本发明涉及碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(crkp)等耐药菌感染治疗的复方组方。
背景技术：
肺炎克雷伯菌(klebsiellapneumoniae，kp)属于革兰阴性肠杆菌，是克雷伯氏菌属中最为重要的一类菌。根据《2015年全国细菌耐药监测报告》，肺炎克雷伯菌为革兰阴性菌感染中检出率排名第二位的细菌，占19.8％。它可以通过医源性途径导致严重的感染，是临床上常见的条件致病菌，主要引起肺炎、败血症，尿路炎症等疾病。自1996年首次报道了碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantklebsiellapneumoniae，crkp)，crkp开始在各个地区逐渐流行，特别是对接触卫生保健的人群。并且由于近年来越来越多的侵袭性医疗操作和抗生素的不规范使用，全球许多地区对碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌的报道也逐渐增多。
在我国，肺炎克雷伯菌中对于碳青霉烯类药物耐药的菌株，从2005年的4.7％上升至2012年的8.9％[1]，2015年回落至7.6％，但较2014年还是有所增长。国外研究显示，肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素的耐药率为9.65％，但是14天的病死率却高达47.0％[2]。另有报道美国crkp感染患者的总死亡率为48％[3]。crkp作为一种耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(cre)，有较高的致病率、死亡率，已经成为世界范围内，威胁住院患者预后的主要因素。2014年美国cdc把cre定为“紧急”威胁级别中的首位，cre被称之为“噩梦细菌”。
crkp感染治疗非常困难，因为多数分离到的菌株对几乎所有β-内酰胺类、喹诺酮类及氨基糖苷类抗生素耐药，其原因与crkp的耐药机制有关：产生碳青霉烯酶；青霉素结合蛋白对碳青霉烯类亲和力下降；高产ampc酶或esbls合并外膜蛋白缺失；主动外排系统；形成生物膜[4，5]。crkp所导致的感染对临床来说是新的挑战。
目前，治疗crkp感染的药物与方法有限，一般建议采用联合治疗的方案。主要包括以多粘菌素为中心的联合治疗方案；以替加环素为中心的联合治疗方案；以氨基糖苷类和磷霉素联合治疗的方案，以双碳青霉烯联合的治疗方案；以上方案部分患者可能获益，但总体治疗效果仍不理想。据报道，美国crkp感染患者的总死亡率仍为48％，与我国报道类似[6]。而且肺炎克雷伯菌对多粘菌素、替加环素的耐药也逐年增加[7，8]，多粘菌素和氨基糖苷类肾毒性，以及替加环素治疗患者全因死亡率的增加等因素限制了临床的应用。
crkp的临床检出率逐年增加，其高发病率和死亡率，已经成为威胁人类健康最大的病原菌。因此，在做好院内感染控制，利用好现有的抗感染药物之外，研发新的有效药物和组方，有利于解决临床无药可用的窘态，有利于提高临床耐药菌感染的治愈率，最终有利于挽救患者的性命。
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技术实现要素：
本发明第一目的在于，提供一种包含头孢吡肟和阿维巴坦的抗感染组合物，旨在提供一种具有优异协同效果的抗感染组合物。
本发明第二目的在于，提供一种包含所述的抗感染组合物在用于制备敏感菌或者耐药菌感染的药物的用途(应用)。
本发明第三目的在于，提供一种由所述的抗感染组合物的制剂(药物)。
一种抗感染组合物，包括a：头孢吡肟或其药学上可接受的盐；b：阿维巴坦或其药学上可接受的盐。
本研究发现，所述的a和b的具有良好协同效果，二者的协同率高达100％；通过二者协同，可明显提升对敏感菌的作用效果，还可出人意料地增强耐药菌的敏感性(本发明也称为敏感率)，提升耐药菌的治疗效果。
本发明中，所述的a可以为头孢吡肟、头孢吡肟的药学上可接受的盐；优选为盐酸头孢吡肟。
本发明中，所述的b可以为阿维巴坦或阿维巴坦药学上可接受的盐(例如阿维巴坦钠)。
作为优选，所述的抗感染组合物，其特征在于，a与b的质量比为8～1∶1～8。
本发明人创新性地研究发现，将a和b的质量比控制在合适范围内，可提升二者的协同效果。将二者的比例控制在所述的优选范围下，可进一步提升二者的协同性，特别是可出人意料地提升耐药菌的敏感率。例如，在该优选比例下，对crkp的敏感率大于70％。
进一步优选，a与b的质量比为1∶2～8。在该进一步优选的质量比下，本发明人意外发现，可进一步提升对耐药菌的敏感率，例如，可将crkp的敏感率提升至大于90％。
最优选，a与b的质量比为1∶8。在该优选的质量比下，协同效果最优选，具体表现在于，对将crkp的敏感率高达100％。
作为优选，所述的抗感染组合物，所述的a、b独立或者以混合物的形式存在。
本发明所述的抗感染组合物，所述的a和b成分，可以在使用前不相互接触，相互独立包装，在使用时，分别施用或者临时混合后给药对象；也可为a和b为混合物，在使用时，一并施用于给药对象。
本发明所述的抗感染组合物，为一种用于碳青霉烯类敏感菌和/或耐药菌的抗感染药物。
本发明还提供了一种所述的抗感染组合物在用于制备抗碳青霉烯类敏感菌和/或碳青霉烯类耐药菌感染的药物的应用。
进一步优选，所述的应用，将所述的抗感染组合物在用于制备抗碳青霉烯类耐药菌感染的药物的应用。本发明所述的抗感染组合物，除了可以改善敏感菌的抗菌效果外，更主要的功效在于，明显协同提升碳青霉烯类耐药菌的抗菌效果。
作为优选，所述的应用，所述的碳青霉烯类耐药菌为碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌。本发明所述的抗菌组合物，对碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌表现出优异的协同抗菌效果，可明显提升该耐药菌的敏感率，降低mic。
研究发现，本发明所述的抗感染组合物可明显协同提升对耐药菌的敏感性，例如，crkp的对头孢吡肟mic50(＞512μg/ml)与mic90(＞512μg/ml)分别为下降为mic50(4μg/ml)，mic90(32μg/ml)，活性分别提高了103倍和16倍，此外头孢吡肟的分子中3位上有四价氮原子，可形成两性离子，有很好的组织分布性(特别是脑组织)，同时其对肠杆菌膜的穿透力比同类头孢菌素大5～20倍。本发明所述的抗感染组合物对碳青霉烯类耐药菌、特别是crkp效果显著。
进一步优选，所述的应用，将所述的抗感染组合物用于制备碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌感染所致的脑脊髓膜炎、下呼吸道感染、单纯性下尿路感染、复杂性尿路感染、非复杂性皮肤、皮肤软组织感染、复杂性腹腔内感染、妇产科感染、败血症的药物。
作为优选，所述的应用，用于制备头孢吡肟敏感细菌引起的细菌性脑脊髓膜炎、下呼吸道感染、单纯性下尿路感染、复杂性尿路感染、非复杂性皮肤、皮肤软组织感染、复杂性腹腔内感染、妇产科感染、败血症的药物。
所述的应用中，将所述的抗感染组合物作为活性成分，和药学上可接受的辅料一起，制得适合临床应用的任意剂型；例如注射制剂。
本发明还提供了一种抗感染药物，包含所述的抗感染组合物，还包含药学上可接受的辅料。
本发明中，可采用药学上可接受的辅料，将本发明所述的抗感染组合物制得适合使用需求的制剂。
优选地，所述的抗感染药物为注射用粉剂。本发明中，优选将所述的抗感染组合物和药学上可接受的辅料一起，制得用于注射的制剂。
本发明中，还提供一种针对碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(crkp)等耐药菌具有更好协同作用组方(注射用头孢吡肟阿维巴坦复方制剂)。
有益效果
本发明所述的抗感染组合物，除用于敏感菌引起的感染并协同提升抗感染外，特别适用于碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(crkp)等耐药菌引起的脑脊髓膜炎，下呼吸道感染(肺炎和支气管炎)，单纯性下尿路感染和复杂性尿路感染(包括肾盂肾炎)，非复杂性皮肤和皮肤软组织感染，复杂性腹腔内感染(包括腹膜炎和胆道感染)，妇产科感染，败血症等感染。
本发明人还创新性地发现，a、b二者的协同性高达100％，并且将二者的质量比控制在本发明要求的质量比下，可出人意料地提升对碳青霉烯类耐药菌(特别是crkp)的作用效果，可将耐药菌的敏感率提升至100％，在临床上具有重大意义。
附图说明
图140株crkp的tgc+pb、tgc+mem、tgc+amk、pb+mem、pb+fm、amk+fm联合累积抑菌曲线
图240株crkp的abt+bap、abt+mem、abt+fep、abt+caz联合累积抑菌曲线。
具体实施方式
本发明体外抗菌活性验证
一、病原菌分离与鉴定
1.病原菌的分离
收集临床不同患者分离的(2016年8月到2017年4月)耐碳氢霉烯肺炎克雷伯菌(crkp)株，共40株，crkp通过phonenix细菌鉴定药敏系统(bectondickinson，美国)鉴定，菌株保存在-80℃冰箱备用，用美国标准菌株大肠埃希菌atcc25922，肺炎克雷伯菌atccbaa-1705和baa-1706作质控菌株.
2.体外敏感性实验
初始药物敏感性通过phonenix系统验证，验证的抗生素如下：碳青霉烯类(亚胺培南，美罗培南)，哌拉西林/他唑巴坦，氨苄西林，氨苄西林/舒巴坦，阿莫西林/克拉维酸，氨基糖苷类(阿米卡星，庆大霉素)，头孢菌素(头孢吡肟，头孢唑林，头孢噻肟，头孢他啶)，氟喹诺酮类药物(左氧氟沙星，环丙沙星)，四环素，复方新诺明，氯霉素和氨曲南。
3.改良碳青霉烯灭活试验验证(mcim)(参照2017年clsi)
①取1μl接种环的过夜培养纯菌落于2mltsb肉汤中，震荡混匀10-15秒，每管放入一张含10μg美罗培南的无菌纸片，确认纸片浸没于菌悬液中，35℃±2℃大气环境孵育4小时±15分钟；
②孵育结束时，立即用营养肉汤或生理盐水制备0.5麦氏浊度的大肠埃希菌atcc25922的菌悬液(直接菌悬法)，并涂布于m-h平板上，菌悬液制备和平板涂布必须15分钟内完成，干燥3-10分钟；
③用10μl接种环将美罗培南纸片从tsb肉汤中取出，将纸片贴于试管内壁，轻轻按压以挤去纸片上多余水分，然后将纸片取出贴于已涂布有大肠埃希菌atcc25922的mh平板上，35℃±2℃大气环境孵育；
④18-24小时后量取抑菌圈直径并判断结果。肺炎克雷伯菌atccbaa-1705和肺炎克雷伯菌atccbaa-1706分别为阳性质控菌和阴性质控菌。美罗培南抑菌圈直径为6-15mm或直径为16-18mm但抑菌圈内有散在菌落时为阳性；抑菌圈直径≥19mm为阴性；抑菌圈直径为16-18mm无法判断是否存在碳青霉烯酶。
4.体外敏感性与mcim结果
40株crkp菌株经phonenix系统检测药敏结果如表1所示。
表140株crkp耐药情况
结果显示kpc生产的肺炎克雷伯菌菌株对几乎所有的碳青霉烯类，头孢菌素类和β-内酰胺酶抑制剂耐药，对氟喹诺酮类和庆大霉素类耐药率高，菌株对阿米卡星、四环素和复方新诺明有一半敏感性。
二、不同组方联合药敏筛选
1.药品与试剂
对以下抗生素进行研究：美罗培南，比阿培南，多粘菌素b，阿米卡星，磷霉素，头孢他啶和头孢吡肟(国家食品药品监督管理局，中国)，替加环素和阿维巴坦(上海荣柏生物技术有限公司，中国)。多粘菌素b(pb)，阿米卡星(amk)，磷霉素(fm)，头孢他啶(caz)，头孢吡肟(fep)和阿维巴坦(abt)的储备液在-80℃冰箱冷冻保存，六个月内使用。实验当天制备新鲜的替加环素(tgc)，美罗培南(mem)和比阿培南(bap)药液。
2.最小抑制浓度(mic)
按照美国临床和实验室标准化协会(clsi)和联邦药品管理局(fda)标准，使用mh培养基通过肉汤微量稀释法测定抗生素的mic值。根据clsi指南，crkp分离株的耐药折点选择为：磷霉素≥256μg/ml；头孢他啶和头孢吡肟≥16μg/ml；美罗培南和比阿培南≥4μg/ml；阿米卡星≥64μg/ml。根据欧洲抗微生物药物敏感性试验委员会(eucast)折点建议，多粘菌素对肠杆菌科的mic耐药性折点>2μg/ml；替加环素的耐药性>2μg/ml
3.分级(或部分)抑菌浓度(fic)指数测定
测试了以下10种抗菌药物组合：tgc+pb，tgc+mem，tgc+amk，pb+mem，pb+fm，amk+fm，caz+abt，fep+abt，mem+abt，bap+abt。根据先前测定的mic值确定抗菌药物的范围。使用96孔微量平底细胞板和新鲜mh肉汤(mhb；oxoid，uk)通过微量肉汤棋盘法进行抗菌药物的协同分析。每孔用100μl5×105cfu/ml，最终体积为200μl，每组设置一个阳性对照孔和一个无菌对照孔。然后将96孔细胞板在37℃孵育18-24小时。单一抗菌药物的mic再次在每个96孔细胞板中测定，并且只有当单一试剂mic在通过肉汤微稀释法测定的mic高于或低于mic一倍稀释浓度时才进行读数。
4.数据统计
使用以下公式计算组合的分级抑菌浓度指数(fici)：
fici＝mica。c/mica，a+micb，c/micb，a其中mica。c为联合时a药的mic值，mica，a为a药单用时的mic值；micb。c为联合时b药的mic值，mica，a为单用时b药的mic值。
当fici≤0.5，表明两种药物联合存在协同作用，当0.5＜fici≤1时，表明两种药物联合存在相加作用，当1＜fici≤2，表明表明两种药物联合存在无关，当fici＞2时，表明表明两种药物联合存在拮抗作用。
1.单药和联合的mic列于表2，表3。
表240株crkp菌株对不同抗菌药物的mic分布.
灰色表明mic在耐药折点以下
2.累积抑制作用
图1、图2分别显示了不同药物单药和联合状况下随着抗菌药物浓度增加的累积抑菌曲线。x轴为浓度，y轴为抑菌的累及百分比(％，n＝40)。其中红色和橙色代表单药的累积抑菌曲线，绿色和蓝色为联合给药后累积抑菌曲线。联合累积抑制曲线左移表明联合方案的达到相应累积抑菌率的mic低于单药，表明联合比单药有效。
如图1、图2结果显示，不同的药物组合后，大部分联合累积抑制曲线左移，但左移的程度存在差异，表明不同组合的效果是不一样的。以阿维巴坦为联合的方案，联合累及抑菌曲线较单药左移明显，表明存在联合方案比较理想；而阿米卡星与磷霉素的联合，对大约60％没有作用；以替加环素为中心的方案，联合作用不明显，这也解释了替加环素临床中应增加剂量而非联合给药；多粘菌素联合美罗培南优于单药。
3.联合方案对mic的影响
分别测定在联合组方的基础上的mic值(如表3)
表340株crkp菌株在联合用药情况下mic的分布
灰色表明mic在耐药折点以下
结果显示，crkp分离株对tgc敏感(mic≤2μg/ml)。按照提供的组合方案，可以看出联合方案能减少抗菌药物的mic，尤其是以pb为基础的联合方案，以abt为基础的联合方案和以tgc为基础的联合方案；而amk和fm的组合对mic没有影响不大，不能满足临床需要。
2.分级抑菌浓度指数(fici)
不同的抗菌组合对大多数分离物显示出相加效应。表4为不同药物联合后fic值，结果表明，tgc联合方案几乎表现为相加和无关，pb联合方案主要表现为协同和相加，fm联合方案也表现为协同和相加，与阿米卡星表现为无关。而abt联合方案主要表现为协同活性。
表440株crkp菌株在不同联合方案下的fici值.
灰色表明具有协同和相加作用≥80％.
从上表可以看出，不同组分的组合对crkp的作用是不一样的，以替加环素为中心的联合方案很少表现为协同，多为相加和无关，而以多粘菌素为中心的方案表现部分为协同，部分为相加，部分为无关；而以阿维巴坦为中心组合的基本表现为协同作用。在以阿维巴坦为中心的联合方案中，头孢吡肟+阿维巴坦协同率(100％)优于头孢他啶+阿维巴坦(92.5％)、美罗培南+阿维巴坦(87.5％)和比阿培南+阿维巴坦(87.5％)。以上结果表明，对crkp敏感治疗方案中，头孢吡肟+阿维巴坦是比较理想的方案。
头孢吡肟与阿维巴坦不同配比研究
取头孢吡肟与阿维巴坦，配制初始浓度为头孢吡肟1024、512、256、128、64、32、16、8μg/ml，阿维巴坦512、256、128、64、32、16、8、4、2μg/ml，菌液配置0.5麦氏浊度(大约108cfu/ml)，然后用mh肉汤稀释100倍。每孔添加菌液(100μl)和药液(单药100μl，复合50μl)，保证每孔终体积为200μl，得到头孢吡肟与阿维巴坦质量比为512∶1，256∶1，128∶1，64∶1，32∶1，16∶1，8∶1，4∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64。将加完样的微孔板加盖送37℃温箱培养18-24h后，酶标仪读数与肉眼观察综合判断结果，以微孔内肉汤的透明度来判断有无长菌并记录下各孔的长菌情况，验证不同比例组分对40株crkp的敏感性，结果如下表5。
表5：40株crkp对不同配比头孢吡肟/阿维巴坦的药敏结果
根据clsi指南，对碳青霉烯抗性肺炎克雷伯氏菌分离株的耐药折点：头孢吡肟≥16μg/ml。结果表明，当头孢吡肟与阿维巴坦的质量比为8∶1，4∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32时，crkp的敏感率分别为100％，97.5％，92.5％，
87.5％，77.5％，75％，70％，65％，52.5％，以70％细菌敏感，因此适宜的头孢吡肟与阿维巴坦的质量比8～1∶1～8。
本组方与替加环素，多粘菌素，阿米卡星为中心的组方相比，更多发挥协同作用，在以阿维巴坦为中心的联合方案中，头孢他啶联合阿维巴坦的组分协同效果优于头孢他定，美罗培南和比阿培南与阿维巴坦的联合方案。当头孢吡肟与阿维巴坦的质量比8～1∶1～8时，复合组分对碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌敏感率＞70％，是临床中非常有前景的抗菌药物组方，优于目前相关指南的推荐方案及其它阿维巴坦的复方组方。本组分将能明显提高crkp等耐药菌感染的治愈率，能更大程度上挽救患者的生命，本组方具有很好的社会和经济价值。