本发明属于中药应用
技术领域：
，具体涉及复方鳖甲软肝片在制备治疗急性肝损伤药物中的应用。
背景技术：
：复方鳖甲软肝片是由鳖甲(制)、莪术、赤芍、当归、三七、党参、黄芪、紫河车、冬虫夏草、板蓝根、连翘十一味药组成，该品种是完全拥有自主知识产权的独家品种，是国内第一个预防、治疗慢性乙型肝炎肝纤维化以及早期肝硬化的药物，现已入选国家基本医疗保险药品目录。目前已获得2项专利授权，一种治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的中药制剂及其制备方法(专利号：zl00105695.6)；外观设计专利(专利号：zl99310690.0)。复方鳖甲软肝片是国家中药保护品种，2009年完成了延长中药保护期申报工作。复方鳖甲软肝片具有软坚散结、化瘀解毒、益气养阴的功能，可用于治疗慢性乙型肝炎纤维化及早期肝硬化。本方中鳖甲为君药，味咸性平，入肝，肾经，其既可软坚散结，又可滋阴潜阳，用于肝纤维化的瘀血凝结、肝肾阴血已伤；当归、赤芍、三七三味为臣，以增强养血活血，化瘀散结，助君药消瘕、去积聚、化痞块的作用，祛邪而不伤正；党参、黄芪健脾益气，为佐药；冬虫夏草、紫河车益肾添精，为佐药；板蓝根、连翘清热解毒，为佐药；莪术，其性苦、辛、温，入肝经血分，能引经报使，故为使药。该复方制剂具有抗肝纤维化，主要对纤维化形成初期阶段、抑制fscs增殖、减少胶原蛋白的合成、降低胶原蛋白在disse腔过量沉积、对已形成的肝纤维化亦具有一定的改善作用。复方鳖甲软肝片中药制剂攻补兼施、标本兼顾，使热毒余邪得以清除，肝脾肾三脏功能得以恢复，现于肝络之瘀血得以消散，达到扶正消症的目的，有软坚散结、化瘀解毒、益气养阴的功效，有效率为81.67％，治愈率为55.23％。目前，复方鳖甲软肝片仅作为治疗肝纤维化药物进行使用，其适应症单一。技术实现要素：为了解决目前复方鳖甲软肝片适应症单一的问题，本发明对复方鳖甲软肝片的适应症进行了新的研究。本发明的目的在于公开了复方鳖甲软肝片在制备治疗急性肝损伤药物中的应用。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：复方鳖甲软肝片在制备治疗急性肝损伤药物中的应用。上述技术方案所述的应用，其中，所述复方鳖甲软肝片具有降低急性肝损伤引起的肝脏指数升高和脾脏指数升高的作用。上述技术方案所述的应用，其中，所述复方鳖甲软肝片具有降低急性肝损伤引起的血清中alt及ast水平增高的作用。上述技术方案所述的应用，其中，所述复方鳖甲软肝片具有升高急性损伤所致alb的骤降，改善小鼠急性肝细胞损伤的作用。上述技术方案所述的应用，其中，所述复方鳖甲软肝片具有提高tp，降低t-bil及alp水平的作用。上述技术方案所述的应用，其中，所述复方鳖甲软肝片具有升高急性肝损伤引起的中sod及gsh-px水平降低的作用和降低由急性肝损伤引起的血清中mda含量升高的作用。上述技术方案所述的应用，其中，所述复方鳖甲软肝片具有减轻肝细胞水肿、气球样变及炎性细胞浸润，表现出明显的抗肝组织损伤效果。复方鳖甲软肝片原先是作为治疗慢性乙型肝炎肝纤维化以及早期肝硬化的药物使用，肝纤维化是指肝脏内弥漫性细胞外基质(ecm)的过度沉积，是机体对慢性肝损伤的一种修复反应。能够引起几乎各种慢性肝病的因素均可引起肝纤维化，其病因大致可分为感染性、先天性代谢缺陷、酒精中毒性、化学毒物性、自身免疫性肝病等。纤维化的发病机制：①肝纤维化形成是ecm的合成与降解失衡的结果；②hsc活化是肝纤维化的中心环节；③免疫系统参与肝脏纤维化过程。而本发明中复方鳖甲软肝片作为治疗急性肝损伤药物使用，急性肝损伤涉及短期内突发的肝细胞损害，其病因较多，机理复杂。现代医学认为急性肝损伤的发生与中毒、病毒性肝炎、免疫、血管障碍等相关肝损伤是各种肝脏疾病的病变结果。肝损伤的发生机制颇为复杂,可分为化学性和免疫性。化学机制主要通过细胞色素p450及结合反应产生的中间代谢产物产生损伤，如改变质膜的完整性、线粒体功能失调、细胞内离子浓度变化、降解酶的活性和自由基的作用等；免疫机制则通过细胞因子、一氧化氮、补体及免疫变态反应等产生损伤，病理性细胞凋亡也属其中之一:①自由基脂质过氧化反应与肝损伤；②细胞因子与肝损伤；③细胞凋亡与肝损伤。由此可见，肝纤维化和急性肝损伤在病理上是不同的，本发明提供了复方鳖甲软肝片的新用途。本发明具有以下有益效果：本发明提供了复方鳖甲软肝片的新用途，为急性肝损伤的治疗提供了一种新的药物选择。附图说明：1、图1为为复方鳖甲软肝片对急性肝损伤小鼠肝组织he染色的影响(200×)。具体实施方式：为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明复方鳖甲软肝片在制备治疗急性肝损伤药物中的应用作进一步的说明。实验例1：复方鳖甲软肝片抗小鼠急性肝损伤的实验：一、材料：1、供试品：复方鳖甲软肝片原料药粉(内蒙古福瑞医疗科技股份有限公司)，每克药粉相当于生药1.8545克，批号x20161205，由内蒙古福瑞医疗科技股份有限公司提供或市场购买；联苯双酯(阳性对照药)，批号16100103，由北京协和药厂提供。试验时上述药物均用0.5％cmc-na配制成所需浓度的混悬液。2、主要试剂：四氯化碳(批号20160108，天津永大化学试剂有限公司)；cmc-na(批号151204，安徽山河药用辅料股份有限公司)；alt试剂盒(批号140116024)、ast试剂盒(批号140216018)、alp试剂盒(批号140316014)、alb试剂盒(批号140916014)、tp试剂盒(批号140816013)及t-bil试剂盒(批号140616017)均购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；sod测定试剂盒(批号：20160315)、gsh-px测定试剂盒(批号20160327)及mda测定试剂盒(批号20160318)均购于上海酶联生物科技有限公司。3、主要仪器：yp2002型体重秤(上海越平科学仪器有限公司)；bsa124s电子天平(赛多利科学仪器(北京)有限公司)；酶标仪(伯腾biotek公司)；离心机(kubotacorporation，日本久宝田公司)；b120型全自动生化分析仪(深圳市迈瑞生物医疗电子股份有限公司)。4、实验动物：km小鼠48只，spf级别，雌雄各半，体重(20±2)g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，动物生产许可证号scxk(军)2012-0004；动物质量合格证号no：0041197；解放军第302医院动物中心实验动物使用许可证号syxk(军)2012-0010。5、动物饲养条件：小鼠用全价颗粒饲料(经co60照射灭菌)，由北京科奥协力饲料有限公司提供。使用对小鼠正常的生理活动没有任何影响，并且舒适、没有油脂、没有异味、没有粉尘、吸湿和保湿性能好的玉米芯垫料。经高压灭菌器120℃，灭菌30min，由解放军第302医院动物中心提供。采用sdla-t-0051型无菌饮水器提供水。试验前先喂养3d为适应期。适应期：第1d检疫、称重、尾标，黑色、红色无刺激性的记号笔标尾标，每笼6只，雌雄分开。每天观察记录动物的外观状态并记录体质量。6、给药剂量设计：(1)、供试物剂量设计：处方：鳖甲、莪术、赤芍、当归、三七、党参、黄芪、紫河车、冬虫夏草、连翘、板蓝根；功能主治：软坚散结，化瘀解毒，益气养血，用于慢性肝炎肝纤维化，以及早期肝硬化属瘀血阻络，气血亏虚，兼热毒未尽证；用法与用量：口服，每日3次，每次4片，0.5g/片；临床剂量：0.1g/kg(成人体质量以60kg计算)。药物剂量主要与动物体表面积(近似于体质量的2/3次方)成正比，不同种属间各药剂量差别很大。一般可以简单归纳为：“1、3、5、7、9”，即表示人1g/kg、犬3g/kg、兔5g/kg、大鼠7g/kg、小鼠9g/kg。以上5种剂量，大致相当于临床等效量，且该等效量的误差允许在上述剂量的1倍或0.5倍之间。复方鳖甲软肝片的生药量为0.875g/片，即875g生药/制剂单位(1000片)。人一日生药量为0.875×12＝10.5g，人剂量为10.5/60＝0.175g生药/kg，由每克药粉相当于生药1.8545g可知，人剂量为0.175/1.8545＝0.0944g药粉/kg，换算成小鼠的剂量为0.0944×9.1＝0.8590g药粉/kg，为临床等效量。(2)、联苯双酯(阳性对照药)剂量设计：功能与主治：临床用于慢性迁延肝炎伴alt升高者，也可用于化学毒物、药物引起的alt升高。用法与用量：口服，每日3次，每次5丸。临床剂量：0.375mg/kg(成人体质量以60kg计算)。成人1天服用联苯双酯的剂量为0.375mg·kg-1，由文献可知联苯双酯对小鼠给药剂量0.2g·kg-1，约相当于成人剂量的53.3倍。二、方法：1、动物分组：取经检疫合格的km小鼠48只，准确称取体重，用分组软件将其随机分为4组，每组12只，雌雄各半。分别为阴性对照组(等容量0.5％cmc-na混悬液)、模型对照组(等容量0.5％cmc-na混悬液)、复方鳖甲软肝片剂量组(0.8590g·kg-1，简称“复方组”)及联苯双酯组(阳性对照，0.2g·kg-1)。2、造模及给药：禁食不禁水12h后，除阴性对照组和模型对照组小鼠给予等体积的cmc-na混悬液外，各给药组按设定剂量每天灌胃1d，给药容积均为20ml·kg-1，连续14d。各试验组于末次给药2h后，除阴性对照组小鼠腹腔注射(ip)等容量大豆油外，其余各组小鼠ip0.1％ccl4的大豆油溶液10ml·kg-1，制备小鼠急性肝损伤模型。3、小鼠一般状态观察：观察小鼠在检疫期及给药期间的进食及饮水、大便、活动、皮毛等状态变化。4、小鼠肝脏及脾脏指数变化：小鼠每隔两天称一次体重，小鼠取血后颈椎脱臼处死，剖腹，迅速取出肝脏、脾脏，称重、拍照，计算肝脏指数、脾脏指数(肝脏指数(％)＝肝重(g)/体重(g)×100；脾脏指数(％)＝脾重(g)/体重(g)×100)。5、血液生化检测：小鼠摘取眼球取血分离血清，测各项血液生化指标及脂质过氧化指标，以方差分析进行统计学处理。摘取眼球取血，置于加有抗凝剂的ep管中，3000r/min离心15min，取上清，-20℃冰箱中保存，用全自动血液生化仪检测血清中alt、ast、tp、alb、t-bil、alp水平。6、脂质过氧化指标的测定：根据试剂盒说明，利用双抗夹心法检测超氧化物歧化酶(sod)、丙二醛(mda)、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)的含量。(1)、测定sod方法：(1.1).标准品的稀释：把原倍标准品的浓度梯度稀释成5个浓度。(1.2).加样：把酶标包被板分别设空白孔(不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上准确加入50μl标准品，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，后再加待测样品10μl，使其最终稀释成5倍。(1.3).温育：用封板膜封板后放置在37℃中温育30min。(1.4).洗涤：揭掉封板膜，弃去液体甩干，每孔加满稀释后的洗涤液，静置30s后弃去，重复5次，拍干。(1.5).加酶及温育：除空白孔外，每孔均加入酶标试剂50μl。温育30min后，同样洗涤5次，拍干。(1.6).显色及终止：每孔先加入50μl显色剂a，后加入50μl显色剂b，震荡混匀，37℃避光显色15min。最后每孔加50μl终止液，终止反应(1.7).检测：把空白孔调零后，450nm波长下在酶标仪中测量各孔的吸光度(od值)，并通过标准曲线计算样品中小鼠超氧化物歧化酶(sod)浓度。(2)、mda及gsh-px的测定方法同上。7、小鼠肝组织病理学变化：取小鼠肝大叶相同部位的肝组织固定于10％中性福尔马林溶液中，做病理切片检查。he染色观察肝组织病理形态学的改变。8、统计学处理：实验数据用均数±标准差进行表示，组间数据的比较用单因素方差分析法，数据的处理运用spss19.0数学统计软件，p<0.05认为有统计学意义。三、结果：1、小鼠一般状况观察：各组小鼠造模前状态良好，进食饮水正常，毛发润泽，大便呈黑褐色颗粒状。造模后，除阴性对照组外，剩余各组小鼠均不同程度的反应迟缓，活动减少，其中以模型组最为显著，毛发蓬乱不润泽，大便稀软不成形呈黄绿色。2、对急性肝损伤小鼠肝脏及脾脏指数的影响：结果如表1所示，与阴性对照组比较，模型对照组小鼠的肝脏指数、脾脏指数显著增高(p<0.01)；与模型对照组相比，复方组能降低肝脏指数升高并能显著降低肝损伤小鼠的脾脏指数升高(p<0.01或0.05)，说明复方鳖甲软肝片对小鼠肝脏及脾脏轻度肿胀有一定的缓解作用。表1对ccl4致小鼠急性肝损伤肝脏及脾脏指数的影响(n＝12)组别剂量(g·kg-1)体重(g)肝重(g)脾重(g)肝脏指数(％)脾脏指数(％)阴性对照-30.69±4.411.34±0.200.12±0.034.38±0.120.38±0.04模型对照-28.98±5.401.59±0.340.23±0.11**5.45±0.23**0.78±0.27**复方0.859028.02±4.231.40±0.330.13±0.037##4.97±0.570.49±0.13##联苯双酯0.228.78±6.361.29±0.31#0.12±0.03##4.49±0.35##0.42±0.09##注：与阴性对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与模型对照组比较，#p＜0.05，##p＜0.01。3、对急性肝损伤小鼠血清中alt及ast的影响：结果如表2所示，与阴性对照组相比，模型对照组小鼠血液中ast及alt含量显著增高(p<0.01)；与模型对照组比较，复方组小鼠血清中ast及alt含量均显著降低(p<0.01)。结果表明，复方鳖甲软肝片对急性肝损伤小鼠具有一定的保肝降酶效果。表2对ccl4致小鼠急性肝损伤血液中ast、alt的影响(n＝12)组别剂量(g·kg-1)ast(u/l)alt(u/l)阴性对照-102.50±24.5435.95±12.75模型对照-886.67±177.42**706.76±175.81**复方0.8590391.67±102.5##312.50±104.15##联苯双酯0.2387.42±154.23##300.00±74.19##注：与阴性对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与模型对照组比较，#p＜0.05，##p＜0.01。4、对急性肝损伤小鼠血清alb、glo的影响：结果如表3所示，与阴性对照组相比，模型对照组小鼠血清中alb、a/g明显降低(p<0.05)，血清中glo含量则显著性升高(p<0.01)；与模型对照组相比，复方组小鼠血清中alb及a/g水平均显著升高(p＜0.01或0.05)，而血清中glo含量仅有降低趋势。结果提示，复方鳖甲软肝片可明显升高急性损伤所致alb的骤降，改善小鼠急性肝细胞损伤。表3对ccl4致急性肝损伤小鼠血液中alb、glo的影响(n＝12)组别剂量(g·kg-1)alb(g/l)glo(g/l)a/g阴性对照-13.19±1.9154.67±4.160.24±0.03模型对照-10.64±2.19*61.51±6.34**0.17±0.04*复方0.859013.63±1.92#55.00±6.740.25±0.05##联苯双酯0.214.27±2.15##56.96±4.520.25±0.03##注：与阴性对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与模型对照组比较，#p＜0.05，##p＜0.01。5、对急性肝损伤小鼠血清中tp、t-bil及alp的影响：结果如表4所示，与阴性对照组相比，模型对照组小鼠血清中t-bil及alp含量均显著性升高(p<0.01)，而血清中tp水平则明显降低(p<0.05)；与模型对照组比较，复方组小鼠血清中t-bil及alp含量均明显降低(p<0.01或0.05)，同时血清中tp含量则明显升高(p<0.05)。由试验结果可知，复方鳖甲软肝片能升高急性肝损伤小鼠血清中tp、降低t-bil及alp水平，表现出一定的肝功能保护作用。表4对ccl4致急性肝损伤小鼠血液中tp、t-bil及alp的影响(n＝12)组别剂量(g·kg-1)tp(g/l)t-bil(g/dl)alp(u/l)阴性对照-65.64±6.200.15±0.0596.28±21.39模型对照-59.12±6.44*0.30±0.12**181.70±43.57**复方0.859068.17±6.13#0.21±0.13#125.68±37.94##联苯双酯0.271.62±6.78##0.18±0.07#119.96±42.43##注：与阴性对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与模型对照组比较，#p＜0.05，##p＜0.01。6、对急性肝损伤小鼠脂质过氧化指标的影响：结果如表5所示，与阴性对照组相比，模型对照组血清中sod及gsh-px水平显著降低(p<0.05或0.01)，而血清中mda含量则显著升高(p<0.01)；与模型对照组相比，复方组血清中sod及gsh-px含量均显著性升高(p<0.01或0.01)，其中血清中mda含量则明显降低(p<0.05)。结果提示，复方鳖甲软肝片能抑制急性肝损伤小鼠的过氧化损伤，表现出明显的肝损伤保护作用。表5对ccl4致小鼠急性肝损伤脂质过氧化指标的影响(n＝12)组别剂量(g·kg-1)sod(pg/ml)mda(nmol/l)gsh-px(ng/l)阴性对照-20.04±1.751.17±0.28641.12±4.09模型对照-14.66±3.43*3.10±1.275**22.68±2.07**复方0.859026.77±1.65##1.48±0.255#35.74±6.04#联苯双酯0.223.30±1.80##1.27±0.220##31.49±1.75#注：与阴性对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与模型对照组比较，#p＜0.05，##p＜0.01。7、肝组织病理学观察：结果如图1所示，图1为复方鳖甲软肝片对急性肝损伤小鼠肝组织he染色的影响(200×)，其中a：阴性对照组；b：模型对照组；c：复方组；d：联苯双酯组。根据图1所示，阴性对照组小鼠肝小叶排列整齐、结构清晰，肝细胞形态及结果正常；模型对照组小鼠肝组织存在广泛的气球样变，胞浆透明化，中央静脉周围(肝小叶中心)有大量灶性坏死，并伴有炎性细胞及单核细胞浸润，表明采用ccl4致小鼠急性肝损伤造模成功；复方组小鼠肝小叶结构清晰，有少量肝细胞水样变性及坏死；联苯双酯组小鼠肝小叶结构清晰，有轻度水样变性，仅有极少量肝细胞坏死。四、讨论：ccl4为肝毒性物质，在肝细胞膜上达到损伤肝细胞的目的。主要是通过以下两种途径：①肝微粒酶系代谢产生的脂质过氧化及活性自由基氯烷化损伤肝细胞膜，破坏膜结构和脂质代谢；②肝细胞膜的直接溶解。本试验采用ccl4诱导小鼠急性肝损伤模型，初步考察复方鳖甲软肝片对急性肝损伤小鼠体内肝组织的保护作用。急性肝损伤产生过量自由基引发肝细胞膜脂质过氧化，代谢产物与细胞内物质共价结合，扰乱细胞内钙代谢，破坏细胞膜的完整性。随后又释放炎性细胞因子诱发肝组织酶代谢异常，使肝细胞内转氨酶alt和ast释放入血、蛋白质合成代谢功能降低，胆道梗阻抑制酶排泄。具体表现为小鼠血清中alt、ast、t-bil和alp含量大量升高，alb和tp也随着肝脏代谢功能降低而减少。由试验结果可知，复方鳖甲软肝片能显著降低急性肝损伤小鼠血清中ast、alt、t-bil及alp含量，升高tp及alb水平，明显改善小鼠急性肝细胞损伤，恢复肝功能。过量自由基使肝微粒体诱发脂质过氧化反应，导致机体重要的抗氧化及自由基清除剂sod、gsh-px大量减少，mda含量大量增加。在本试验中，复方鳖甲软肝片明显升高小鼠血清中sod及gsh-px水平，降低血清中mda含量。结果表明，复方鳖甲软肝片对急性肝损伤小鼠具有抗氧化作用，从而改善肝细胞损伤。由病理学结果分析可知，复方鳖甲软肝片对急性肝损伤小鼠有一定的保护作用，可以改善肝组织水肿、气球样变及炎性细胞浸润等，表现出明显的肝保护作用。综上所述，通过ccl4致小鼠急性肝损伤实验，可初步得知复方鳖甲软肝片对急性肝损伤小鼠有一定的保肝降酶效果。以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。当前第1页12