本发明涉及一种核壳型预装化疗药物微球栓塞剂的制备工艺，属于生物医药领域。
背景技术
经导管血管栓塞术(transarterialembolization,tae)是将栓塞剂选择性注入病变部位靶血管，阻断血供，从而达到抑制肿瘤生长、消除血管性病变器官功能和止血的目的。1981年kato首先提出化疗栓塞法，或称经导管动脉化疗栓塞术(transarterialchemoembolization,tace)，这种方法是将药物与栓塞剂相结合，兼有栓塞和药物双重作用，更加有效。传统的tace常用碘油加阿霉素、顺铂或其他化疗药物混合给药。但是，这种方法存在2个主要缺陷：①碘油乳剂的局部沉积有时不能取得令人满意的效果，随着时间的延长，化疗药物对肿瘤组织的细胞毒效应也随之下降；②传统的药物载体是脂质，而化疗药物是水溶性的，这种传统乳剂会导致化疗药物迅速释放入血流中，从而快速进入全身循环系统，增加了全身的不良反应并且降低了局部效能。
近年来随着预装药物栓塞微球制剂-载药微球或称药物洗脱微球(drug-elutingbead，deb)的出现，这种微球制剂相比化疗药物加栓塞剂的简单方式更有效，药物也能长效缓释，并减小了对其他器官的伤害。例如已经商品化的药物栓塞微球dcbead，国内商品名“达仙球”，以及处于临床前研究阶段的药物栓塞微球，包括5-氟尿嘧啶聚乳酸微球、阿霉素海藻酸钠微球、载平阳霉素的离子交换型微球、顺铂微球以及含有中药成分的复方莪术油微球等。然而无论是商品化还是处于实验阶段的药物栓塞微球，都存在粒径尺寸分布广(如dcbead分为100～300μm，300～500μm，500～700μm等多个范围)，载药量低且不均匀、易受环境及人为因素影响、释药性能不稳定等问题，因此安全性不容乐观。由于tace术的超选择性，尺寸不均一易造成非靶向栓塞，引起严重并发症，只有尺寸均一性良好的微球才可确保栓塞特定尺寸的血管。此外对于载药微球，其尺寸均一则释药规律一致，有助于准确判断后续栓塞进程。因此，只有选择适宜尺寸的均一微球，才能更好达到治疗效果。
现有载药栓塞微球粒径尺寸不均一的原因是其制备方法均为大尺度的方式，例如乳化分散法、喷雾干燥法、相分离法等，缺乏对微球尺寸、结构等的有力控制。所得到的微球产品粒径尺寸分布广，很难实现微球的粒径均一性。现有载药栓塞微球载药量低且不均匀、释药性能不稳定的原因除了大尺度制备方式造成的粒径尺寸不均一之外，其以静电吸附作用来载药或直接与高分子聚合物混合来载药也是造成载药不完全、释药性能不稳定的原因之一。
因此，制备尺寸均一、载药/释药可控的新型载药栓塞微球来改善现有载药栓塞微球所存在的问题尤为重要。
中国专利cn106729951a公开一种具有微波增敏功能的化疗栓塞多孔微球在制备治疗肿瘤的药物或制剂中的应用，所述微球的吸附物为无机盐和化疗药物，所述微球的骨架为聚乳酸羟基乙酸；所述微球直径为20-700μm，比表面大于10m2/g。本发明还提供了上述化疗栓塞多孔微球的制备方法。本发明化疗栓塞多孔微球具有很好的微波增敏升温与肿瘤血管栓塞功能，呈规则的球形，孔隙率高，粒径分布窄，粒度可控；另外，本发明首次将聚乳酸羟基乙酸制备成具有微波增敏的化疗栓塞微球应用于癌症的治疗，取得了优异的肿瘤抑制作用，具有很好的临床应用价值。该发明专利所述微球的载药机理为物理吸附载药。吸附载药为药物吸附在多孔介质的表面，药物吸附过程受比表面积的影响，载药量有限制；同时，药物的释放过程不受控制，可能产生药物突释现象，危害人体健康。此外，所述微球的粒径分布范围较广，不利于栓塞特定尺寸的血管，也可能堵塞不需栓塞的血管。
中国专利cn101099725公开了一种复合基质的多功能动脉栓塞剂的制备方法，将盐酸阿霉素溶液分散在油性造影剂中，在表面活性剂的作用下，形成微乳和亚微乳，作为初乳相e1；将初乳相均匀滴加至含有表面活性剂和碳酸钙或磷酸钙微粉的海藻酸钠溶液的w相中，形成次级乳液e2；再将次级乳e2滴加至液体石蜡中，形成终级乳液e3，在持续搅拌的条件下加入有机酸，完成交联和成球反应，经沉淀，除去上层液体，得到球形度良好、同时含有化疗药物和放射显影剂的微球栓塞剂。本发明可以通过调整制备参数(机械搅拌力等)控制微球粒径的分布，得到复合基质的、具有诊断和治疗功能的动脉栓塞微球制剂。该发明专利使用机械搅拌来制备微球栓塞剂，所述方法缺乏对微球粒径的有效控制，所得到的微球粒径分布范围较广，对特定尺寸血管的栓塞效果不乐观，也可能堵塞不需栓塞的血管。此外，药物在制备的过程以滴加的方式加入，药物损失率较高。
技术实现要素：
为了弥补现有技术的不足，本发明提供一种粒径均一、结构/载药可控的核壳型预装化疗药物栓塞微球的制备方法。
预装药物微球制剂是药物与生物相容性的高分子聚合物通过微型包裹技术制得的粒径为几十到几百微米的微球。微球粒径、载药量及释药速率等因素都影响着微球的疗效。
利用载有药物的微球制剂堵塞病变组织的供血微动脉，栓塞部位可不断向病变靶区定向释放药物，使药物具有靶向性和控释作用，改变了药物在体内分布及动力学，提高药物的生物利用度，治疗效果显著，降低毒副作用。
从制备方法角度，本发明基于微流控液滴技术，在微米至纳米尺度通道内利用流体剪切力与表面张力之间的相互作用，将分散相流体分割成纳升级及纳升级以下的大小一致的液滴。小液滴被包裹进大液滴，形成具有两层结构的液滴，内部小液滴的尺寸以及外层大液滴的尺寸均可以通过流体的流速/性质、通道尺寸等参数进行调节。内部小液滴含有药物，被完全包裹进外层大液滴中，载药完全、无药物损失。流体中所含高分子聚合物通过物理/化学手段固化后，形成具有两层结构的核壳型微球，以此来制备粒径尺寸均一、结构/载药可控的预装药物栓塞微球(尺寸偏差<5％)。进一步的，本发明可制备粒径范围在10～1000微米的核壳型微球，同时通过改变核与壳材料的性质、核壳比例，可实现微球产品粒径/结构/载药/释药可控。
从微球产品角度，本发明提供了一种载药栓塞微球的新剂型。有别于传统载药微球在使用前通过与药物混合进行载药，该新剂型的药物是在制备过程中预装进入微球的。该新剂型由两层结构的聚合物构成，具备核壳结构，药物预装在内核中，可预装亲水或亲油性药物，核壳型微球的外壳有助于保持内核药物活性。该新剂型粒径尺寸均一、可稳定载药/释药，防止突释，增加安全性。
本发明解决了目前药物栓塞微球制备过程中粒径/结构不可控、载药不完全、释药不可控等问题。
本发明采用的技术方案如下：
一种核壳型预装化疗药物栓塞微球，由两层结构的聚合物构成，具备核壳结构，药物预装在内核中，可预装亲水或亲油性药物，核壳型微球的外壳有助于保持内核药物活性；其制备方法步骤如下：
(1)确定溶液体系
依据所需预载药物的性质和制剂要求，溶液体系分为水/油/水(w/o/w)复乳型和油/水/油(o/w/o)复乳型两种。
对于水溶性药物，适用w/o/w复乳型溶液体系，所述溶液体系由内水相流体、中间油相流体、及外水相流体共同组成。相对于中间油相，内水相为分散相，中间油相为流动相；相对于外水相，中间油相为分散相，外水相则为流动相。
所述内水相流体为含有生物相容性高分子聚合物的水溶液，所述高分子聚合物选取纤维素、壳聚糖、海藻酸钠、葡聚糖、可溶性淀粉、明胶、聚乙二醇(peg)、γ-聚谷氨酸(γ-pga)，高分子聚合物溶液的质量分数为0.1-40％，药物溶解于内水相；
所述中间油相流体为含有生物相容性高分子聚合物的油溶液，所述高分子聚合物选取聚乳酸(pla)、聚乳酸/羟基乙酸共聚物(plga)、聚乙二醇peg，高分子聚合物溶液的质量分数为0.1-40％，高分子聚合物油溶液的溶剂选用二氯甲烷、碳酸二甲酯等；中间油相流体含有油溶表面活性剂，选取em90、span-80；
所述外水相流体为含有表面活性剂的水溶液。
对于油溶性药物，适用油/水/油(o/w/o)复乳型溶液体系，所述溶液体系由内油相流体、中间水相流体、及外油相流体共同组成。相对于中间水相，内油相为分散相，中间水相为流动相；相对于外油相，中间水相为分散相，外油相则为流动相。
所述内油相流体为含有生物相容性高分子聚合物溶液的油溶液，所述高分子聚合物选取聚乳酸(pla)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)、聚乙二醇(peg)，高分子聚合物溶液的质量分数为0.1-40％；高分子聚合物溶液的溶剂为二氯甲烷、丙酮、碳酸二甲酯、二甲基甲酰胺；药物溶解于内油相；
所述中间水相流体为含有生物相容性高分子聚合物的水溶液，所述高分子聚合物选取纤维素、壳聚糖、海藻酸钠、聚乙烯醇、葡聚糖、淀粉、明胶、聚乙二醇(peg)、γ-聚谷氨酸(γ-pga)等，高分子聚合物溶液的质量分数为0.1-40％；中间水相流体含有水溶性表面活性剂；
所述外油相流体为与水不互溶的有机溶剂，外油相含有油溶性表面活性剂；所述有机溶剂选自c12-18烷烃、硅油、石蜡之一或组合；或天然食用油，优选大豆油、蓖麻油；
(2)w/o/w复乳型或o/w/o复乳型液滴制备
分别将所述内相、中间相和外相流体以各自恒定流量泵入微尺度通道中，在微尺度通道内利用流体剪切力与表面张力之间的相互作用形成w/o/w复乳型或o/w/o复乳型液滴；
所述内相、中间相和外相流体通过各自的通道由注射泵控制流量，外相流体流速>中间相流体流速>内相流体流速；所述内相流体的流量范围为0.1-5.0ml/h，所述中间相流体的流量范围为0.5-15.0ml/h，所述外相流体的流量范围为2.0-20.0ml/h。
(3)液滴固化过程
液滴固化过程可选取物理或者化学方法进行固化，固化过程于20-80℃温度下进行，之后静置24小时以使固化完全；
所述物理固化方法为：通过光照(如uv)、加热的方法进行固化。基于微通道对光的良好透过率或对热的良好传导率，物理固化可在线进行。在双层微液滴形成后，在收集微通道近出口处固化。
所述化学固化方法为使用交联剂、催化剂进行固化的方法。所述交联剂可选取戊二醛、乙二醛、甲醛、环氧氯丙烷或金属离子水溶液，交联剂溶液的质量分数为0.1-80％，其中金属离子水溶液的质量分数优选0.1-10％。所述的催化剂为质子酸或生物酶水溶液，所述的质子酸优选为有机酸或无机酸，质子酸的ph值优选为ph＝1-5；所述的生物酶优选能够催化蛋白质分子之间或之内的交联、蛋白质和氨基酸之间连接的酶，最优选谷氨酰胺转胺酶，生物酶水溶液的质量分数为0.1-10％，优选0.1-2.0％。
化学固化方法中交联剂和催化剂的加入与所选体系及方法相关，优选以下几种固化方式：
聚乙烯醇固化：选戊二醛或甲醛为交联剂，质子酸为催化剂，固化反应是聚乙烯醇与交联剂混合后一同进入反应体系即微尺度通道中，形成微液滴，收集后在质子酸催化下固化；
海藻酸钠固化：步骤(2)形成的微液滴，收集于容器中，然后加入金属离子交联剂进行固化；
淀粉固化：需将淀粉与交联剂环氧氯丙烷预混后一同进入反应体系即微尺度通道中，制备形成微液滴然后进行固化；
明胶固化：需将明胶与谷氨酰胺转胺酶预混后一同进入反应体系即微尺度通道中，制备形成微液滴然后进行固化。
(4)洗涤、干燥
将步骤(3)固化后的反应液过滤，收集固体颗粒，分别用有机溶剂、去离子水洗涤，干燥后得到载药栓塞微球。
本发明制备的载药栓塞微球粒径均一、表面光滑、核壳结构/载药可控，微球粒径在10～1000μm范围内可控，偏差小于5％；进一步优选的，粒径为110～950μm，偏差小于4％。
根据本发明优选的，步骤(1)所述水溶性药物为水溶性抗肿瘤化疗药物中的一种，抗肿瘤化疗药物选自阿霉素类(阿霉素、表阿霉素、比柔阿霉素)、诺维本(重酒石酸长春瑞滨注射液)、氮芥(环磷酰胺)、顺铂(卡铂)、柔红霉素、甲氨喋呤、氟脲嘧啶、阿糖胞苷、丝裂霉素、塞替派、长春新碱。
根据本发明优选的，步骤(1)所述油溶性药物为油溶性抗肿瘤化疗药物中的一种，选自紫杉醇类(紫杉醇、泰素、泰素帝、紫素)、人参皂苷。
根据本发明优选的，步骤(1)中水相流体中含有表面活性剂时，所述表面活性剂选自水溶性表面活性剂的一种或多种，进一步优选的，所述表面活性剂为tween-20(吐温20)、pva(聚乙烯醇)、tritonx-100(聚乙二醇辛基苯基醚)，质量分数为0.05-5％。
根据本发明优选的，步骤(1)中油相流体中含有表面活性剂时，所述表面活性剂选自油溶性表面活性剂的一种或多种，进一步优选的，所述表面活性剂为em90(鲸蜡基聚乙二醇/聚丙二醇-10/1二甲基硅氧烷)，dc749(环甲基硅氧烷和三甲基硅氧酸盐)，span80(山梨醇酐单油酸酯)，质量分数为0.5-5％。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述内相流体的流量范围为0.3-3.0ml/h，所述中间相流体的流量范围为2.0-8.0ml/h，所述外相流体的流量范围为2.0-15.0ml/h。
根据本发明优选的，步骤(2)中液滴的形成是在微尺度通道内，利用流体的剪切力和与表面张力之间的相互作用将分散相流体分割成纳升级及纳升级以下的液滴。所述微尺度通道直径范围为20-2000微米。
根据本发明优选的，步骤(4)中所述洗涤用有机溶剂选自沸点在80℃以下的液态烷烃、60-90℃石油醚、乙酸乙酯、乙醇、去离子水中的一种或多种组合。洗涤时间为0.5-3小时。所述干燥是指真空烘干、冷冻干燥或喷雾干燥。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述的微尺度通道选自下列微通道中的一种：
(a)共流微尺度通道，由二组共轴连接的共流微尺度通道串联而成；内相流体微通道和中间相流体微通道之间的夹角为θ1，0<θ1≤90°；内相流体微通道和外相流体微通道之间的夹角为θ2，0<θ2≤90°；
(b)流动聚焦型微尺度通道；
本发明所涉及的微尺度通道材料为石英玻璃、聚二甲基硅氧烷(pdms)或聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)等。
本发明以水/油/水(w/o/w)复乳型或油/水/油(o/w/o)复乳型乳化微液滴为模板，将含有药物的微小液滴包裹进外层液滴中，内、外层液滴中的高分子聚合物通过物理、化学等手段转化形成内层的核及外层的壳。所形成的核壳结构药物微球由两层或多层结构的聚合物构成，外壳有助于保持内核药物活性，稳定释药、防止突释、增加安全性。
本发明的有益效果如下：
1、预装化疗药物与生物相容性的高分子聚合物通过微型包裹技术制得粒径为几十到几百微米的核壳型载药微球，所形成的核壳结构药物微球由两层结构的聚合物构成，外壳有助于保持内核药物活性，稳定释药、防止突释、增加安全性。
2、本发明通过调整流体流速、微通道尺寸以及核与壳材料的性质、核壳比例来实现粒径尺寸、核壳结构，载药/释药可控。
3、本发明基于微流控液滴技术，制备的载药栓塞微球粒径均一、表面光滑、核壳结构/载药可控，微球粒径为10～1000μm范围内可控，偏差小于5％；优选粒径为110～950μm，偏差小于4％。
4、本发明预装化疗药物的微球制剂堵塞病变组织的供血微动脉，栓塞部位可不断向病变靶区定向释放药物，使药物具有靶向性和控释作用，改变了药物在体内分布及动力学，提高药物的生物利用度，治疗效果显著，降低毒副作用。
5、本发明提供的应用于药物预装及可控释放医药领域的载药栓塞微球制备方法，可为经导管动脉栓塞术的临床应用研究提供新思路。
说明书附图
图1为微尺度通道结构示意图(通道尺度为微米级)。图中，箭头方向代表流体流动方向。
图1(a)为共流微尺度通道的三维示意图，由二组共流微尺度通道组成；
其中，标号代表如下：1、内相流体入口微通道；2、中间相流体入口微通道；3、外相流体入口微通道；4、单层乳化微液滴收集通道；5、双层乳化微液滴收集通道；6、物理固化位置，可加载如uv、热源等；其中，微通道1和2之间的夹角为θ1，0<θ1≤90°；微通道1和3之间的夹角为θ2，0<θ2≤90°；复乳型微液滴在第二组微通道1和3交汇处附近形成。
图1(b)为流动共聚焦型微尺度通道的三维示意图；
其中，标号代表如下：7、内相流体微通道，8、中间相流体微通道，9、外相流体微通道，10、液滴收集微通道；微通道7与10共轴连接；11、物理固化位置，可加载如uv、热源等。在泵的驱动下，内相流体进入微通道7，在中间相及外相流体剪切力作用下，在微通道10入口处形成复乳型微液滴，微液滴经由收集微通道10收集。
图2、3、4、5分别是实施例1、2、3、4制得的核壳型预装化疗药物栓塞微球的显微镜照片。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但本°发明的保护范围并不限于此。
实施例中的百分比浓度单位均为质量百分比。
实施例1：核壳型预装紫杉醇栓塞微球及制备
选用图1(a)共流微尺度通道，制备o/w/o复乳型微液滴，其中，θ1＝90°，θ2＝90°；微尺度通道中内油相流体通道1直径为200微米，中间水相流体通道2直径为200微米，收集微通道4直径为250微米；外油相流体通道3直径为250微米，收集微通道5直径为400微米。
内油相选用含8％plga的二氯甲烷溶液，400μg/ml的紫杉醇溶于其中；中间水相选用1.5％海藻酸钠与2％聚乙烯醇混合水溶液，外油相选用含2％em90的液体石蜡油。分别将内油相、中间水相和外油相以0.8ml/h、3.0ml/h、5.0ml/h的恒定流量泵入通道1、2、3中。复乳型微液滴在微通道3与5汇集处附近生成。
收集液滴，加入至5％氯化钙溶液中，将其于25℃室温条件下静置24小时后得到白色固体。然后过滤，收集产品。依次用乙酸乙酯、去离子水洗涤三次后，真空4℃干燥后得到载药微球。载药微球内核粒径为128微米，外壳粒径为320微米，微球尺寸偏差为4％。
实施例2：核壳型预装人参皂苷栓塞微球及制备
所述微尺度通道如实施例1所述，制备o/w/o复乳型微液滴。所不同的是微尺度通道中内油相流体通道1直径为150微米，中间水相流体通道2直径为150微米，收集微通道4直径为200微米；外油相流体通道3直径为200微米，收集微通道5直径为300微米。
内油相选用含6％plga的碳酸二甲酯溶液，30μg/ml的人参皂苷溶于其中；中间水相选用12％明胶(预加1ml10％谷氨酰胺转胺酶，混匀)与2％聚乙烯醇混合水溶液，外油相选用含2％dc749的大豆油。分别将内油相、中间水相和外油相以0.7ml/h、3.0ml/h、6.0ml/h的恒定流量泵入通道1、2、3中。复乳型液滴在微通道3与5汇集处附近生成。
加热至37℃在线物理固化，收集液滴，将其于25℃室温条件下静置24小时后得到白色固体。然后过滤，收集产品。依次用乙酸乙酯、去离子水洗涤三次后，真空4℃干燥后得到载药微球。载药微球内核粒径为78微米，外壳粒径为250微米，微球尺寸偏差为3％。
实施例3：核壳型预装阿霉素栓塞微球及制备
选用图1(b)流动聚焦结构的微尺度通道，制备w/o/w复乳型液滴。所述微尺度通道内水相流体通道7的出口直径为50微米，收集微通道10的入口直径为120微米。
内水相选用20％peg与2％海藻酸钠混合水溶液，200μg/ml的阿霉素溶于其中；中间油相选用含2％em90的十二烷，外水相选用4％聚乙烯醇水溶液。分别将内水相、中间油相和外水相以0.8ml/h、2.0ml/h、13.0ml/h的恒定流量泵入通道7、8、9中。复乳型微液滴在通道7与10交汇处生成。
收集液滴，加入至5％氯化钙溶液中。将其置于25℃室温条件下静置24小时后得到白色固体。然后过滤，收集产品。依次用乙醇、去离子水洗涤三次后，真空4℃干燥后得到载药微球。载药微球内核粒径为50微米，外壳粒径为90微米，微球尺寸偏差为4％。
实施例4：核壳型预装顺铂栓塞微球制备
选用图1(b)流动聚焦结构的微尺度通道，制备w/o/w复乳型液滴。所述微尺度通道内水相流体通道入口7直径为80微米，出口10直径为150微米。
内水相选用10％可溶性淀粉(预加入2ml交联剂环氧氯丙烷)与20％peg混合水溶液，150μg/ml的顺铂溶于其中；中间油相选用含3％span80的二氯甲烷，外水相选用3％聚乙烯醇水溶液。分别将内水相、中间油相和外水相以0.4ml/h、2.0ml/h、12ml/h的恒定流量泵入通道7、8、9中。复乳型微液滴在通道7与10交汇处生成。
收集液滴，将其于25℃室温条件下静置24小时后得到白色固体。然后过滤，收集产品。依次用乙醇、去离子水洗涤三次后，真空4℃干燥后得到载药微球。载药微球内核粒径为88微米，外壳粒径为116微米，微球尺寸偏差为4％。