthif1alphaproteinsynthesisincoloncancercells.oncologyreports39,2436-2442.)和舒林酸(zhouh,liuw,suyetal.(2010)nsaidsulindacanditsanalogbindrxralphaandinhibitrxralpha-dependentaktsignaling.cancercell17,560-573.)等，这些药物通过不同的机制对不同疾病起到很好的疗效。在抗肿瘤领域，作为戒酒药物二硫化四乙基秋兰姆新近被发现具有很好的抗肿瘤效果而对正常细胞无杀伤活性(skrottz,mistrikm,andersenkketal.(2017)alcohol-abusedrugdisulfiramtargetscancerviap97segregaseadaptornpl4.nature552,194-199.)，为老药的抗肿瘤应用开启了良好的开端。
关于奥索拉明对肿瘤的影响，目前尚未见诸报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供奥索拉明在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
奥索拉明在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述的奥索拉明作用于不同肿瘤细胞的半抑制浓度(ic50)优选为25～73μm。
所述的抗肿瘤药物含有奥索拉明和其药用盐中的至少一种。
所述的抗肿瘤药物含有一种或多种药学上可接受的载体或辅料。
所述的辅料优选为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂或润滑剂。
所述的抗肿瘤药物还包含其他起配伍协同作用的有效成分。
所述的起配伍协同作用的有效成分包括抗坏血酸等。
所述的抗肿瘤药物可以采用本领域的常规方法制备成各种剂型，如胶囊、丸剂、片剂、口服液、颗粒剂、酊剂等口服给药的剂型及注射液等口服以外的给药剂型，如针剂等。
所述的肿瘤包括卵巢癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、结肠癌。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1.本发明首次发现镇咳药物奥索拉明可以高效抑制多种肿瘤细胞株的增殖，并诱导这些肿瘤细胞凋亡，具有开发成抗肿瘤药物潜力。
2.奥索拉明是当前临床上广泛应用的镇咳药物，其毒副作用小于可待因且无成瘾性，已在世界范围内多个国家上市并长期使用，其安全性已得到充分检验，给药途径简便，价格便宜，应用前景良好。
3.考虑到抗肿瘤药物研发费用高、失败率高和试验周期长等问题，奥索拉明有望成为一种行之有效的治疗方案。
4.奥索拉明对于紫杉醇耐药的卵巢癌也有显著抑制效果，这将为一线临床用药提供新的参考。
附图说明
图1是奥索拉明抑制肿瘤细胞增殖的结果分析图。
图2是奥索拉明诱导卵巢癌细胞凋亡的流式图。
图3是奥索拉明诱导乳腺癌细胞凋亡的流式图。
图4是奥索拉明诱导肺癌细胞凋亡的流式图。
图5是奥索拉明诱导肝癌细胞凋亡的流式图。
图6是奥索拉明诱导结肠癌细胞凋亡的流式图。
图7是奥索拉明抑制乳腺癌侵袭转移的结果分析图。
图8是奥索拉明对乳腺癌细胞分子机制的结果分析图。
图9是奥索拉明联合抗坏血酸抑制乳腺癌细胞增殖的结果分析图。
图10是奥索拉明联合抗坏血酸诱导乳腺癌细胞凋亡的流式图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1对肿瘤细胞增殖影响的考察
培养多种生长状态良好的肿瘤细胞系，包括(1)卵巢癌细胞：a2780、a2780-taxol(紫杉醇耐药株)；(2)乳腺癌细胞：mcf-7、mda-mb-231；(3)肺癌细胞：a549、h1975；(4)肝癌细胞：hepg2、hepb3；(5)结肠癌细胞：hct-116、colo-205；以上细胞系均购买于atcc公司。
所需细胞培养基分别为：卵巢癌、肺癌和结肠癌细胞系使用含10％fbs的rpmi-1640；乳腺癌和肝癌细胞系使用含10％fbs的dmem。(rpmi-1640和dmem均购自美国invitrogen公司；gibco血清(fbs)购自美国thermofisher公司)
分别用不同肿瘤细胞系相对应培养基配制0μm、10μm、20μm、40μm、80μm和100μm的奥索拉明(奥索拉明购买于medchemexpress公司)，分别取100μl奥索拉明打入96孔板。取对数生长期的肿瘤细胞胰蛋白酶(购自美国thermofisher公司)消化并分别用对应的培养基重悬，种于96孔板中，每孔100μl细胞悬液，细胞密度为8000个/孔。培养48小时后，每孔各加入20μlcck8(购自中国碧云天生物技术公司)，co2恒温培养箱(购买于thermoscientific公司)内孵育2.5h，酶标仪(购买于thermoscientific公司)450nm波长检测每孔吸光度(od值)，并计算细胞增殖率。(未加药组，即药物浓度0μm，作为对照组，活性100％)
细胞的相对增殖率(p％)：p％＝od实验组/od对照组×100％
结果如图1所示(图中显示3个复孔实验均值±sd)，其中图1a为卵巢癌细胞，图1b为乳腺癌细胞、图1c为肺癌细胞、图1d为肝癌细胞、图1e为结肠癌细胞，结果表明：奥索拉明对上述肿瘤细胞的增殖均有良好的抑制活性。
实施例2对肿瘤细胞凋亡情况的考察
培养多种生长状态良好的肿瘤细胞系，包括(1)卵巢癌细胞：a2780、a2780-taxol(紫杉醇耐药株)；(2)乳腺癌细胞：mcf-7、mda-mb-231；(3)肺癌细胞：a549、h1975；(4)肝癌细胞：hepg2、hepb3；(5)结肠癌细胞：hct-116、colo-205；以上所有细胞系均购自atcc公司。所需细胞培养基分别为：卵巢癌、肺癌和结肠癌细胞系使用含10％fbs的rpmi-1640培养基；乳腺癌和肝癌细胞系使用含10％fbs的dmem培养基。
将以上肿瘤细胞消化并分别制备细胞悬液，将细胞种于24孔板中，每孔1000μl细胞悬液，每孔种4×104个细胞，分别加药(0μm、20μm、40μm、80μm)培养24小时后，利用annexin-v/pi双染试剂盒(购自中国碧云天生物技术公司)，经流式细胞仪检测细胞凋亡。
结果如图2～6所示，其中，流式图右上为晚期凋亡细胞比例，右下为早期凋亡细胞比例，结果表明：奥索拉明可以有效诱导卵巢癌细胞(图2)、乳腺癌细胞(图3)、肺癌细胞(图4)、肝癌细胞(图5)、结肠癌细胞(图6)发生凋亡。
实施例3对肿瘤细胞侵袭转移情况的考察
取对数生长期的mda-mb-231乳腺癌细胞(三阴乳腺癌伴随高侵袭、高转移性：er阴性/pr阴性/her-2阴性)进行胰酶消化、离心后用无血清的dmem培养基重悬。调整细胞密度1×105个/ml，取300μl细胞悬液，并分别加入不同浓度的奥索拉明(0μm、10μm、20μm)种于24孔板transwell小室(购自美国corning公司)的上室，下室加入750μl含10％fbs的dmem培养基。37℃，5％co2培养箱培养24h。取出transwell小室用pbs洗2遍，然后用棉球擦除上室表面的细胞，加入75％乙醇固定20分钟。弃去乙醇，加入0.1％结晶紫室温染色30分钟。弃结晶紫，pbs洗2遍，晾干。显微镜下观察穿过matrigel及微孔至滤膜反面的细胞，于200倍光学显微镜下计数10个视野的细胞，取平均值并拍照。
结果如图7所示，奥索拉明10μm和20μm处理mda-mb-231细胞后，细胞的侵袭转移能力与对照组(奥索拉明0μm)明显下降，这表明：奥索拉明同时能够有效抑制mda-mb-231细胞的侵袭转移。
实施例4对肿瘤细胞分子和作用机制情况的考察
mda-mb-231细胞用不同浓度的奥索拉明(0μm、10μm、20μm、30μm、40μm、60μm)作用24h后，冷pbs洗2遍，加入含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的ripa细胞裂解液(购买于中国碧云天生物技术公司)冰上裂解15min，12000rpm/min，4℃离心15min，吸取上清至新的ep管，bca法测定蛋白浓度(购买于中国碧云天生物技术公司)。取适量蛋白上样至常规胶电泳，转膜，封闭，一抗4℃孵育过夜，tbst洗膜3遍，10min/遍，二抗室温孵育2h，tbst洗膜3遍，10min/遍，化学发光显色，凝胶成像仪拍照。
其中，一抗anti-p62、anti-lc3、anti-akt、anti-pakt、anti-parp、anti-hk2、anti-β-tublin均购买于美国cellsignalingtechnology公司；一抗anti-lc3购买于美国novus公司。二抗goatanti-rabbitiggantibody(h&l)[hrp]和goatanti-mouseiggantibody(h&l)[hrp]购买于金斯瑞生物科技公司。
结果如图8所示，随着奥索拉明作用浓度的增加，p62显著上调，lc3ii显著下调，结果提示，奥索拉明可能抑制了mda-mb-231细胞自噬水平。同时，p-akt和parp表达显著下调，表明奥索拉明通过抑制akt通路抑制mda-mb-231细胞凋亡。hk2是葡萄糖活化的关键激酶，随着奥索拉明作用浓度的增加，hk2表达逐渐下调，结果提示：奥索拉明可能抑制细胞对葡萄糖的利用率，进而抑制细胞能量代谢，导致细胞活力被抑制。
实施例5联合抗坏血酸对肿瘤细胞增殖影响的考察
用含10％fbs的dmem培养基配制对应浓度的奥索拉明(oxo)和抗坏血酸(vc)，设置奥索拉明单独加药组(6个药物浓度)、抗坏血酸单独加药组(6个药物浓度)、联合用药组1(6组联合用药方案)；联合用药组2(6组联合用药方案)，具体如表1所示。将表1配好的药物分别加入96孔板，每孔100μl。
表1加药方案设计
取对数生长期的mda-mb-231乳腺癌细胞进行胰酶消化、离心后用含10％fbs的dmem培养基重悬，种于96孔板中，每孔100μl细胞悬液，细胞密度为8000个/孔。培养48小时后，每孔各加入20μlcck8(购自中国碧云天生物技术公司)，co2恒温培养箱(购买于thermoscientific公司)内孵育2.5h，酶标仪(购买于thermoscientific公司)450nm波长检测每孔吸光度(od值)，并计算细胞增殖率。(未加药组，即药物浓度0μm，作为对照组，活性100％)
细胞的相对增殖率(p％)：p％＝od实验组/od对照组×100％
结果如图9所示，抗坏血酸(vc)在500μm时，与奥索拉明具有显著联合抑制乳腺癌细胞增殖效果。并且，抗坏血酸能够有效降低奥索拉明对乳腺癌细胞的ic50值(oxo:ic＝84.3μm；oxo+vc：ic50＝32.1μm)。结果表明：奥索拉明与抗坏血酸具有良好的联合用药效果。
实施例6联合抗坏血酸对肿瘤细胞凋亡情况的考察
取对数生长期的mda-mb-231乳腺癌细胞进行胰酶消化、离心后用含10％fbs的dmem培养基重悬，种于24孔板中，每孔1000μl细胞悬液，细胞密度为4×104个/孔。设置对照孔(oxo:0μm；vc：0μm)、oxo单独加药孔(40μm)、vc单独加药孔(500μm)和联合用药孔(oxo:40μm；vc:500μm)。细胞培养24小时后，利用annexin-v/pi双染试剂盒(购自中国碧云天生物技术公司)，经流式细胞仪检测细胞凋亡。
结果如图10所示，其中，流式图右上为晚期凋亡细胞比例，右下为早期凋亡细胞比例，结果表明：奥索拉明(oxo)联合抗坏血酸(vc)比单独加药组更加显著诱导乳腺癌细胞凋亡。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。