一种胸腺肽注射液的制备方法与流程

本发明属于生物制品制备方法的技术领域，具体地说涉及一种胸腺肽注射液的制备方法。

背景技术：

当前，在对食品营养和安全性要求提高、环保意识日益增强的情况下，迫切需要寻求通过改善动物机体内分泌来促进生长，改善胴体品质和风味，进而解决使用添加剂促进生长与肉质下降、药物残留的矛盾的有效途径。

胸腺肽是由胸腺组织上皮细胞分泌的一类多肽激素，可促进t细胞的成熟，同时参与神经内分泌系统和免疫系统的交互作用，激活细胞免疫。自1949年roberts等首次用小牛胸腺组织制备胸腺肽粗体液以来，国内外诸多学者致力于这方面研究工作，在提取分离、理化性质、结构功能、药理临床等方面均取得极大进展。近年来，在兽医临床的防治试验中也取得了满意的效果，为病毒性和肿瘤疾病的治疗带来了新的希望。

传统生产方法生产胸腺肽注射液，原料经预处理、绞碎、匀浆、冻融、浓缩、超滤膜超滤等工艺制成，传统生产工艺不能有效去除杂蛋白、内毒素及外源病毒等，会破坏原材料的有效活性成分，有效成分利用率低，且生产周期长。

技术实现要素：

针对现有技术的种种不足，发明人在长期实践中研究设计出一种胸腺肽注射液的制备方法，有效去除工艺杂蛋白和外源病毒。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种胸腺肽注射液的制备方法，包括以下步骤：

s1、小牛胸腺的收集与检验：采集小牛胸腺所用小牛进行屠宰，得到小牛胸腺，经外观、病原微生物、外源病毒检验合格后用作制备胸腺肽注射液原料；

s2、预处理：将检验合格的小牛胸腺去除外包装和内包装，剪去脂肪和筋膜，然后用浓度为0.9％的氯化钠溶液清洗2～3次；

s3、初绞：将小牛胸腺原料置于绞肉机内，初绞1～3遍，然后用干净的物料桶盛装；

s4、精绞：将初绞的胸腺与纯化水按1:1～1:2的比例混合，置于胶体磨中研磨；

s5、低温超声裂解：将精绞的匀浆液置于超声波粉碎仪中超声裂解，裂解温度为2～8℃，得到裂解液；

s6、酸化：将裂解液用盐酸溶液调节ph值至2.0～2.5，再置于-20℃冷库中冻融1～2次，得到冻融匀浆；

s7、加热保温：将上述冻融匀浆加热至80℃或82℃，保温10～20分钟，用滤布过滤，再水浴冷却至50℃以下，制成提取液；

s8、离心分离：将滤布过滤后的提取液置于管式离心机中，室温下离心，去沉淀，取上清液备用；

s9、过滤与超滤：将上述上清液用微孔滤膜进行过滤和除菌，然后用截留分子量为6000kd的超滤膜进行超滤，得到胸腺肽注射液半成品并对其进行检验；

s10、成品制备：将半成品溶液移入配液罐中，加入注射用水，混匀，既得成品。

进一步地，步骤s1中采集的小牛年龄小于24个月。

进一步地，步骤s2预处理过程中还包括：在去除外包装后、去除内包装前，先放入缓存区，用1％th4+消毒液浸泡消毒3～5分钟，th4+消毒液是法国农业部批准的一种含多种双链季铵盐、戊二醛、萜品醇及松脂的复合消毒剂(后简称th4+消毒液)。

进一步地，步骤s6所用盐酸为2mol/l盐酸。

进一步地，步骤s7所用滤布为250～350目孔径的滤布。

进一步地，步骤s8中对提取液在室温下以15000～20000r/min的转速连续离心。

进一步地，步骤s9中用微孔滤膜进行过滤过程包括，先用0.43～0.46μm的微孔滤膜进行过滤，再用0.22～0.25μm的微孔滤膜进行过滤除菌。

进一步地，步骤s9中对半成品检验包括ph值测定、含量测定、细菌内毒素检验和高分子量物质检验，合格后，在-20℃下保存备用。

进一步地，步骤s10中，加入注射用水后，使多肽含量不少于1.5mg/ml，核糖含量不少于55μg/ml，搅拌30分钟后，用盐酸或氢氧化钠溶液调ph值至6.0～7.5之间，混匀。

本发明的有益效果是：

采用管式离心机，克服了传统制备工艺中原料粘度大、絮状物多、比重小等问题，有效的保护了材料原有生物活性成分；采用低温超声波裂解法，该方法在保证产品安全性的基础上，不但避免了传统高温生物灭活方法带来的活性成分损失的弊端，而且还降低了生产成本，提高了生产效率；采用截留分子量6000kd的超滤膜进行超滤，不仅保证了产品的活性成分不被损失，有效成分利用率更高，还能更好去除外源病毒及内毒素等，工艺简单，成本低，可大大缩短生产周期，节省人力物力，提高生产效率，为工业化大规模生产提供了可行途径，应用前景更广。

附图说明

图1是本发明的外源病毒检测图片。

附图中：(a)-放大200倍的bvdv阳性图片、(b)-放大200倍的bvdv阴性照片。

具体实施方式

为了使本领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合较佳的实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：

一种兽用胸腺肽注射液的制备方法，具体步骤如下：

s1：小牛胸腺的收集与检验

原料选取标准化生牛养殖、屠宰企业收集小牛胸腺，采集小牛胸腺所用小牛品种应为食肉用育肥牛，小牛屠宰时年龄应小于24个月。屠宰企业应具有《动物防疫合格证》，屠宰场应符合gb/t19477-2004《牛屠宰操作规程》和ny467-2001《畜禽屠宰卫生检疫规范》的规定，卫生要求应符合gb12649《肉类加工厂卫生规范》的规定。

小牛胸腺经外观检验、病原微生物检验、外源病毒检验，检验合格后方可用作原料。新鲜的小牛胸腺，肉眼观察颜色鲜明，形态完整，不得有包裹、结节及寄生虫或其他异物，无发黑、发黄现象，味道应无臭味或异味。病原微生物检验，细菌总数应小于10个/ml，霉菌、酵母菌、大肠埃希菌、沙门氏菌应不得检出。外源病毒检验应无牛病毒性腹泻病毒、牛蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、布鲁氏杆菌、牛结核分枝杆菌污染。

s2：预处理

将检验合格的新鲜小牛胸腺或冷冻的小牛胸腺，去除外包装(勿损内包装)，放入缓存区，用1％th4+消毒液浸泡消毒3分钟后去除内包装，剪去脂肪和筋膜，再用浓度为0.9％的氯化钠溶液清洗2次。

s3：初绞：将小牛胸腺原料置于绞肉机装料斗内，按绞肉机操作规程进行操作，初绞1遍，并用洁净物料桶盛装。

s4：精绞：将初绞的胸腺与纯化水按1:1的比例混合，置于胶体磨中研磨。

s5：低温超声裂解：将精绞的匀浆液置于超声波粉碎仪中超声裂解，裂解温度控制在2～8℃。

s6：酸化：将裂解液用2mol/l盐酸溶液调节ph值至2.0，再置-20℃冷库中冻融1次。

s7：加热保温：将上述冻融匀浆液加热至80℃，保温10分钟，用250目的滤布过滤，水浴冷却至50℃以下，制成提取液。

s8：离心分离：将滤布过滤的提取液置于管式离心机中，室温下以15000r/min的转速连续离心，去沉淀，取上清液备用。

s9：过滤与超滤：上清液用0.43μm的微孔滤膜进行过滤，再用0.23μm的微孔滤膜进行过滤除菌，然后用截留分子量为6000道尔顿超滤膜进行超滤，即得胸腺肽注射液半成品。超滤液在-20℃以下，保存期为12个月。

s10：半成品检验：半成品经ph值、含量测定、细菌内毒素检验、高分子量物质检验等检验项目合格后，-20℃保存备用。

s11：成品制备：将半成品溶液移入配液罐中，根据半成品含量测定结果，加入注射用水，使多肽含量不少于1.5mg/ml，核糖含量不少于55μg/ml，搅拌30分钟后，用盐酸或氢氧化钠溶液调ph至6.0～7.5之间，混匀，即得成品。

实施例2：

一种兽用胸腺肽注射液的制备方法，具体步骤如下：

s1：小牛胸腺的收集与检验

原料选取标准化生牛养殖、屠宰企业收集小牛胸腺，采集小牛胸腺所用小牛品种应为食肉用育肥牛，小牛屠宰时年龄应小于24个月。屠宰企业应具有《动物防疫合格证》，屠宰场应符合gb/t19477-2004《牛屠宰操作规程》和ny467-2001《畜禽屠宰卫生检疫规范》的规定，卫生要求应符合gb12649《肉类加工厂卫生规范》的规定。

小牛胸腺经外观检验、病原微生物检验、外源病毒检验，检验合格后方可用作原料。新鲜的小牛胸腺，肉眼观察颜色鲜明，形态完整，不得有包裹、结节及寄生虫或其他异物，无发黑、发黄现象，味道应无臭味或异味。病原微生物检验，细菌总数应小于10个/ml，霉菌、酵母菌、大肠埃希菌、沙门氏菌应不得检出。外源病毒检验应无牛病毒性腹泻病毒、牛蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、布鲁氏杆菌、牛结核分枝杆菌污染。

s2：预处理

将检验合格的新鲜小牛胸腺或冷冻的小牛胸腺，去除外包装(勿损内包装)，放入缓存区，用1％th4+消毒液浸泡消毒5分钟后去除内包装，剪去脂肪和筋膜，再用浓度为0.9％的氯化钠溶液清洗3次。

s3：初绞：将小牛胸腺原料置于绞肉机装料斗内，按绞肉机操作规程进行操作，初绞3遍，并用洁净物料桶盛装。

s4：精绞：将初绞的胸腺与纯化水按1:2的比例混合，置于胶体磨中研磨。

s5：低温超声裂解：将精绞的匀浆液置于超声波粉碎仪中超声裂解(2～8℃)。

s6：酸化：将裂解液用2mol/l盐酸溶液调节ph值至2.4，再置-20℃冷库中冻融1次。

s7：加热保温：将上述冻融匀浆液加热至82℃，保温20分钟，用300目的滤布过滤，水浴冷却至50℃以下，制成提取液。

s8：离心分离：将滤布过滤的提取液置于管式离心机中，室温下以18000r/min的转速连续离心，去沉淀，取上清液备用。

s9：过滤与超滤：上清液用0.45μm的微孔滤膜进行过滤，再用0.22μm的微孔滤膜进行过滤除菌，然后用截留分子量为6000道尔顿超滤膜进行超滤，即得胸腺肽注射液半成品。超滤液在-20℃以下，保存期为12个月。

s10：半成品检验：半成品经ph值、含量测定、细菌内毒素检验、高分子量物质检验等检验项目合格后，-20℃保存备用。

s11：成品制备：将半成品溶液移入配液罐中，根据半成品含量测定结果，加入注射用水，使多肽含量不少于1.5mg/ml，核糖含量不少于55μg/ml，搅拌30分钟后，用盐酸或氢氧化钠溶液调ph至6.0～7.5之间，混匀，即得成品。

实施例3：

一种兽用胸腺肽注射液的制备方法，具体步骤如下：

s1：小牛胸腺的收集与检验

原料选取标准化生牛养殖、屠宰企业收集小牛胸腺，采集小牛胸腺所用小牛品种应为食肉用育肥牛，小牛屠宰时年龄应小于24个月。屠宰企业应具有《动物防疫合格证》，屠宰场应符合gb/t19477-2004《牛屠宰操作规程》和ny467-2001《畜禽屠宰卫生检疫规范》的规定，卫生要求应符合gb12649《肉类加工厂卫生规范》的规定。

小牛胸腺经外观检验、病原微生物检验、外源病毒检验，检验合格后方可用作原料。新鲜的小牛胸腺，肉眼观察颜色鲜明，形态完整，不得有包裹、结节及寄生虫或其他异物，无发黑、发黄现象，味道应无臭味或异味。病原微生物检验，细菌总数应小于10个/ml，霉菌、酵母菌、大肠埃希菌、沙门氏菌应不得检出。外源病毒检验应无牛病毒性腹泻病毒、牛蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、布鲁氏杆菌、牛结核分枝杆菌污染。

s2：预处理

将检验合格的新鲜小牛胸腺或冷冻的小牛胸腺，去除外包装(勿损内包装)，放入缓存区，用1％th4+消毒液浸泡消毒4分钟后去除内包装，剪去脂肪和筋膜，再用浓度为0.9％的氯化钠溶液清洗2次。

s3：初绞：将小牛胸腺原料置于绞肉机装料斗内，按绞肉机操作规程进行操作，初绞2遍，并用洁净物料桶盛装。

s4：精绞：将初绞的胸腺与纯化水按1:1.5的比例混合，置于胶体磨中研磨。

s5：低温超声裂解：将精绞的匀浆液置于超声波粉碎仪中超声裂解(2～8℃)。

s6：酸化：将裂解液用2mol/l盐酸溶液调节ph值至2.5，再置-20℃冷库中冻融2次。

s7：加热保温：将上述冻融匀浆液加热至82℃，保温15分钟，用350目的滤布过滤，水浴冷却至50℃以下，制成提取液。

s8：离心分离：将滤布过滤的提取液置于管式离心机中，室温下以20000r/min的转速连续离心，去沉淀，取上清液备用。

s9：过滤与超滤：上清液用0.46μm的微孔滤膜进行过滤，再用0.25μm的微孔滤膜进行过滤除菌，然后用截留分子量为6000道尔顿超滤膜进行超滤，即得胸腺肽注射液半成品。超滤液在-20℃以下，保存期为12个月。

为验证超滤工艺对胸腺外源病毒的灭活效果，采取添加指示病毒的方法，生产工艺按照实施例2的步骤执行。结果显示，截留分子量为6000kd的超滤膜对离心液中添加的指示病毒能完全去除，用荧光抗体检测法检测超滤液均为阴性。由此说明胸腺肽注射液使用超滤工艺能有效的去除原料中可能存在的各种外源病毒。

①试验设计

本实施例中，参照《中国兽药典》2015年版(三部)附录中“非禽源外源病毒检测”方法，采用添加牛病毒性腹泻病毒的方法，以检测超滤工艺对外源病毒的去除效果。

②超滤效果检测

牛病毒性腹泻病毒检测按《中国兽药典》2015年版(三部)附录“非禽源外源病毒检测”的荧光抗体法进行检验。

③方法

试验分为对照组和添加指示病毒组。在胸腺肽离心液中按100tcid50/ml添加牛病毒性腹泻病毒，然后进行荧光抗体检测。通过0.45μm、0.22μm滤膜过滤，最终通过6000分子量超滤获得胸腺肽注射液半成品，使用荧光抗体法检测半成品中的牛病毒性腹泻病毒。

④试验结果

(1)胸腺肽离心液中添加指示病毒后的检测结果：胸腺肽离心液中添加指示病毒后，用荧光抗体法检测，均出现特异性荧光。结果见表1，荧光图片见图1(a)图。

表1胸腺肽离心液中添加指示病毒后的检测结果

(2)胸腺肽提取液指示病毒经超滤后荧光抗体检测结果：胸腺肽离心液中添加指示病毒经超滤后，用荧光抗体法检测，均未出现特异性荧光。结果见表2，荧光图片见图1(b)图。

表2胸腺肽离心液中指示病毒的检测结果

超滤是一种具有分子水平的滤膜过滤手段，它用特殊的超滤膜为分离介质，以膜两侧的压力差为动力，将不同分子量的溶质进行选择性分离。在药物生产中超滤对于病毒或细菌产生的毒素有良好的去除作用，过滤病毒是超滤膜最为特长的功能，只要选择的截留规格完全正确，它可以将病毒完全清除掉。各种病毒基本可以使用超滤膜来去除，一般使用10kd以下的超滤膜基本可以除净。

目前已知的所有动物病毒，没有一种分子量低于6000道尔顿，即使是最小的核酸病毒。因此，超滤工艺采用6000分子量可确保外源病毒在此过程中通过超滤去除，我们的试验结果也予以确认。超滤的特殊原理，使其过膜压力很小，不存在破膜的问题，因此采用此工艺生产胸腺肽注射液是安全、有效的。

s10：半成品检验：半成品经ph值、含量测定、细菌内毒素检验、高分子量物质检验等检验项目合格后，-20℃保存备用。

半成品具体检验方法如下：

1、性状：本发明生产的半成品外观性状为微黄色澄明液体，符合胸腺肽注射液的外观性状。

2、ph值：按照现行《中华人民共和国兽药典》进行测定，本发明生产的半成品ph值在6.0～7.5之间，符合相关规定。

3、微生物检验：按照现行《中华人民共和国兽药典》进行检验，本发明生产的半成品细菌总数为2个，霉菌、酵母菌、大肠埃希菌和沙门氏菌未检出，符合规定。

4、含量测定：

①多肽含量：按福林酚法进行，每1ml应不少于1.65mg，上本发明生产的半成品多肽含量为2.36mg/ml。

②核糖含量：按核糖含量测定法进行，每1ml应不少于55μg，本发明生产的半成品核糖含量为70.23μg/ml。

5、细菌内毒素检测：按现行《中国兽药典》附录进行检验，每毫升中细菌内毒素含量应不超过10eu。本发明生产的半成品细菌内毒素含量＜10eu/ml

s11：成品制备：将半成品溶液移入配液罐中，根据半成品含量测定结果，加入注射用水，使多肽含量不少于1.5mg/ml，核糖含量不少于55μg/ml，搅拌30分钟后，用盐酸或氢氧化钠溶液调ph至6.0～7.5之间，混匀，即得成品。

成品检验方法如下：

1、性状：本发明生产的胸腺肽注射液为微黄色澄明液体，符合胸腺肽注射液的外观性状。

2、ph值：按照现行《中华人民共和国兽药典》进行测定，本发明生产的胸腺肽注射液的ph值在6.0～7.5之间，符合规定。

3、鉴别检验：本发明生产的胸腺肽注射液，加40％氢氧化钠溶液0.5ml，摇匀，再加1％硫酸铜溶液1.0ml，溶液显紫红色，说明氨基酸鉴别反应为正反应。

4、无菌检验：按照现行《中华人民共和国兽药典》进行检验，本发明生产的胸腺肽注射液无菌生长。

5、支原体检验：按照现行《中华人民共和国兽药典》进行检验，本发明生产的胸腺肽注射液无支原体生长。

6、外源病毒检验：按照现行《中华人民共和国兽药典》非禽源细胞及其制品的检验方法进行检验，本发明生产的胸腺肽注射液无外源病毒污染。

7、安全检验：

①用鸡检验

用1日龄无特定病原(下简称spf)雏鸡20只，随机分为口服组和肌肉注射组，每组10只，口服组每只雏鸡各口服本发明生产的胸腺肽注射液0.5ml，连用3日，肌肉注射组每只雏鸡各注射本发明生产的胸腺肽注射液0.5ml，各组自第1日使用开始，连续观察14日，spf雏鸡全部健活。

②热原检查：按现行《中国兽药典》附录进行检验，本发明生产的胸腺肽注射液符合规定。

③异常毒性检查：按现行《中国兽药典》附录进行检验，本发明生产的胸腺肽注射液符合规定。

④过敏反应检查：按现行《中国兽药典》附录进行检验，本发明生产的胸腺肽注射液符合规定。

8、含量测定：

①多肽含量：按福林酚法进行，每1ml应不少于1.5mg，本发明生产的猪脾转移因子注射液中多肽含量为2.08mg/ml。

②核糖含量：按核糖含量测定法进行，每1ml应不少于50μg，本发明生产的猪脾转移因子注射液中核糖含量为65.12μg/ml。

9、效力检验

①活力测定：取本发明生产的胸腺肽注射液适量，按t细胞活性测定法—脱e受体法测定，供试品管的e玫瑰花结百分率与对照管的e玫瑰花结百分率之差应不低于12.0％，上述所得成品e玫瑰花环百分率比对照管分别增加21.3％。

②免疫法检验：用7～14日龄spf鸡30只，随机分成3组，每组10只，第1组为对照组，点眼免疫鸡新城疫活疫苗(lasota株，下同)，1羽份/只；第2组为口服给药组，点眼免疫鸡新城疫活疫苗，1羽份/只，同时口服本发明生产的胸腺肽注射液，10μl/只；第3组为肌肉注射给药组，点眼免疫鸡新城疫活疫苗，1羽份/只，同时肌肉注射本发明生产的胸腺肽注射液，5μl/只，鸡新城疫活疫苗免疫后21天采血，分离血清，检测鸡新城疫hi抗体。口服给药组和肌肉注射给药组鸡新城疫hi抗体平均滴度分别比对照组的高1.2log2和1.1log2，符合规定。

10、最小装量：按照现行《中华人民共和国兽药典》进行测定，本发明生产的胸腺肽注射液均符合规定。

本发明生产的胸腺肽注射液质量稳定，活性高，不为胰蛋白酶、dna酶、rna酶所破坏，注射及口服均可；临床用量小，见效快，持续时间长，作用不具种属特异性，可交叉用于各种动物；不具抗原性，长期应用也不刺激机体产生抗体，产品应用安全，无任何毒副作用，无任何药物残留。胸腺肽注射液能够增强动物免疫功能，提高抗感染能力，疫苗接种时同时使用，促进疫苗免疫效果。

以上已将发明做一详细说明，以上所述，仅为本发明之较佳实施例而已，当不能限定本发明实施范围，即凡依本申请范围所作均等变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖范围内。