本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种白骨壤茎叶乙酸乙酯萃取物及其制备方法与在肺癌中的应用。
背景技术：
白骨壤是红树林的一种，因其茎秆呈白色而得名。白骨壤具有以种子进行有性繁殖的能力，根系发达，分布在土壤浅层的水平根系宽度相当于其树冠的3-5倍，最长可达8米多，营养面宽能广泛吸收土壤中的养分，具有发达的指状气生根，适宜生长于贫瘠的沙质裸露潮滩上。因此，白骨壤被称为红树林先锋树种。
白骨壤的果实富含淀粉，直径1-2cm，无毒，可作为人类食物或猪的饲料，在60年代困难时期，曾大量采摘作为食物，主要用于配制各类菜肴，如加油盐炒制肉类，具独特风味。广西白骨壤果实已作为宴会上的珍肴。福建厦门沧海镇居民，曾采摘果实，去涩后，盐浸作早菜配稀饭用。民间经验表明不同土壤上生长的白骨壤，果实食用品质迥异。在泥质滩涂上生长的无苦味，质软；在沙质滩涂上生长的则略带苦味，质硬。白骨壤果实除作为粮食,菜肴或以盐浸做早菜的形式直接作为人类食物外，还能作为酿酒的原料，现也较多用做猪的饲料。白骨壤的树叶是牛羊喜欢啃食的青饲料。
通过查阅大量文献，申请人发现，现有对白骨壤的利用中，多是对其果实进行加工，生产酒类、饲料以及各类食品等，而对白骨壤茎叶的利用少之又少，对其茎叶乙酸乙酯萃取物的制备方法、应用的研究至今未见报道。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种白骨壤茎叶乙酸乙酯萃取物及其制备方法与在肺癌中的应用，本发明提供的白骨壤茎叶乙酸乙酯萃取物制备工艺简单可控，提取效率高，且条件温和，活性成分不易被破坏，得到的白骨壤茎叶乙酸乙酯萃取物对人非小细胞肺癌细胞a549具有较好的抑制作用，有望进一步开发成为抗肿瘤的药物。
为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：
一种白骨壤茎叶乙酸乙酯萃取物，由包括以下步骤的方法萃取得到：
(1)将白骨壤晒干，分拣茎叶、叶，粉碎；
(2)取步骤(1)所得白骨壤粉末加入ph为4.0-5.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，然后于90-98％(v/v)的乙醇内进行冷浸6-8天；
(3)将步骤(2)处理后的物料，利用超声波提取1-2h，然后进行震荡处理，滤过后，使用真空旋转蒸发仪在温度低于60℃的条件下回收乙醇，减压浓缩至无醇味，得到粗提取物浸膏；
(4)将步骤(3)所得粗提取物浸膏用水溶解得到粗提液，然后用乙酸乙酯对所述粗提液进行萃取，其中所述乙酸乙酯与所述粗提液的体积比为0.5-1.5：1，得到白骨壤茎叶乙酸乙酯萃取液，接着将所得萃取液在55-62℃下浓缩干燥，得到白骨壤乙酸乙酯萃取物；
(5)取白骨壤乙酸乙酯萃取物进行肿瘤细胞的细胞毒性筛选，接着将通过筛选的萃取物溶解于dmso中，配成100mg/ml的储备液，并用0.22μm过滤筛过滤后分装于ep管，保存于-20℃下待用。
本发明中，进一步地，所述步骤(3)中超声波提取法的操作参数为：超声频率为25-35khz，超声功率为450-550w，提取温度为35-45℃。
本发明中，进一步地，所述步骤(3)中震荡处理的时间为20-24h。
本发明中，进一步地，所述步骤(4)中的所述粗提液在用所述乙酸乙酯萃取之前，先依次用石油醚和氯仿进行萃取以除去所述粗提液中的杂质。
本发明中，进一步地，所述石油醚、所述氯仿与所述粗提液的体积比均为1：0.5-2。
本发明中，进一步地，所述步骤(4)中乙酸乙酯对所述粗提液进行萃取的次数为至少2次。
本发明还提供一种白骨壤茎叶乙酸乙酯萃取物的制备方法，包括以下步骤：
a.将白骨壤晒干，分拣茎叶、叶，粉碎；
b.取步骤a所得白骨壤粉末加入ph为4.0-5.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，然后于90-98％(v/v)的乙醇内进行冷浸6-8天；
c.将步骤b处理后的物料，利用超声波提取1-2h，超声波提取法的操作参数为：超声频率为25-35khz，超声功率为450-550w，提取温度为35-45℃；然后进行震荡处理20-24h，滤过后，使用真空旋转蒸发仪在温度低于60℃的条件下回收乙醇，减压浓缩至无醇味，得到粗提取物浸膏；
d.将步骤c所得粗提取物浸膏用水溶解得到粗提液，先依次用石油醚和氯仿进行萃取以除去所述粗提液中的杂质，石油醚、所述氯仿与所述粗提液的体积比均为1：0.5-2；然后用乙酸乙酯对所述粗提液进行萃取，至少萃取2次，其中所述乙酸乙酯与所述粗提液的体积比为0.5-1.5：1，合并几次萃取得到的萃取液，得到白骨壤茎叶乙酸乙酯萃取液，接着将所得萃取液在55-62℃下浓缩干燥，得到白骨壤乙酸乙酯萃取物；
e.取白骨壤乙酸乙酯萃取物进行肿瘤细胞的细胞毒性筛选，接着将通过筛选的萃取物溶解于dmso中，配成100mg/ml的储备液，并用0.22μm过滤筛过滤后分装于ep管，保存于-20℃下待用。
本发明中，进一步地，所述步骤c中超声波提取法的操作参数为：超声频率为30khz，超声功率为500w，提取温度为40℃。
最后，本发明提供白骨壤茎叶乙酸乙酯萃取物在肺癌防治或治疗中的应用。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1.本发明提供的白骨壤茎叶乙酸乙酯萃取物首先在体积百分浓度为85-98％的乙醇中的提取，得到粗提取物，将粗提取物浸膏用水溶解得到粗提液，接着依次用石油醚和氯仿进行萃取以除去所述粗提液中的杂质，提高纯度，然后再采用乙酸乙酯进行萃取，由于粗提取物中的活性成分易溶于乙酸乙酯，根据相似相容原理，采用乙酸乙酯对白骨壤的粗提物进行萃取，活性成分在溶于乙酸乙酯的同时，与粗提物中极性过大或者极性很小的杂质分离，从而使白骨壤乙酸乙酯萃取物的纯度得到进一步的提高；研究表明，本发明的白骨壤乙酸乙酯萃取物对人非小细胞肺癌细胞a549具有较好的抑制作用，有望进一步开发成为抗肿瘤的药物，应用于肺癌的治疗或制备治疗肺癌的药物，为肺癌疾病的预防治疗指明了新的方向。
2.本发明提供的白骨壤茎叶乙酸乙酯萃取物的制备方法中，针对乙醇的提取率进行深入研究，为后续乙酸乙酯的萃取奠定良好基础，在乙醇提取阶段，提取前添加缓冲溶液有效地减小或消除白骨壤从生长环境中携带的各种复杂基质，在其自然界存在的边界范围内影响提取物的纯度，另外，缓冲溶液能够维持ph相对稳定性能，使得ph值在一定的范围内不因稀释或外加少量的酸或碱而发生变化；在提取过程中在采用超声提取后结合震荡处理，此时超声波作用于液体介质引起介质的振动，当振动处于稀疏状态在介质中形成许多类似真空的空洞，这些空洞的瞬间闭合引起高压，同时还将产生局部高温，可造成白骨壤茎叶细胞壁以及整个生物体瞬间破裂，使得溶液能够渗透到白骨壤茎叶的细胞中，细胞对组织的破坏性更彻底，加速白骨壤茎叶中的有效成分溶解，可大大提高了提取率，缩短提取时间，得到的化学成分结构和性质也不会改变，根据实验研究，该阶段的提取率高达93.23％以上。
综上所述，本发明提供的白骨壤茎叶乙酸乙酯萃取物制备工艺简单可控，提取效率高，且条件温和，活性成分不易被破坏，得到的白骨壤茎叶乙酸乙酯萃取物对人非小细胞肺癌细胞a549具有较好的抑制作用，有望进一步开发成为抗肿瘤的药物。
【附图说明】
图1为不同浓度白骨壤乙酸乙酯萃取物对a549增殖的抑制作用对比图。
【具体实施方式】
下面的实施例可以帮助本领域的技术人员更全面地理解本发明，但不可以以任何方式限制本发明。
实施例1
本实施例所提供的一种白骨壤茎叶乙酸乙酯萃取物是通过以下方法提取得到的：
a.将白骨壤晒干，分拣茎叶、叶，粉碎；
b.取步骤a所得白骨壤粉末加入ph为4.0的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，然后于90％(v/v)的乙醇内进行冷浸6天；
c.将步骤b处理后的物料，利用超声波提取1h，超声波提取法的操作参数为：超声频率为25khz，超声功率为450w，提取温度为35℃；然后进行震荡处理20h，滤过后，使用真空旋转蒸发仪在温度低于60℃的条件下回收乙醇，减压浓缩至无醇味，得到粗提取物浸膏；
d.将步骤c所得粗提取物浸膏用水溶解得到粗提液，先依次用石油醚和氯仿进行萃取以除去所述粗提液中的杂质，石油醚、所述氯仿与所述粗提液的体积比均为1：0.5；然后用乙酸乙酯对所述粗提液进行萃取，至少萃取2次，其中所述乙酸乙酯与所述粗提液的体积比为0.5：1，合并几次萃取得到的萃取液，得到白骨壤茎叶乙酸乙酯萃取液，接着将所得萃取液在55℃下浓缩干燥，得到白骨壤乙酸乙酯萃取物；
e.取白骨壤乙酸乙酯萃取物进行肿瘤细胞的细胞毒性筛选，接着将通过筛选的萃取物溶解于dmso中，配成100mg/ml的储备液，并用0.22μm过滤筛过滤后分装于ep管，保存于-20℃下待用。
本实施例中的白骨壤茎叶乙酸乙酯萃取物应用在肺癌防治或治疗中。
实施例2
本实施例所提供的一种白骨壤茎叶乙酸乙酯萃取物是通过以下方法提取得到的：
a.将白骨壤晒干，分拣茎叶、叶，粉碎；
b.取步骤a所得白骨壤粉末加入ph为4.7的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，然后于95％(v/v)的乙醇内进行冷浸7天；
c.将步骤b处理后的物料，利用超声波提取1.5h，超声波提取法的操作参数为：超声频率为30khz，超声功率为500w，提取温度为40℃；然后进行震荡处理22h，滤过后，使用真空旋转蒸发仪在温度低于60℃的条件下回收乙醇，减压浓缩至无醇味，得到粗提取物浸膏；
d.将步骤c所得粗提取物浸膏用水溶解得到粗提液，先依次用石油醚和氯仿进行萃取以除去所述粗提液中的杂质，石油醚、所述氯仿与所述粗提液的体积比均为1：1.2；然后用乙酸乙酯对所述粗提液进行萃取，至少萃取2次，其中所述乙酸乙酯与所述粗提液的体积比为1.2：1，合并几次萃取得到的萃取液，得到白骨壤茎叶乙酸乙酯萃取液，接着将所得萃取液在58℃下浓缩干燥，得到白骨壤乙酸乙酯萃取物；
e.取白骨壤乙酸乙酯萃取物进行肿瘤细胞的细胞毒性筛选，接着将通过筛选的萃取物溶解于dmso中，配成100mg/ml的储备液，并用0.22μm过滤筛过滤后分装于ep管，保存于-20℃下待用。
本实施例中的白骨壤茎叶乙酸乙酯萃取物应用在肺癌防治或治疗中。
实施例3
本实施例所提供的一种白骨壤茎叶乙酸乙酯萃取物是通过以下方法提取得到的：
a.将白骨壤晒干，分拣茎叶、叶，粉碎；
b.取步骤a所得白骨壤粉末加入ph为5.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，然后于98％(v/v)的乙醇内进行冷浸8天；
c.将步骤b处理后的物料，利用超声波提取2h，超声波提取法的操作参数为：超声频率为35khz，超声功率为550w，提取温度为45℃；然后进行震荡处理24h，滤过后，使用真空旋转蒸发仪在温度低于60℃的条件下回收乙醇，减压浓缩至无醇味，得到粗提取物浸膏；
d.将步骤c所得粗提取物浸膏用水溶解得到粗提液，先依次用石油醚和氯仿进行萃取以除去所述粗提液中的杂质，石油醚、所述氯仿与所述粗提液的体积比均为1：2；然后用乙酸乙酯对所述粗提液进行萃取，至少萃取2次，其中所述乙酸乙酯与所述粗提液的体积比为1.5：1，合并几次萃取得到的萃取液，得到白骨壤茎叶乙酸乙酯萃取液，接着将所得萃取液在62℃下浓缩干燥，得到白骨壤乙酸乙酯萃取物；
e.取白骨壤乙酸乙酯萃取物进行肿瘤细胞的细胞毒性筛选，接着将通过筛选的萃取物溶解于dmso中，配成100mg/ml的储备液，并用0.22μm过滤筛过滤后分装于ep管，保存于-20℃下待用。
本实施例中的白骨壤茎叶乙酸乙酯萃取物应用在肺癌防治或治疗中。
对比例
本对比例提供白骨壤茎叶在乙醇提取阶段中采用超声提取的效果对比。
对于白骨壤茎叶的超声波提取中，主要考虑超声波的频率、功率、温度和时间，不同的植物成分所需的参数不同，超声提取时间对天然产物提取率和对其有效时间成分有影响：
a.一些有效成分提取率，随着超声作用时间增加而增大；
b.提取率随着超声时间的增加逐渐增高，超过一定时间后，超声时间再延长，提取率增加缓慢；
c.提取率随着超声作用时间增加，在某一时刻达到一个极限值后，提取率反而减小。
申请人在发现白骨壤乙酸乙酯萃取物对于肺癌治疗具有积极作用后，致力于研究如何提高白骨壤提取物的提取率，白骨壤在进行乙酸乙酯萃取之前首先进行乙醇提取，乙醇提取的提取率关乎后期乙酸乙酯的萃取率，为了提高原料利用率，申请人按照以下参数分别进行乙醇提取阶段的实验，除了超声波提取参数不同，其他方法均相同，数据记录如表1所示：
表1超声波提取参数对白骨壤茎叶乙醇提取阶段提取率的影响
根据上表得知，在超声频率为30khz，超声功率为500w，提取温度为40℃，提取时间为1.5h时，白骨壤茎叶乙醇提取物的提取率最高，高达95.32％，而在提取参数分别低于上述参数或者高于上述参数时，其提取率都低于本发明实施例2中的提取参数(即超声频率为30khz，超声功率为500w，提取温度为40℃，提取时间为1.5h)，说明了本发明实施例2中所述的超声提取参数为白骨壤乙醇提取的最佳提取参数，为后期乙酸乙酯萃取奠定了良好基础。
试验例
本实施例是对白骨壤茎叶乙酸乙酯萃取物的应用进行试验，即本发明提供白骨壤茎叶乙酸乙酯萃取物在肺癌防治或治疗中的应用。
以下采用的白骨壤茎叶乙酸乙酯萃取物均为实施例2中所述的白骨壤茎叶乙酸乙酯萃取物。
一、细胞株及培养条件
细胞株：采用人非小细胞肺癌细胞a549作为细胞株，培养条件：将该细胞培养在含有10％胎牛血清、100u/ml的青霉素、100μg/ml链霉素的培养基f12k中，于37℃，5％co2恒温孵箱中培养。
二、体外肿瘤细胞生长抑制实验(mts法)
将对数生长期的细胞种植在96孔板中，每孔2000个细胞，每组设置3个复孔，置于37℃，5％co2恒温孵箱中过夜贴壁后给药。白骨壤乙酸乙酯萃取物设六个给药梯度组(46.875，62.5，93.75，125，187.5，250μg/ml)，每组给药组分别设置相应的药物颜色扣除孔，以及培养液对照组、dmso对照组，设置3块板，分别进行24、48、72h的检测。给药后置于37℃，5％co2恒温孵箱中进行常规培养。分别在培养24、48、72h后，每孔加入20μl完全融化后的celltiter96aqueousonesolutionreagent，然后将细胞放回培养箱中继续培养2h，于酶标仪上在490nm波光处处读取吸光度值。
其中，细胞活力(％)＝药物干预组/对照组×100％。用spss21检验统计分析，求出ic50。
三、试验结果
1.白骨壤茎叶乙酸乙酯萃取物对人肺非小细胞癌细胞a549的抑制作用
如图1所示，结果表明，白骨壤茎叶乙酸乙酯萃取物干预24h后，在93.75μg/ml、125μg/ml、187.5μg/ml、250μg/ml浓度时，均对人肺非小细胞癌细胞a549有明显的抑制作用，且成剂量依赖性。白骨壤茎叶乙酸乙酯萃取物干预48h和72h后，在62.50μg/ml、93.75μg/ml、125μg/ml、187.5μg/ml、250μg/ml浓度时，均对人肺非小细胞癌细胞a549有明显的抑制作用，且成剂量依赖性。
2.白骨壤茎叶乙酸乙酯萃取物抑制人非小细胞肺癌细胞a549的ic50
表1白骨壤茎叶乙酸乙酯萃取物抑制人非小细胞肺癌细胞a549的ic50
综上所述，可知白骨壤茎叶乙酸乙酯萃取物对人非小细胞肺癌细胞a549具有较好的抑制作用，本发明的白骨壤茎叶乙酸乙酯萃取物，作为活性成分在肺癌防治或治疗中具有重要用途。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。