本发明涉及一种固定化蛇毒凝血因子激活剂及活化凝血因子的制备方法。
背景技术
x因子和ii因子是凝血级联系统中最重要的两个凝血因子，广泛应用于凝血诊断试剂当中，如凝血酶时间测定试剂、纤维蛋白原诊断试剂、抗凝血酶iii诊断试剂、肝素诊断试剂。
目前，用于诊断试剂生产的x和ii因子一般来源于猪血或牛血，例如，我公司目前取得医疗器械注册证并在市场上销售的凝血诊断试剂盒中使用的凝血因子均来源于牛血，并采用钙离子、来自于动物的脑磷脂或蛇毒作为激活剂，使没有活性的x和ii因子转化为活化的xa和iia。
在文献“蛇毒凝血组分促凝机制及其应用研究进展，辛淑波”中，介绍了蝰科、响尾蛇科及眼镜蛇科的蛇毒素中含有各种激活凝血因子x的组分。
在专利“一种制备活化猪血浆凝血因子x的方法（cn107460182a）”中提到，可以从猪血浆中分离纯化凝血因子x，并采用rvv-x（一种来自于蝰蛇毒的x因子活化酶）、胰蛋白酶、柠檬酸钠等激活x转变为活性的xa。
在专利“一种具有促凝血作用的复方生物组分及其药物制剂（zl200410020115.3）”中也提到，可以从蝰蛇毒提取凝血x因子激活剂作为促凝血复方药物的组分之一。
目前的技术中，使用钙离子或脑磷脂等传统的激活方法，对x因子激活效果不好，反应时间超过72h，激活收率低于60%，且专一性差，往往会同时激活v因子、vii因子和ix因子。而使用专一性好的蛇毒提取物作为激活剂，又使产品中引入了有毒物质，需要进一步通过凝胶色谱去除过量的蛇毒，增加生产成本及控制难度。
技术实现要素：
本发明的一个目的是提供一种激活特异性强且可重复使用的固定化蛇毒凝血因子激活剂。
本发明的另一个目的是提供一种采用上述固定化蛇毒凝血因子激活剂的活化凝血因子的制备方法，该方法缩短了激活反应时间且无需采用复杂的凝胶色谱法去除残留的蛇毒。
为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明的一个目的是提供一种固定化蛇毒凝血因子激活剂，所述的固定化蛇毒凝血因子激活剂包括活性成分和固定有所述的活性成分的载体，所述的活性成分为蛇毒提取物。
优选地，所述的载体为海藻酸钙凝胶微球、纤维素、胶原蛋白、聚合物中的一种或多种。
优选地，所述的活性成分和所述的载体通过包埋或者共价结合的方式进行固定。
根据一种实施方式，所述的固定化蛇毒凝血因子激活剂的制备方法为：将海藻酸钠溶液和蛇毒溶液混合，然后滴加至氯化钙溶液中制得所述的固定化蛇毒凝血因子激活剂。
优选地，所述的蛇毒溶液的浓度为1~10μg/ml。
优选地，所述的海藻酸钠溶液的浓度为5~20mg/ml。
优选地，所述的海藻酸钠和所述的蛇毒的投料质量比为1000~20000:1，进一步优选为4000~50000:1。
优选地，所述的氯化钙溶液的质量百分浓度为1~8％。
进一步优选地，称取海藻酸钠0.5~2克加入100ml水中，加热溶解后冷却到30~50℃，加入浓度1~10μg/ml的蛇毒溶液10~50ml，混匀得到混合液，然后将该混合液滴入质量百分浓度为1~8％的氯化钙溶液中，制成直径1~5毫米的球形固定化蛇毒凝血因子激活剂。
根据另一种实施方式，所述的固定化蛇毒凝血因子激活剂的制备方法为：将蛇毒溶液和聚合物在2~8℃下孵育2~8h，然后经冲洗去除游离的蛇毒酶成分得到所述的固定化蛇毒凝血因子激活剂。
优选地，所述的蛇毒溶液的质量浓度为5~30μg/ml。
本发明中，所述的蛇毒溶液为蛇毒冻干粉和缓冲液形成的混合溶液，其中，缓冲液为ph6~8、含140~160mm氯化钠的tris-hcl缓冲液或ph6~8、含140~160mm氯化钠的pbs缓冲液。
优选地，所述的聚合物和所述的蛇毒的投料质量比为1000~20000:1，进一步优选为4000~50000:1。
优选地，所述的聚合物为经过预处理的聚合物，所述的预处理的方法包括如下步骤：
（1）、将聚合物颗粒浸没于混合液中，在40~55℃下蒸发20~40min后，用水冲洗所述的聚合物颗粒；其中，所述的混合液包括质量浓度为15%~25%的cacl2、质量浓度为15%~25%的甲醇、质量浓度为50%~70%的水；
（2）、将经步骤（1）处理后的聚合物颗粒浸没在盐酸中，在40~55℃下蒸发20~40min后，用水冲洗，然后用0.1~0.3mol/l、ph7~9的硼酸盐缓冲液冲洗；
（3）、将经步骤（2）处理后的聚合物颗粒置于含有质量浓度为3~5%的戊二醛、ph为7~9的pbs缓冲液中，在15~25℃蒸发10~30min；
（4）、将经步骤（3）处理后的聚合物颗粒用pbs缓冲液冲洗得到经过预处理后的聚合物。
本发明的另一个目的是提供一种活化凝血因子的制备方法，将猪血浆或牛血浆通过装填有所述的固定化蛇毒凝血因子激活剂的过滤柱，收集流出液得到所述的活化凝血因子；或者，将所述的固定化蛇毒凝血因子激活剂加入猪血浆或牛血浆中，搅拌1~5h，过滤得到所述的活化凝血因子。
优选地，所述的猪血浆或牛血浆通过所述的过滤柱的流速为0.05~0.2ml/min，进一步优选为0.1ml/min。
优选地，所述的猪血浆或牛血浆在所述的过滤柱中停留的时间为60~120min。
优选地，每升所述的猪血浆或牛血浆中加入10g~100g所述的固定化蛇毒凝血因子激活剂。
优选地，所述的猪血浆和所述的牛血浆为经过粗提取步骤处理后的猪血浆和牛血浆。
本发明中，所述的猪血浆和所述的牛血浆的粗提取方法为常规方法，例如将添加有柠檬酸抗凝的猪血浆或牛血浆加入硫酸钡或氯化钡，然后离心得到沉淀，将沉淀溶解在edta溶液中，采用deae纤维素吸附，然后用氯化钠溶液洗脱，收集氯化钠溶液洗脱液得到经过粗提取步骤处理后的猪血浆或牛血浆。
优选地，述的猪血浆和所述的牛血浆的粗提取方法包括如下步骤：
（1）、按1l猪血浆或牛血浆中添加3~4g柠檬酸的量将柠檬酸加入猪血浆或牛血浆中，搅拌均匀，然后以3000~5000转/分钟的速度离心去除细胞碎片；
（2）、按1l猪血浆或牛血浆中加入90~110ml浓度为0.9~1.1m的硫酸钡溶液或氯化钡溶液的量向经步骤（1）处理后的猪血浆或牛血浆中加入所述的硫酸钡溶液或氯化钡溶液，搅拌20~40分钟，离心得到沉淀；
（3）、按1l猪血浆或牛血浆中加入100~150ml浓度为0.1~0.3m的edta溶液的量将步骤（2）得到的沉淀溶解在所述的edta溶液中，然后采用deae纤维素吸附，用不同浓度的氯化钠溶液洗脱，收集0.3m的氯化钠溶液洗脱的洗脱液得到x因子溶液；收集0.1m的氯化钠溶液洗脱的洗脱液得到ii因子溶液。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优势：
本发明通过将从蛇毒中提取出的x因子和ii因子激活剂与载体连接得到固定化蛇毒凝血因子激活剂，该固定化蛇毒凝血因子激活剂可重复使用，并且在用该固定化蛇毒凝血因子激活剂对初步提取的凝血因子进行激活时，仅需除去固定化蛇毒凝血因子激活剂，则提取液中的蛇毒组分同时被除去，从而无需使用复杂的凝胶色谱法来除去残留的蛇毒，另外，与现有的钙离子激活法相比，本发明的方法缩短了激活反应时间，提高了激活后的因子比活，且激活特异性强。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明的基本原理、主要特征和优点，而本发明不受以下实施例的限制。实施例中采用的实施条件可以根据具体要求做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例1、包埋法制备固定化蛇毒凝血因子激活剂
将蛇毒冻干粉溶解在ph7、含150mm氯化钠的pbs缓冲液中形成浓度为1μg/ml的蛇毒溶液，将0.5g的海藻酸钠加入100ml纯水中，加热溶解后冷却至30℃，加入10ml蛇毒溶液，搅拌混合后，用注射器缓缓滴加至质量浓度为1%的氯化钙溶液中形成小球，小球的直径为1~5毫米，即得固定化蛇毒凝血因子激活剂。
实施例2、包埋法制备固定化蛇毒凝血因子激活剂
将蛇毒冻干粉溶解在ph7、含150mm氯化钠的pbs缓冲液中形成浓度为5μg/ml的蛇毒溶液，将1g的海藻酸钠加入100ml纯水中，加热溶解后冷却至30℃，加入30ml蛇毒溶液，搅拌混合后，用注射器缓缓滴加至质量浓度为5%的氯化钙溶液中形成小球，小球的直径为1~5毫米，即得固定化蛇毒凝血因子激活剂。
实施例3、包埋法制备固定化蛇毒凝血因子激活剂
将蛇毒冻干粉溶解在ph7、含150mm氯化钠的pbs缓冲液中形成浓度为10μg/ml的蛇毒溶液，将2g的海藻酸钠加入100ml纯水中，加热溶解后冷却至30℃，加入50ml蛇毒溶液，搅拌混合后，用注射器缓缓滴加至质量浓度为8%的氯化钙溶液中形成小球，小球的直径为1~5毫米，即得固定化蛇毒凝血因子激活剂。
实施例4、包埋法制备固定化蛇毒凝血因子激活剂
与实施例2基本相同，不同之处在于：采用ph7、含150mm氯化钠的tris-hcl缓冲液配制蛇毒溶液。
实施例5、交联法制备固定化蛇毒凝血因子激活剂
（1）、将聚酰胺颗粒浸没于混合液中，在40℃下旋转蒸发30min后，用纯水冲洗聚酰胺颗粒；其中，混合液包括质量浓度为20%的cacl2、质量浓度为20%的甲醇、质量浓度为60%的水；
（2）、将经步骤（1）处理后的聚酰胺颗粒浸没在盐酸中，在40℃下旋转蒸发30min后，用纯水冲洗，然后用0.2mol/l、ph7的硼酸盐缓冲液冲洗；
（3）、将经步骤（2）处理后的聚酰胺颗粒浸没在含有质量浓度为3%的戊二醛、ph为7的pbs缓冲液中，在15℃旋转蒸发20min；
（4）、将经步骤（3）处理后的聚酰胺颗粒用pbs缓冲液冲洗得到经过预处理后的聚酰胺颗粒；
（5）、将蛇毒冻干粉溶解在ph7、含150mm氯化钠的pbs缓冲液中形成浓度为1μg/ml的蛇毒溶液；
（6）、将经步骤（4）处理后的聚酰胺颗粒0.5g加入步骤（5）得到的10ml蛇毒溶液中，在2℃下孵育8h，然后用生理盐水冲洗，去掉游离的蛇毒酶成分，得到固定化蛇毒凝血因子激活剂。
实施例6、交联法制备固定化蛇毒凝血因子激活剂
（1）、将聚酰胺颗粒浸没于混合液中，在50℃下旋转蒸发30min后，用纯水冲洗聚酰胺颗粒；其中，混合液包括质量浓度为20%的cacl2、质量浓度为20%的甲醇、质量浓度为60%的水；
（2）、将经步骤（1）处理后的聚酰胺颗粒浸没在盐酸中，在50℃下旋转蒸发30min后，用纯水冲洗，然后用0.2mol/l、ph8的硼酸盐缓冲液冲洗；
（3）、将经步骤（2）处理后的聚酰胺颗粒浸没在含有质量浓度为4%的戊二醛、ph为8的pbs缓冲液中，在20℃旋转蒸发20min；
（4）、将经步骤（3）处理后的聚酰胺颗粒用pbs缓冲液冲洗得到经过预处理后的聚酰胺颗粒；
（5）、将蛇毒冻干粉溶解在ph7、含150mm氯化钠的pbs缓冲液中形成浓度为5μg/ml的蛇毒溶液；
（6）、将经步骤（4）处理后的聚酰胺颗粒1g加入步骤（5）得到的30ml蛇毒溶液中，在5℃下孵育6h，然后用生理盐水冲洗，去掉游离的蛇毒酶成分，得到固定化蛇毒凝血因子激活剂。
实施例7、交联法制备固定化蛇毒凝血因子激活剂
（1）、将聚酰胺颗粒浸没于混合液中，在55℃下旋转蒸发30min后，用纯水冲洗聚酰胺颗粒；其中，混合液包括质量浓度为20%的cacl2、质量浓度为20%的甲醇、质量浓度为60%的水；
（2）、将经步骤（1）处理后的聚酰胺颗粒浸没在盐酸中，在55℃下旋转蒸发30min后，用纯水冲洗，然后用0.2mol/l、ph9的硼酸盐缓冲液冲洗；
（3）、将经步骤（2）处理后的聚酰胺颗粒浸没在含有质量浓度为5%的戊二醛、ph为9的pbs缓冲液中，在25℃旋转蒸发20min；
（4）、将经步骤（3）处理后的聚酰胺颗粒用pbs缓冲液冲洗得到经过预处理后的聚酰胺颗粒；
（5）、将蛇毒冻干粉溶解在ph7、含150mm氯化钠的pbs缓冲液中形成浓度为10μg/ml的蛇毒溶液；
（6）、将经步骤（4）处理后的聚酰胺颗粒2g加入步骤（5）得到的50ml蛇毒溶液中，在8℃下孵育2h，然后用生理盐水冲洗，去掉游离的蛇毒酶成分，得到固定化蛇毒凝血因子激活剂。
实施例8、待激活x因子和ii因子溶液的制备
将3.5g柠檬酸加入1l猪血浆中，搅拌均匀，4000转/分离心去除细胞碎片。然后加入100ml、浓度为1m的硫酸钡溶液，搅拌30分钟，离心得到沉淀，将沉淀溶解在120ml、浓度为0.2m的edta溶液中，然后采用deae纤维素吸附，用氯化钠溶液洗脱，收集0.3m的氯化钠溶液洗脱的洗脱液得到x因子溶液；收集0.1m的氯化钠溶液洗脱的洗脱液得到ii因子溶液。
实施例9、活化凝血因子的制备
将实施例1制得的固定化蛇毒凝血因子激活剂装填在长度为80cm、直径为0.8cm的玻璃柱中，然后将实施例8制得的待激活x因子溶液和待激活ii因子溶液分别以0.05ml/min的流速从玻璃柱的顶端流经玻璃柱并使得待激活x因子溶液和待激活ii因子溶液在玻璃柱中停留的时间为120min，收集流出液，分别得到激活的x因子溶液和激活的ii因子溶液，其中，激活的x因子的收率为45%，比活为5800u/mg；激活的ii因子的收率为60%，比活为1000u/mg。
实施例10
基本上与实施例9相同，不同之处在于：待激活x因子溶液和待激活ii因子溶液的流速为0.1ml/min，在玻璃柱中停留的时间为100min，其中，激活的x因子的收率为48%，比活为6000u/mg；激活的ii因子的收率为65%，比活为1200u/mg。
实施例11
基本上与实施例9相同，不同之处在于：待激活x因子溶液和待激活ii因子溶液的流速为0.2ml/min，在玻璃柱中停留的时间为60min，其中，激活的x因子的收率为40%，比活为5000u/mg；激活的ii因子的收率为50%，比活为800u/mg。
对比例1
基本上与实施例9相同，不同之处在于：待激活x因子溶液和待激活ii因子溶液的流速为0.3ml/min，在玻璃柱中停留的时间为100min，其中，激活的x因子的收率为30%，比活为4000u/mg；激活的ii因子的收率为40%，比活为500u/mg。
对比例2
基本上与实施例9相同，不同之处在于：待激活x因子溶液和待激活ii因子溶液的流速为0.01ml/min，在玻璃柱中停留的时间为120min，其中，激活的x因子的收率为25%，比活为4000u/mg；激活的ii因子的收率为35%，比活为500u/mg。
实施例12
基本上与实施例10相同，不同之处在于：玻璃柱中装填的是实施例2制得的固定化蛇毒凝血因子激活剂，其中，激活的x因子的收率为50%，比活为7000u/mg；激活的ii因子的收率为70%，比活为1500u/mg。
实施例13
基本上与实施例10相同，不同之处在于：玻璃柱中装填的是实施例3制得的固定化蛇毒凝血因子激活剂，其中，激活的x因子的收率为47%，比活为6800u/mg；激活的ii因子的收率为68%，比活为1300u/mg。。
实施例14
基本上与实施例10相同，不同之处在于：玻璃柱中装填的是实施例4制得的固定化蛇毒凝血因子激活剂，其中激活的x因子的收率为50%，比活为7000u/mg；激活的ii因子的收率为70%，比活为1500u/mg。
实施例15
基本上与实施例10相同，不同之处在于：玻璃柱中装填的是实施例5制得的固定化蛇毒凝血因子激活剂，其中，激活的x因子的收率为44%，比活为5700u/mg；激活的ii因子的收率为61%，比活为1100u/mg。。
实施例16
基本上与实施例10相同，不同之处在于：玻璃柱中装填的是实施例6制得的固定化蛇毒凝血因子激活剂，其中，激活的x因子的收率为49%，比活为6000u/mg；激活的ii因子的收率为67%，比活为1200u/mg。
实施例17
基本上与实施例10相同，不同之处在于：玻璃柱中装填的是实施例7制得的固定化蛇毒凝血因子激活剂，其中，激活的x因子的收率为40%，比活为5000u/mg；激活的ii因子的收率为50%，比活为800u/mg。
实施例18
将10g实施例1制得的固定化蛇毒凝血因子激活剂分别投入实施例8制得的1l的待激活x因子溶液和1l的待激活ii因子溶液中，搅拌1h，过滤，分别得到激活的x因子溶液和激活的ii因子溶液，其中，激活的x因子的收率为40%，比活为5000u/mg；激活的ii因子的收率为50%，比活为800u/mg。
实施例19
基本上与实施例18相同，不同之处在于：固定化蛇毒凝血因子激活剂的投加质量为50g，搅拌时间为3h，其中，激活的x因子的收率为44%，比活为6000u/mg；激活的ii因子的收率为63%，比活为1200u/mg。
实施例20
基本上与实施例18相同，不同之处在于：固定化蛇毒凝血因子激活剂的投加质量为100g，搅拌时间为5h，其中，激活的x因子的收率为48%，比活为6900u/mg；激活的ii因子的收率为65%，比活为1400u/mg。
实施例21
基本上与实施例20相同，不同之处在于：采用实施例2制得的固定化蛇毒凝血因子激活剂，其中，激活的x因子的收率为50%，比活为7000u/mg；激活的ii因子的收率为70%，比活为1500u/mg。
实施例22
基本上与实施例20相同，不同之处在于：采用实施例3制得的固定化蛇毒凝血因子激活剂，其中，激活的x因子的收率为47%，比活为6200u/mg；激活的ii因子的收率为60%，比活为900u/mg。
实施例23
基本上与实施例20相同，不同之处在于：采用实施例4制得的固定化蛇毒凝血因子激活剂，其中，激活的x因子的收率为50%，比活为7000u/mg；激活的ii因子的收率为70%，比活为1500u/mg。
实施例24
基本上与实施例20相同，不同之处在于：采用实施例5制得的固定化蛇毒凝血因子激活剂，其中，激活的x因子的收率为42%，比活为6000u/mg；激活的ii因子的收率为53%，比活为850u/mg。
实施例25
基本上与实施例20相同，不同之处在于：采用实施例6制得的固定化蛇毒凝血因子激活剂，其中，激活的x因子的收率为50%，比活为7000u/mg；激活的ii因子的收率为70%，比活为1500u/mg。
实施例26
基本上与实施例20相同，不同之处在于：采用实施例7制得的固定化蛇毒凝血因子激活剂，其中，激活的x因子的收率为44%，比活为6500u/mg；激活的ii因子的收率为66%，比活为1400u/mg。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。