本发明属于纳米药物制剂领域，涉及一种紫红素18-脂质体纳米囊泡的制备方法以及在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
恶性肿瘤作为全球较大的公共卫生问题之一极大地危害人类的健康，成为新世纪人类的第一杀手。目前肿瘤治疗策略主要包括手术治疗、药物治疗、放射治疗和生物治疗，每种方法都有一定的缺陷性：手术治疗风险大，容易复发和转移；药物治疗由于非肿瘤靶向性，会产生严重的毒副作用；生物治疗费用高，易复发；放射治疗周期长，存在放射损伤。其中，近红外激光辐照产生的光动力治疗(photodynamictherapy，pdt)和光热疗法(photothermaltherapy，ptt)由于激光的选择性，可控性，能够对肿瘤组织定点清除，同时不影响周围正常组织，越来越受到关注，成为一种潜力巨大的治疗方式。
在应用肿瘤的光动力和光热治疗中关键的是光敏剂和光热剂的选择，叶绿酸降解产物具有理想的作用光谱，高近红外区吸收系数，以及在体内消除迅速等特点，可作为pdt药物及合成前体有着较好的应用前景。
紫红素18(purpurin18，pp18)是一个具有强疏水性的叶绿素衍生物，具有三个特征吸收峰，分别位于410nm，545nm和705nm，其中705nm具有强烈吸收，且吸收波长较长，属于近红外波段，穿透性好，可用于肿瘤pdt治疗。pdt治疗是利用局部照光，治疗肿瘤，然而由于pp18的强疏水性，使得紫红素在体内溶解性差，不易摄取，到达肿瘤部位的效率较低，从而影响pdt治疗的效果。
技术实现要素：
本发明目的是克服现有技术所存在的缺陷与不足，提供一种纳米囊泡制备方法和在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
一种紫红素18-脂质体纳米囊泡的制备方法，采用有机酰化反应将紫红素18与1-棕榈酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱共价连接，构建pp18-lipid共价结合物，将pp18-lipid共价结合物、二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000混合，采用氮气吹干成膜，然后将薄膜水化，再采用脂质体挤压法，制得紫红素18-脂质体纳米囊泡。
本发明进一步的改进在于，具体包括以下步骤：
(1)将pp18、p-lysopc、edci与dmap溶解在三氯甲烷中，避光且氩气保护下进行酰化反应，将pp18连接于p-lysopc侧链，纯化，得到pp18-lipid；其中，pp18为紫红素18，p-lysopc为1-棕榈酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱；
(2)将二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和pp18-lipid溶于氯仿中，混合均匀后，氮气吹干成膜；
(3)采用pbs水浴振荡水化，反复冻融，得到水化的紫红素18-脂质混合液；
(4)采用挤压器挤压水化的紫红素18-脂质混合液，制得紫红素18-脂质体。
本发明进一步的改进在于，步骤(1)中，pp18、p-lysopc、edci与dmap的摩尔比为(0.5～1)：1：(1～2)：(1～2)。
本发明进一步的改进在于，pp18分子量为564.631，p-lysopc分子量为495.63。
本发明进一步的改进在于，步骤(1)中纯化具体过程为：通过柱色谱层析，洗脱剂为三氯甲烷、甲醇与醋酸的混合液，通过调整各溶剂的比例，调节洗脱液的极性，其中，三氯甲烷、甲醇与醋酸体积比为(80～90)：(10～15)：(0～5)。
本发明进一步的改进在于，步骤(2)中，以二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和pp18-lipid的总的物质的量为100计，dspc：chol：dspe-peg2000：pp18-lipid物质的量的比为(0-55)：(30～40)：5：(1～65)。
本发明进一步的改进在于，步骤(1)中pp18与三氯甲烷的比为pp18与三氯甲烷的比为56.4mg：10ml；步骤(2)中二硬脂酰磷脂酰胆碱与氯仿的比为12.13mg：1ml。
本发明进一步的改进在于，步骤(3)中pbs的ph值为7.0～7.4，水浴的温度为65℃。
本发明进一步的改进在于，步骤(4)中挤压的温度为40～65℃。
一种紫红素18-脂质体纳米囊泡在制备用于肿瘤治疗药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明合成的pp18-lipos，通过p-lysopc与pp18有机反应，生成pp18-lipid，具有与普通磷脂相似的两亲性结构，在水相中自组装形成磷脂双分子层囊泡pp18-lipos，pp18分布在磷脂双分子层之间，有效的解决了pp18水溶性差的特点，并且可以自主调整pp18比例，相比与包载pp18的普通脂质体，其负载量显著提高，由于磷脂成分与细胞膜成分相似，制备的纳米颗粒生物相容性好，降低了pp18的药物毒性，同时形成的纳米结构由于加强的渗透滞留效应，可以有效的在肿瘤部位显著富集，制备的高比例的pp18-lipos由于pp18在双层分子间的高密度排列，光激活下，引起荧光淬灭现象，使其具有较高的光热转换效率。本发明中采用的pp18属于卟啉衍生物，疏水分子，卟啉环上有一个羧酸基团，可用于光动力治疗。采用的p-lysopc是磷脂分子中的一种，由磷脂分子的两条疏水碳链，水解其中一条之后，产生一个羟基，既保留了亲水头部，也可与pp18羧基反应。与传统的用于载卟啉的脂质体系统相比，极大地提高了紫红素18在脂质体上的负载率；提高了紫红素18在肿瘤部位的被动靶向性能。
将本发明制备的紫红素18-脂质体纳米囊泡应用于制备肿瘤治疗药物中，改善了紫红素18在水溶液中易聚集的性质，提高了组织相容性，降低其毒性；由于构建的pp18-lipos纳米囊泡，大量的紫红素18整齐的堆叠在脂质双分子层之间，从而产生荧光自淬灭现象，在特定波长照射下，将原本激发的荧光转化为热能，可作为光热剂，实现光热转化，用于肿瘤光热治疗(ptt)；通过降低pp18-lipid比例，在低比例pp18-lipos中，卟啉在特定波长光照射下，荧光未发生淬灭，并产生单线态氧，作为光敏剂，可用于光动力治疗(pdt)肿瘤；肿瘤诊断与成像：低比例pp18-lipos由于荧光未发生淬灭可用于体内肿瘤近红外荧光成像。构建的卟啉脂质体被动靶向于肿瘤部位，即作为肿瘤治疗的光敏剂/光热剂，也可用于肿瘤诊断成像，克服了传统药物的弊端，提高了了肿瘤治愈率。本发明构建的紫红素18-脂质体(purpurin18-liposomes，pp18-lipos)纳米囊泡，不仅改善pp18的水溶性，可以自主的控制pp18的负载效率，通过挤压制得脂质体粒径在100nm左右，增效了其渗透滞留效应，提高药物利用率和pdt治疗效果，并利用可控的负载率，提高负载率后，由于高密度的pp18整齐的排列在pp18-lipos双层分子间，出现荧光淬灭现象，使得能量转化由光能转变为热能，从而引入了ptt治疗。
附图说明
图1为pp18-lipid共价结合物反应结构式。
图2为pp18-lipid共价结合物薄层色谱检测，其中，a为反应前，b为反应后。
图3为pp18-lipid共价结合物高效液相检测图，其中，a为反应前，b为反应后。
图4为pp18-lipid共价结合物高分辨质谱检测。
图5为pp18-lipid共价结合物柱色谱纯化薄层色谱检测，其中，a为纯化前，b为纯化后未显色，c为纯化后显色。
图6为pp18-lipos纳米囊泡电镜图，其中，a为实施例6制备的产品，b为实施例11制备的产品。
图7为pp18-lipos纳米囊泡粒径分布图，其中，a为实施例6制备的产品，b为实施例11制备的产品。
图8为pp18-lipos纳米囊泡单线态氧产率。
图9为pp18-lipos纳米囊泡体外光热温度变化。
图10为pp18-lipos纳米囊泡细胞毒性检测，a为pp18-lipos毒性，b为pp18毒性。
图11为2％pp18-lipos纳米囊泡介导的pdt对乳腺癌细胞的杀伤。
图12为65％pp18-lipos纳米囊泡介导的ptt对乳腺癌细胞的杀伤。
图13为pp18-lipos纳米囊泡体内外近红外荧光成像。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述。
采用催化剂催化有机酰化反应将pp18与1-棕榈酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphorycholine，p-lysopc，lipid)共价连接，构建pp18-lipid-共价结合物，并利用pp18-lipid共价结合物，将二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、胆固醇(chol)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dspe-peg2000)按一定比例混合，采用氮气吹干成膜，然后将薄膜水化，再采用脂质体挤压法，制得紫红素18-脂质体(pp18-lipos)纳米囊泡。其中，1-棕榈酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphorycholine，p-lysopc，lipid)为磷脂主体结构，卟啉类光敏剂紫红素18(pp18)为光可激活元件，将两分子共价连接在一起如图1。具体包括以下步骤：
本发明提供了一种pp18-lipid的物质的量的百分数为1～65％的pp18-lipos纳米囊泡体外单线态氧检测方法，具体步骤：
使用705nm的光照射pp18-lipos纳米囊泡，使pp18-lipos纳米囊泡激活产生单线态氧，利用单线态氧探针借助荧光分光光度计检测。
本发明提供了一种pp18-lipid的物质的量的百分数为1～65％的pp18-lipos纳米囊泡体外光热转换能力的检测，包括以下步骤：
使用705nm照射pp18-lipos，使用红外热成像仪检测pp18-lipos纳米囊泡温度升高。
本发明提供了一种纳米囊泡在制备用于肿瘤细胞光动力治疗药物中的应用的方法，包括以下步骤:
将pp18-lipid的物质的量的百分数为2％的pp18-lipos纳米囊泡给予mda-mb-231细胞；
使用705nm波长的光照射mda-mb-231细胞中的pp18-lipos，使pp18-lipos激活产生活性氧杀伤肿瘤细胞，使用mtt法检测。
本发明提供了一种纳米囊泡在用于制备肿瘤细胞光热治疗药物中的应用方法，包括：
将pp18-lipid的物质的量的百分数为65％的pp18-lipos纳米囊泡给予mda-mb-231细胞；
使用705nm波长的光照射mda-mb-231细胞中的pp18-lipos，使pp18-lipos激活升温杀伤肿瘤细胞，使用mtt法检测。
本发明提供了一种纳米囊泡在近红外荧光成像用于体内药物分布检测的方法，包括以下步骤：
将pp18-lipid的物质的量的百分数为2％的pp18-lipos纳米囊泡给予4t1移植瘤小鼠；
使用705nm波长的光照射激靶区域pp18-lipid的物质的量的百分数为2％的pp18-lipos纳米囊泡，使靶区域pp18-lipos纳米囊泡激活产生荧光；使用小动物活体成像检测产生的荧光信号强度。
上述方法制备的紫红素18-脂质体纳米囊泡在制备用于肿瘤治疗药物中的应用。
本发明紫红素18-磷脂的合成方法：
(1)将pp18、lipid、edci(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)与dmap(4-(二甲氨基)吡啶)以摩尔比(0.5～1)：1：(1～2)：(1～2)混合于10ml除水的三氯甲烷中，混合、避光、氩气保护、搅拌24h，形成混合液i。其中，pp18分子量为564.631，p-lysopc分子量为495.63。pp18与三氯甲烷的比为56.4mg：10ml。
(2)将烘干的三口瓶置于磁力搅拌器上，连接氩气保护，将混合液i加入到三口瓶中，打开磁力搅拌器避光搅拌24h，形成反应混合液ii，将反应混合液ii进行薄层色谱、高分辨质谱和高效液相检测，如图2、图3和图4。从图2、图3和图4可以看出，紫红素18-磷脂(pp18-lipid)生成。
(3)为了纯化得到的pp18-lipid采用柱色谱层析，使用梯度洗脱，使用的洗脱剂为三氯甲烷、甲醇与醋酸的混合液，通过调整各溶剂的比例，调节洗脱液的极性，三氯甲烷、甲醇与醋酸体积比为(80～90)：(10～15)：(0～5)。具体过程为：将反应混合液ii与硅胶粉末混合，37℃旋转蒸发去除三氯甲烷，样品吸附在硅胶上，装硅胶柱，上样，加入洗脱剂，对混合样品进行柱层析纯化，采用梯度洗脱，洗脱剂极性由高到低依次为①三氯甲烷：甲醇体积比为9:1，②三氯甲烷：甲醇体积比为8.5：1.5，③三氯甲烷：甲醇：醋酸体积比为8：1.5：0.5，纯化产物pp18-lipid使用薄层色谱检测。
(4)将收集的pp18-lipid，使用旋转蒸发仪在37℃去除三氯甲烷与甲醇，65℃去除醋酸，初步干燥，转移分装至试管中，氮气进一步干燥，再置于真空干燥罐中真空干燥3h，封口膜密封，保存于-20℃冰箱备用。
本发明紫红素18-脂质体纳米囊泡制备方法：
(1)将二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇(chol)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dspe-peg2000)和pp18-lipid(以紫红素18质量计算)分别溶于氯仿中，以二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和pp18-lipid的总的物质的量为100计，dspc：chol：dspe-peg2000：pp18-lipid摩尔比为(0-55)：(30～40)：5：(1～65)的量混合依次加入试管中，形成pp18-lipid的物质的量的百分数为1～65％的磷脂混合液，置于65℃水浴锅中加热5min；
其中，以二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和pp18-lipid的总的物质的量为100计，二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和pp18-lipid的摩尔比为(0-55)：(30～40)：5：(1～65)，即二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和pp18-lipid各个物质的量的总和为100。例如，当二硬脂酰磷脂酰胆碱的物质的量为30时，胆固醇的物质的量为40，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000的物质的量为5，pp18-lipid的物质的量为25，二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000与pp18-lipid的总量为100。
(3)将试管固定于氮气吹干装置上，避光，打开氮气至气流稳定均匀吹出，将氮气吹入试管中，随着氮气吹入，氯仿蒸发，待试管壁上形成均匀脂质薄膜且试管底部没有液体后，关闭氮气；
(4)使用封口膜封闭试管口部，在封口膜上戳上小孔，让其与外界连通，将其放入真空干燥罐内，避光，打开真空泵，抽真空3～4h将残余溶剂充分挥发干净；
(5)使用1mlph＝7.2～7.4的0.01mol/lpbs在65℃水振荡水化试管中的脂质薄膜，振荡2min，涡旋仪上涡旋20s(5个循环后)，待试管壁上的薄膜脱落，使用液氮冷冻，并在65℃迅速融化并涡旋，5个循环后，液体中无肉眼可见的聚集颗粒，得到水化的紫红素脂质混合液；
(6)准备脂质体挤压器，将挤压器加热至40～65℃，采用挤压器挤压水化的紫红素18-脂质体，依次通过200nm、100nm聚碳酸酯膜，10个循环后，制备的pp18-lipid的物质的量的百分数为1～65％的紫红素18-脂质体悬浊液变为透亮液体，即制得紫红素18-脂质体，然后加入冻干保护剂冻干，以紫红素18-脂质体冻干剂保存；其中，冻干保护剂为甘露糖、乳糖、葡萄糖、氨基酸、蔗糖、聚乙二醇中的一种或者任意两种以上的混合物，置于-80℃冰箱，预冻12h，然后放入冷冻干燥机中冻干24h，制得干燥的紫红素18-脂质体冻干剂。
本发明采用的pp18属于卟啉衍生物，疏水分子，卟啉环上有一个羧酸基团分子量为564.631，可用于光动力治疗。本发明采用的p-lysopc是磷脂分子中的一种，由磷脂分子的两条疏水碳链，水解其中一条之后，产生一个羟基，既保留了亲水头部，也可与pp18羧基反应，分子量为495.63。
本发明合成的pp18-lipos，通过p-lysopc与pp18有机反应，生成pp18-lipid，具有与普通磷脂相似的两亲性结构，在水相中自组装形成磷脂双分子层囊泡pp18-lipos，pp18分布在磷脂双分子层之间，有效的解决了pp18水溶性差的特点，并且可以自主调整pp18比例，相比与包载pp18的普通脂质体，其负载量显著提高，由于磷脂成分与细胞膜成分相似，制备的纳米颗粒生物相容性好，降低了pp18的药物毒性，同时形成的纳米结构由于加强的渗透滞留效应，可以有效的在肿瘤部位显著富集，制备的高比例的pp18-lipos由于pp18在双层分子间的高密度排列，光激活下，引起荧光淬灭现象，使其具有较高的光热转换效率。
下面通过具体的实施例对本发明做进一步详细说明
实施例1紫红素18-磷脂的合成
称取pp18：56.4mg，p-lysopc：98.7mg，edci：38.35mg，dmap：24.35mg，溶于10ml无水三氯甲烷中，依次加入通有氩气的反应瓶中，室温避光搅拌24h，反应结束，将反应混合液与硅胶粉末混合，旋转蒸干溶剂37℃，使用硅胶柱层析纯化，梯度洗脱，洗脱剂极性由高到低依次为①三氯甲烷：甲醇体积比为9:1，②三氯甲烷：甲醇体积比为8.5：1.5，③三氯甲烷：甲醇：醋酸体积比为8：1.5：0.5，收集pp18-lipid，使用旋转蒸发仪初步蒸干溶剂，氮气吹干，真空干燥3h，储存于-20℃冰箱。
实施例2紫红素18-磷脂的合成
称取pp18：112.8mg，p-lysopc：98.7mg，edci：38.35mg，dmap：24.35mg，溶于10ml无水三氯甲烷中，依次加入通有氩气的反应瓶中，室温避光搅拌24h，反应结束，将反应混合液与硅胶粉末混合，旋转蒸干溶剂37℃，使用硅胶柱层析纯化，梯度洗脱，洗脱剂极性由高到低依次为①三氯甲烷：甲醇体积比为9:1，②三氯甲烷：甲醇体积比为8.5：1.5，③三氯甲烷：甲醇：醋酸体积比为8：1.5：0.5，收集pp18-lipid，使用旋转蒸发仪初步蒸干溶剂，氮气吹干，真空干燥3h，储存于-20℃冰箱。
实施例3紫红素18-磷脂的合成
称取pp18：112.8mg，p-lysopc：98.7mg，edci：76.7mg，dmap：48.7mg，溶于10ml无水三氯甲烷中，依次加入通有氩气的反应瓶中，室温避光搅拌24h，反应结束，将反应混合液与硅胶粉末混合，旋转蒸干溶剂，使用硅胶柱层析纯化，梯度洗脱，洗脱剂极性由高到低依次为①三氯甲烷：甲醇体积比为9:1，②三氯甲烷：甲醇体积比为8.5：1.5，③三氯甲烷：甲醇：醋酸体积比为8：1.5：0.5，收集pp18-lipid，使用旋转蒸发仪初步蒸干溶剂，氮气吹干，真空干燥3h，储存于-20℃冰箱。
通过改变反应物pp18，p-lysopc与两种催化剂(edci与dmap均为催化剂)的比例，当pp18：lipid：edci：dmap摩尔比为1：1：2：2时，反应产率相对较高，高效液相显示如图2，纯化成分单一，如图5。
实施例4紫红素18-脂质体纳米囊泡的制备
(1)氮气吹干成膜：按二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、胆固醇(chol)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dspe-peg2000)和pp18-lipid(以紫红素18质量计算，pp18-lipid为实施例1、2或3中制备的)摩尔比为55：40：5：0称取以上四种物质各12.13mg，4.31mg，3.92mg，0mg分别溶于三氯甲烷中，混合于2×18cm的试管中，保持最终的体积为1ml，置于65℃水浴锅中混匀、加热；将试管固定于氮气吹干装置上，避光，打开氮气至气流稳定均匀吹出，将氮气吹入试管中，随着氮气吹入，三氯甲烷蒸发，待试管壁上形成均匀脂质薄膜且试管底部没有液体后，使用封口膜封闭试管口部，在封口膜上戳上小孔，让其与外界联通，将其放入真空干燥罐内，避光，打开真空泵，抽真空3～4h将残余溶剂充分挥发干净；
(2)薄膜水化：使用1mlph＝7.2～7.4的0.01mol/lpbs在65℃水振荡水化试管中的脂质薄膜，振荡2min，涡旋仪上涡旋20s(5个循环后)，待试管壁上的薄膜脱落，采用液氮冷冻，并在65℃迅速融化并涡旋，5个循环后，液体中无肉眼可见的聚集颗粒，得到脂质体混合液；
(3)脂质体挤压：准备脂质体挤压器，将挤压器加热至40℃，采用挤压器挤压水化的紫红素18-脂质体，依次通过200nm、100nm聚碳酸酯膜，10个循环后，制备的0％pp18-lipos悬浊液变为透亮液体，将降至室温保存于4℃冰箱。
实施例5紫红素18-脂质体纳米囊泡的制备
(1)氮气吹干成膜：按二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、胆固醇(chol)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dspe-peg2000)和pp18-lipid(以紫红素18质量计算，pp18-lipid采用实施例1、2或3中制备的均可)摩尔比为54：40：5：1称取以上四种物质各11.91mg，4.31mg，3.92mg，0.157mg分别溶于三氯甲烷中，混合于2×18cm的试管中，保持最终的体积为1ml，置于65℃水浴锅中混匀、加热；将试管固定于氮气吹干装置上，避光，打开氮气至气流稳定均匀吹出，将氮气吹入试管中，随着氮气吹入，三氯甲烷蒸发，待试管壁上形成均匀脂质薄膜且试管底部没有液体后，使用封口膜封闭试管口部，在封口膜上戳上小孔，让其与外界联通，将其放入真空干燥罐内，避光，打开真空泵，抽真空3～4h将残余溶剂充分挥发干净；
(2)薄膜水化：使用1mlph＝7.2～7.4的0.01mol/lpbs在65℃水振荡水化试管中的脂质薄膜，振荡2min，涡旋仪上涡旋20s(5个循环后)，待试管壁上的薄膜脱落，采用液氮冷冻，并在65℃迅速融化并涡旋，5个循环后，液体中无肉眼可见的聚集颗粒，得到脂质体混合液；
(3)脂质体挤压：准备脂质体挤压器，将挤压器加热至40℃，采用挤压器挤压水化的紫红素18-脂质体，依次通过200nm、100nm聚碳酸酯膜，10个循环后，制备的1％pp18-lipos悬浊液变为透亮液体，将降至室温保存于4℃冰箱。
实施例6紫红素18-脂质体纳米囊泡的制备
(1)氮气吹干成膜：按二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、胆固醇(chol)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dspe-peg2000)和pp18-lipid(以紫红素18质量计算)mol比为53：40：5：2称取以上四种物质各11.69mg，4.31mg，3.92mg，0.314mg分别溶于三氯甲烷中，混合于2×18cm的试管中，保持最终的体积为1ml，置于65℃水浴锅中混匀、加热；将试管固定于氮气吹干装置上，避光，打开氮气至气流稳定均匀吹出，将氮气吹入试管中，随着氮气吹入，三氯甲烷蒸发，待试管壁上形成均匀脂质薄膜且试管底部没有液体后，使用封口膜封闭试管口部，在封口膜上戳上小孔，让其与外界联通，将其放入真空干燥罐内，避光，打开真空泵，抽真空3～4h将残余溶剂充分挥发干净；
(2)薄膜水化：使用1mlph＝7.2～7.4的0.01mpbs在65℃水振荡水化试管中的脂质薄膜，振荡2min，涡旋仪上涡旋20s(5个循环后)，待试管壁上的薄膜脱落，使用液氮冷冻，并在65℃迅速融化并涡旋，5个循环后，液体中无肉眼可见的聚集颗粒，得到脂质体混合液；
(3)脂质体挤压：准备脂质体挤压器，将挤压器加热至40℃，使用挤压器挤压水化的紫红素18-脂质体，依次通过200nm、100nm聚碳酸酯膜，10个循环后，制备的2％pp18-lipos悬浊液变为透亮液体，将降至室温保存于4℃冰箱。
实施例7紫红素18-脂质体纳米囊泡的制备
(1)氮气吹干成膜：按二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、胆固醇(chol)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dspe-peg2000)和pp18-lipid(以紫红素18质量计算)mol比为50：40：5：5称取以上四种物质各11.03mg，4.31mg，3.92mg，0.785mg分别溶于三氯甲烷中，混合于2×18cm的试管中，保持最终的体积为1ml，置于65℃水浴锅中混匀、加热；将试管固定于氮气吹干装置上，避光，打开氮气至气流稳定均匀吹出，将氮气吹入试管中，随着氮气吹入，三氯甲烷蒸发，待试管壁上形成均匀脂质薄膜且试管底部没有液体后，使用封口膜封闭试管口部，在封口膜上戳上小孔，让其与外界联通，将其放入真空干燥罐内，避光，打开真空泵，抽真空3～4h将残余溶剂充分挥发干净；
(2)薄膜水化：使用1mlph＝7.2～7.4的0.01mpbs在65℃水振荡水化试管中的脂质薄膜，振荡2min，涡旋仪上涡旋20s(5个循环后)，待试管壁上的薄膜脱落，使用液氮冷冻，并在65℃迅速融化并涡旋，5个循环后，液体中无肉眼可见的聚集颗粒，得到脂质体混合液；
(3)脂质体挤压：准备脂质体挤压器，将挤压器加热至40℃，使用挤压器挤压水化的紫红素18-脂质体，依次通过200nm、100nm聚碳酸酯膜，10个循环后，制备的5％pp18-lipos悬浊液变为透亮液体，将降至室温保存于4℃冰箱。
实施例8紫红素18-脂质体纳米囊泡的制备
(1)氮气吹干成膜：按二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、胆固醇(chol)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dspe-peg2000)和pp18-lipid(以紫红素18质量计算)mol比为45：40：5：10称取以上四种物质各9.93mg，4.31mg，3.92mg，1.57mg分别溶于三氯甲烷中，混合于2×18cm的试管中，保持最终的体积为1ml，置于65℃水浴锅中混匀、加热；将试管固定于氮气吹干装置上，避光，打开氮气至气流稳定均匀吹出，将氮气吹入试管中，随着氮气吹入，三氯甲烷蒸发，待试管壁上形成均匀脂质薄膜且试管底部没有液体后，使用封口膜封闭试管口部，在封口膜上戳上小孔，让其与外界联通，将其放入真空干燥罐内，避光，打开真空泵，抽真空3～4h将残余溶剂充分挥发干净；
(2)薄膜水化：使用1mlph＝7.2～7.4的0.01mpbs在65℃水振荡水化试管中的脂质薄膜，振荡2min，涡旋仪上涡旋20s(5个循环后)，待试管壁上的薄膜脱落，使用液氮冷冻，并在65℃迅速融化并涡旋，5个循环后，液体中无肉眼可见的聚集颗粒，得到脂质体混合液；
(3)脂质体挤压：准备脂质体挤压器，将挤压器加热至65℃，使用挤压器挤压水化的紫红素18-脂质体，依次通过200nm、100nm聚碳酸酯膜，10个循环后，制备的10％pp18-lipos悬浊液变为透亮液体，将降至室温保存于4℃冰箱。
实施例9紫红素18-脂质体纳米囊泡的制备
(1)氮气吹干成膜：按二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、胆固醇(chol)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dspe-peg2000)和pp18-lipid(以紫红素18质量计算)mol比为40：40：5：15称取以上四种物质各8.83mg，4.31mg，3.92mg，2.355mg分别溶于三氯甲烷中，混合于2×18cm的试管中，保持最终的体积为1ml，置于65℃水浴锅中混匀、加热；将试管固定于氮气吹干装置上，避光，打开氮气至气流稳定均匀吹出，将氮气吹入试管中，随着氮气吹入，三氯甲烷蒸发，待试管壁上形成均匀脂质薄膜且试管底部没有液体后，使用封口膜封闭试管口部，在封口膜上戳上小孔，让其与外界联通，将其放入真空干燥罐内，避光，打开真空泵，抽真空3～4h将残余溶剂充分挥发干净；
(2)薄膜水化：使用1mlph＝7.2～7.4的0.01mpbs在65℃水振荡水化试管中的脂质薄膜，振荡2min，涡旋仪上涡旋20s(5个循环后)，待试管壁上的薄膜脱落，使用液氮冷冻，并在65℃迅速融化并涡旋，5个循环后，液体中无肉眼可见的聚集颗粒，得到脂质体混合液；
(3)脂质体挤压：准备脂质体挤压器，将挤压器加热至65℃，使用挤压器挤压水化的紫红素18-脂质体，依次通过200nm、100nm聚碳酸酯膜，10个循环后，制备的15％pp18-lipos悬浊液变为透亮液体，将降至室温保存于4℃冰箱。
实施例10紫红素18-脂质体纳米囊泡的制备
(1)氮气吹干成膜：按二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、胆固醇(chol)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dspe-peg2000)和pp18-lipid(以紫红素18质量计算)mol比为35：40：5：20称取以上四种物质各7.73mg，4.31mg，3.92mg，3.14mg分别溶于三氯甲烷中，混合于2×18cm的试管中，保持最终的体积为1ml，置于65℃水浴锅中混匀、加热；将试管固定于氮气吹干装置上，避光，打开氮气至气流稳定均匀吹出，将氮气吹入试管中，随着氮气吹入，三氯甲烷蒸发，待试管壁上形成均匀脂质薄膜且试管底部没有液体后，使用封口膜封闭试管口部，在封口膜上戳上小孔，让其与外界联通，将其放入真空干燥罐内，避光，打开真空泵，抽真空3～4h将残余溶剂充分挥发干净；
(2)薄膜水化：使用1mlph＝7.2～7.4的0.01mpbs在65℃水振荡水化试管中的脂质薄膜，振荡2min，涡旋仪上涡旋20s(5个循环后)，待试管壁上的薄膜脱落，使用液氮冷冻，并在65℃迅速融化并涡旋，5个循环后，液体中无肉眼可见的聚集颗粒，得到脂质体混合液；
(3)脂质体挤压：准备脂质体挤压器，将挤压器加热至65℃，使用挤压器挤压水化的紫红素18-脂质体，依次通过200nm、100nm聚碳酸酯膜，10个循环后，制备的20％pp18-lipos悬浊液变为透亮液体，将降至室温保存于4℃冰箱。
实施例11紫红素18-脂质体纳米囊泡的制备
(1)氮气吹干成膜：按二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、胆固醇(chol)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dspe-peg2000)和pp18-lipid(以紫红素18质量计算)mol比为0：30：5：65称取以上四种物质各0mg，4.31mg，3.92mg，10.205mg分别溶于三氯甲烷中，混合于2×18cm的试管中，保持最终的体积为1ml，置于65℃水浴锅中混匀、加热；将试管固定于氮气吹干装置上，避光，打开氮气至气流稳定均匀吹出，将氮气吹入试管中，随着氮气吹入，三氯甲烷蒸发，待试管壁上形成均匀脂质薄膜且试管底部没有液体后，使用封口膜封闭试管口部，在封口膜上戳上小孔，让其与外界联通，将其放入真空干燥罐内，避光，打开真空泵，抽真空3～4h将残余溶剂充分挥发干净；
(2)薄膜水化：使用1mlph＝7.2～7.4的0.01mpbs在65℃水振荡水化试管中的脂质薄膜，振荡2min，涡旋仪上涡旋20s(5个循环后)，待试管壁上的薄膜脱落，使用液氮冷冻，并在65℃迅速融化并涡旋，5个循环后，液体中无肉眼可见的聚集颗粒，得到脂质体混合液；
(3)脂质体挤压：准备脂质体挤压器，将挤压器加热至65℃，使用挤压器挤压水化的紫红素18-脂质体，依次通过200nm、100nm聚碳酸酯膜，10个循环后，制备的65％pp18-lipos悬浊液变为透亮液体，将降至室温保存于4℃冰箱。
通过观察，制备的pp18-lipos溶液透亮，无肉眼可见的聚集颗粒。
通过改变旋改变挤压时的温度，发现在65℃挤压时顺畅，获得pp18-lipos稳定性较好。
改变pp18-lipid比例，制备0％～65％pp18-lipos，即pp18-lipos的物质的量占二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、胆固醇(chol)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dspe-peg2000)和pp18-lipid的总的物质的量的百分数为1％～65％，对实施例6和实施例11制备的产物采用透射电镜观察成呈现球形囊泡状、大小均一，分布在100nm左右，如图6所示。
实施例7-11制备的产物的粒径均分布在100nm左右。通过动态光散射检测制备的1％～65％pp18-lipos，粒径大小也电镜观察一致，分散系数较小，分散性良好，如图7。
实施例12
采用单线态氧探针，使用荧光分光光度计检测单线态氧产率。
取制备好的不同比例紫红素18-脂质体，使用0.2μmsosg稀释紫红素18-脂质体至10μg/ml(以pp18浓度等量计算)，pbs组作为对照组，每个比例四个光剂量分别为0j/cm2，5j/cm2，10j/cm2，15j/cm2，每个光剂量三个重复，分别置于96孔板，每孔200μl，打开激光器，调节激光器功为50mw，调节光斑直径1cm(光密度为63.66mw/cm2)，预热30min，垂直照射每组样品，通过调节照射时间(光剂量所对应时间分别是0s，78s，156s，234s)，调整光照剂量；处理后收集缓冲液，用荧光分光光度计对波段510～540nm处荧光强度进行检测(激发波长504nm)，统计522.5nm处荧光强度。
经测定2％pp18-lipos比其他比例的pp18-lipos单线态氧产率显著高，如图8。
实施例13
利用热红外相机对不同比例紫红素18-脂质体光热转化性能进行检测，将不同比例紫红素18-脂质体稀释一定倍数，保证脂质体摩尔含量相同，将10μl的稀释的紫红素18-脂质体加入直径0.35cm的ep管底部，打开705nm波长的激光器，调节功率75mw，调节光斑直径0.35cm(光密度为750mw/cm2)，预热30min待输出功率稳定，垂直照射ep管中样品，同时使用热红外相机监测样品温度变化，直至温度无显著升高，并拍照，统计数据，绘制各比例紫红素18-脂质体光照下温度随时间的变化曲线。
经数据分析65％pp18-lipos比其他比例的pp18-lipos升温明显较快，温度最高，如图9。
实施例14
采用mtt检测本发明实施例11制得的pp18-lipos对人乳腺癌mda-mb-231细胞毒性。
(1)布板：将mda-mb-231细胞，胰蛋白酶消化，以密度为2×105cells/ml，接种于96孔板中，每孔100μl，每组6个重复，37℃，5％co2孵箱中培养12～16h，让细胞充分贴壁伸展在孔板底部。
(2)加药：待细胞完全铁壁伸展，随机分成对照组(control)，pp18-lipos单药组，pp18单药组。
(3)加mtt：分别在0h，24h，48h时，加入20μl/孔的mtt，孵箱中避光孵育4h后，酶标仪检测各孔od值。
经检测pp18-lipos毒性较pp18毒性显著降低，如图10。
实施例15
采用mtt检测本发明实施例6制得的pp18-lipos对人乳腺癌mda-mb-231介导的光动力(photodynamictherapy，pdt)治疗。
1)布板：将mda-mb-231细胞，胰蛋白酶消化，调整密度为2×105cells/ml接种于96孔板中，每孔100μl，每组6个重复，37℃，5％co2细胞培养箱中培养12～16h。
2)加药：随机分成对照组(control)，单独光照组(laser)，单药组，处理组：设置3个光剂量梯度2.5，5，7.5j/cm2；按分组加药，mda-mb-231，浓度2.5μg/ml。
3)处理：孵育24h，弃上清，加入100μl新鲜的完全培养基，打开激光器，调节激光器功为50mw，调节光斑直径1cm(光密度为63.66mw/cm2)，垂直照射处理组样品。
4)加mtt：分别在光照处理6h，24h后，加入20μl/孔的mtt溶液，孵箱中避光孵育4h后，酶标仪检测各孔od值。
经检测pp18-lipos对人乳腺癌mda-mb-231介导的pdt杀伤显著，如图11。
实施例16
采用mtt检测本发明实施例11制得的pp18-lipos对人乳腺癌mda-mb-231介导的光热(photothermaltherapy，ptt)治疗
1)布板：将mda-mb-231细胞，胰蛋白酶消化，调整密度为2×105cells/ml接种于384孔板中，每孔20μl，每组6个重复，共6组，37℃，5％co2细胞培养箱中培养12～16h。
2)加药：随机分成对照组(control)，处理组：设置6个浓度梯度，按分组加药mda-mb-231细胞加药0.01825，0.0375，0.075，0.15，0.3，0.5μl/ml，每孔20μl，继续培养。
3)处理：孵育24h，打开激光器，调节激光器功为80mw，调节光斑直径0.35cm(光密度为800mw/cm2)，预热30min，垂直照射处理组样品，调节照射时间。
4)加mtt：光照处理4h后，加入10μl/孔的mtt溶液避光孵育4h后，多功能酶标仪检测各孔od值。
经检测pp18-lipos对人乳腺癌mda-mb-231介导的ptt杀伤显著，如图12。
实施例17
利用小动物活体成像评价本发明实施例6制得的pp18-lipos在小鼠体内近红外荧光成像，并观察pp18-lipos在肿瘤及各组织的富集情况，。
取体重18g～20g的babl/c小鼠3只，在小鼠背部右下方接种4t1细胞1×106个，待老鼠肿瘤体积用游标卡尺进行测量，肿瘤体积(mm3)＝(a×b2)/2，a为肿瘤最长径，b为肿瘤最短径，平均体积达到50～100mm3，选三只小鼠，尾静脉注射200μl的pp18-lipos(pp18浓度3.14mg/kg)，分别在0.5h、1h、3h、6h，12h、24h、36h，48h对小鼠进行异氟烷气体麻醉，将小鼠置于活体成像系统拍照。
为了研究pp18-lipos在小鼠肿瘤及各器官中的分布情况，采用与上述同样的小鼠肿瘤模型3只作为研究对象，尾静脉注射200μl的pp18-lipos(pp18浓度3.14mg/kg)，选用肿瘤部位荧光强度最大的时间作为参考，将此时间点的小鼠处死，快速而准确地取肿瘤、心脏、肝、脾、肺、肾，利用小动物活体成像系统对其进行成像。
对荧光强度进行统计，如图13，小鼠肿瘤部位出现相较于其他器官较多的富集。
实施例18紫红素18-磷脂的合成
(1)将pp18、lipid、edci(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)与dmap(4-(二甲氨基)吡啶)按摩尔比0.5：1：1：2混合于10ml除水的三氯甲烷中，混合、避光、氩气保护、搅拌24h，形成混合液i。其中，pp18分子量为564.631，p-lysopc分子量为495.63。pp18与三氯甲烷的比为56.4mg：10ml。
(2)将烘干的三口瓶置于磁力搅拌器上，连接氩气保护，将混合液i加入到三口瓶中，打开磁力搅拌器避光搅拌24h，形成反应混合液ii。
(3)将反应混合液ii与硅胶粉末混合，37℃旋转蒸发去除三氯甲烷，样品吸附在硅胶上，装硅胶柱，上样，加入洗脱剂，对混合样品进行柱层析纯化，采用梯度洗脱，洗脱剂极性由高到低依次为①三氯甲烷：甲醇体积比为9:1，②三氯甲烷：甲醇体积比为8.5：1.5，③三氯甲烷：甲醇：醋酸体积比为8：1.5：0.5，纯化产物pp18-lipid使用薄层色谱检测。
(4)将收集的pp18-lipid，使用旋转蒸发仪在37℃去除三氯甲烷与甲醇，65℃去除醋酸，初步干燥，转移分装至试管中，氮气进一步干燥，再置于真空干燥罐中真空干燥3h，封口膜密封，保存于-20℃冰箱备用。
实施例19紫红素18-磷脂的合成
与实施例18不同在于，pp18、lipid、edci与dmap(4-(二甲氨基)吡啶)的摩尔比0.8：1：2：1。
实施例20紫红素18-磷脂的合成
与实施例18不同在于，pp18、lipid、edci(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)与dmap(4-(二甲氨基)吡啶)的摩尔比1：1：1：1.5。
实施例21紫红素18-磷脂的合成
与实施例18不同在于，pp18、lipid、edci(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)与dmap(4-(二甲氨基)吡啶)的摩尔比0.7：1：1.5：1.2。
实施例22紫红素18-脂质体纳米囊泡的制备
(1)将二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇(chol)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dspe-peg2000)和pp18-lipid(以紫红素18质量计算)分别溶于氯仿中，分别选以二硬脂酰磷脂酰胆碱：chol：dspe-peg2000：pp18-lipid摩尔比为47：40：5：8的量混合依次加入试管中，形成pp18-lipid的物质的量的百分数为1～65％的磷脂混合液，置于65℃水浴锅中加热5min。
(3)将试管固定于氮气吹干装置上，避光，打开氮气至气流稳定均匀吹出，将氮气吹入试管中，随着氮气吹入，氯仿蒸发，待试管壁上形成均匀脂质薄膜且试管底部没有液体后，关闭氮气；
(4)使用封口膜封闭试管口部，在封口膜上戳上小孔，让其与外界连通，将其放入真空干燥罐内，避光，打开真空泵，抽真空3～4h将残余溶剂充分挥发干净；
(5)使用1mlph＝7.2～7.4的0.01mol/lpbs在65℃水振荡水化试管中的脂质薄膜，振荡2min，涡旋仪上涡旋20s(5个循环后)，待试管壁上的薄膜脱落，使用液氮冷冻，并在65℃迅速融化并涡旋，5个循环后，液体中无肉眼可见的聚集颗粒，得到水化的紫红素脂质混合液；
(6)准备脂质体挤压器，将挤压器加热至40～65℃，采用挤压器挤压水化的紫红素18-脂质体，依次通过200nm、100nm聚碳酸酯膜，10个循环后，悬浊液变为透亮液体，即制得紫红素18-脂质体，然后加入冻干保护剂冻干，以紫红素18-脂质体冻干剂保存；其中，冻干保护剂为甘露糖、乳糖、葡萄糖、氨基酸、蔗糖、聚乙二醇中的一种或者任意两种以上的混合物，置于-80℃冰箱，预冻12h，然后放入冷冻干燥机中冻干24h，制得干燥的紫红素18-脂质体冻干剂。
实施例23紫红素18-脂质体纳米囊泡的制备
与实施例22的不同在于，dspc：chol：dspe-peg2000：pp18-lipid摩尔比为35：30：5：30。
实施例24紫红素18-脂质体纳米囊泡的制备
与实施例22的不同在于，dspc：chol：dspe-peg2000：pp18-lipid摩尔比为20：35：5：40。
实施例25紫红素18-脂质体纳米囊泡的制备
与实施例22的不同在于，dspc：chol：dspe-peg2000：pp18-lipid摩尔比为13：32：5：50。
本发明采用酰化反应，有机合成pp18-lipid，通过dspc：chol：dspe-peg2000：pp18-lipid以一定比例混合，使用挤压法合成粒径100nm的pp18-lipos纳米囊泡，具有以下优点：(1)与传统的用于载卟啉的脂质体系统相比，极大地提高了紫红素18在脂质体上的负载率；(2)提高了紫红素18在肿瘤部位的被动靶向性能；(3)改善了紫红素18在水溶液中易聚集的性质，提高了组织相容性，降低其毒性；(4)用于制备肿瘤治疗的药物：由于构建的pp18-lipos纳米囊泡，大量的紫红素18整齐的堆叠在脂质双分子层之间，从而产生荧光自淬灭现象，在特定波长照射下，将原本激发的荧光转化为热能，可作为光热剂，实现光热转化，用于肿瘤光热治疗(ptt)；(5)通过降低pp18-lipid比例，在低比例pp18-lipos中，卟啉在特定波长光照射下，荧光未发生淬灭，并产生单线态氧，作为光敏剂，可用于光动力治疗(pdt)肿瘤；(6)肿瘤诊断与成像：低比例pp18-lipos由于荧光未发生淬灭可用于体内肿瘤近红外荧光成像。构建的卟啉脂质体被动靶向于肿瘤部位，即作为肿瘤治疗的光敏剂/光热剂，也可用于肿瘤诊断成像，克服了传统药物的弊端，提高了肿瘤治愈率。