穗花杉双黄酮在治疗鸡坏死性肠炎中的医用用途的制作方法

本发明公开了穗花杉双黄酮在治疗鸡坏死性肠炎中的医用用途，涉及穗花杉双黄酮在制备治疗鸡坏死性肠炎药物中的应用，属于医药技术领域。

背景技术

产气荚膜梭菌是一种厌氧性革兰氏阳性芽孢杆菌，广泛存在于自然界的土壤、水体、食物、人畜粪便、家畜饲料及动物肠道中，是人和动物的正常肠道菌群，属条件致病菌。目前根据其分泌的外毒素不同，将其分为a-e共个5血清型，家禽主要感染a型及c型产气荚膜梭菌，尤以a型为主。产气荚膜梭菌感染家禽后，主要引起坏死性肠炎，其症状表现为肉鸡精神委靡、羽毛松乱、食欲减少或废绝，排血便，生产性能严重下降。病变主要集中在小肠部位，表现为肠壁变薄，有局灶性或成片的肠粘膜坏死脱落。据有关研究统计，全球家禽行业因坏死性肠炎造成的经济损失高达数十亿美元，严重危害了家禽养殖业的发展。

产气荚膜梭菌在肠道内的粘附定植主要是通过其四型菌毛(typeivpili，tfp)介导的。tfp是一种存在于细菌细胞膜上的一种运动器官，tfp使得产气荚膜梭菌具有在其自然生境和软硬琼脂等半固体的介质表面运动的能力，这种特殊的运动方式被称作滑动运动(glidingmotility)。据研究表明，包括产气荚膜梭菌在肠道的粘附定植、滑动运动、生物被膜的形成等细菌功能都与tfp具有一定的联系。通过抑制产气荚膜梭菌tfp的功能，能够干扰细菌在肠道内的粘附定植，从而达到抗产气荚膜梭菌感染的目的。

通过在饲料中添加抗生素是预防并治疗家禽感染坏死性肠炎的主要手段，然而，由于抗生素大量使用所致的细菌耐药性问题及抗生素残留问题对公众健康造成了严重威胁，因此，开发安全有效的抗生素替代物正日益成为研究的热点。天然化合物具有毒性较低、来源丰富、安全范围广等优点，是筛选抗生素替代物的重要资源。

穗花杉双黄酮是一种天然存在的双黄酮类化合物，主要存在于穗花杉属植物穗花杉及卷柏属植物卷柏中。卷柏在民间被称为“九死还魂草、长生不老草、万年青”等，传统医学认为，卷柏具有破血散瘀，活血通经等作用。现代医学研究表明，穗花杉双黄酮具抗炎、抗癌、抗病毒、抗真菌、抗氧化、降血糖、降血脂等生物学活性。近年来，大量的文献对穗花杉双黄酮的药理活性进行了报道，但是，截至目前国内外尚无穗花杉双黄酮用于治疗产气荚膜梭菌所致鸡坏死性肠炎的相关研究。

技术实现要素：

本发明提供了穗花杉双黄酮在治疗鸡坏死性肠炎中的医用用途，对产气荚膜梭菌所致的鸡坏死性肠炎具有良好的治疗效果。

本发明所述的穗花杉双黄酮的分子结构如图1所示，分子式为：c30h18o10；分子量：538.46。

本发明通过产气荚膜梭菌滑动运动抑制试验、生物被膜形成抑制试验、雏鸡坏死性肠炎模型治疗试验、病理组织学切片观察及肠道菌群分析试验验证穗花杉双黄酮对产气荚膜梭菌感染所致的鸡坏死性肠炎具有保护作用：

一、滑动运动抑制试验：

产气荚膜梭菌标准株atcc13124于液体bhi培养基37℃厌氧培养12h，之后取300μl该培养物继续培养于液体bhi中，37℃厌氧培养5h。取1ml培养物，10000g离心弃上清，菌体重悬于500μlbhi液体培养基中，使之二倍浓缩。之后取5μl浓缩的菌液分别滴加于预先制备并于37℃烘箱干燥1h的含4μg/ml、16μg/ml穗花杉双黄酮的0.7％bhia的平板上，37℃厌氧培养72h，采集图像(参见图2)。结果表明，4μg/ml及16μg/ml穗花杉双黄酮均能显著抑制产气荚膜梭菌在bhia上的滑动运动，且16μg/ml穗花杉双黄酮作用效果更为明显。

二、生物被膜形成抑制试验

产气荚膜梭菌于液体bhi中37℃厌氧培养12h，离心弃上清，用灭菌pbs洗涤一次，之后用tsb液体培养基重悬并调整至od600nm＝0.1，取400μl调整后的细菌培养物，加至24孔板中,之后与细菌培养物内分别加入不同浓度的穗花杉双黄酮，使得24孔板内穗花杉双黄酮的终浓度分别为2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml及16μg/ml，另设立加入dmso(不加入穗花杉双黄酮)的阳性对照组以及400μl液体tsb培养基的阴性对照组，24孔板置于30℃厌氧培养5d。之后吸弃上清，灭菌pbs洗两次，室温干燥30min，加入过滤灭菌的1％结晶紫400μl，室温孵育30min，弃结晶紫，再次用灭菌pbs洗两次。向每孔中加入33％乙酸溶解结晶紫，吹打混匀后取300μl分别加入96孔板的3个独立孔中，每孔100μl，于酶标仪570nm测定吸光值，根据结晶紫吸光值计算生物被膜形成率。结果表明，穗花杉双黄酮能够有效抑制产气荚膜梭菌生物被膜的形成(参见图3)。

三、雏鸡坏死性肠炎模型试验的治疗学研究

1、雏鸡坏死性肠炎模型

取17日龄的雄性爱拔益加(arboracre)肉仔鸡经口给予0.5ml(1×10⁹cfus)重悬于灭菌pbs的产气荚膜梭菌atcc13124培养物，次日(18日龄)再次给予相同菌量的菌液以攻菌，建立雏鸡坏死性肠炎模型，健康组肉鸡经口给予0.5ml灭菌pbs作为对照。

2、肠道病变评分试验

雏鸡经口攻菌感染前4h(17日龄)按肉鸡体重经口给予25mg/kg的穗花杉双黄酮(溶解于灭菌pbs)，每12h给药一次。另设立不给药治疗的阳性对照组及不攻菌感染的健康对照组，阳性对照组与健康对照组肉鸡同样称重并按体重经口给予相应体积的灭菌pbs。上述三组每组10只鸡，治疗组共给药治疗5天(治疗至21日龄)。21日龄颈椎脱臼处死全部肉鸡，剖检，取十二指肠至空肠，肉眼观察肠道病理变化，根据肠道损伤程度进行肠道损伤评分(参见图4)。肠道损伤评分采用0-4分制：0分表示正常健康的组织，无明显肉眼可见病变；1分表示肠壁变薄或脆弱易碎，外观呈灰白色；2分表示肠壁变薄或脆弱易碎，外观呈灰白色，伴有局灶性坏死，肠管内充有少量气体；3分表示肠壁变薄或脆弱易碎，有大量的坏死灶或斑点状出血，肠道明显充气；4分表示肠道严重的广泛性坏死，伴有明显的出血，肠腔内充斥大量气体。另将上述小肠采集病料，he染色制作病理切片，镜下观察病理组织学变化(参见图5)。

第20日龄时，采集各组肉鸡粪样，进行宏基因组测序，在纲水平上分析肠道菌群丰度变化(参见图6)。

肠道病变评分结果表明，经穗花杉双黄酮治疗后，显著降低了坏死性肠炎肉鸡肠道的病理变化程度。病理组织学观察结果表明，健康组肉鸡小肠肠绒毛结构完整，无出血及炎性渗出；对照组肉鸡小肠绒毛坏死溶解，结构不完整，伴有大量出血；经穗花杉双黄酮治疗后，上述病理组织学损伤明显缓解。肠道菌群变化分析结果表明，经穗花杉双黄酮治疗后，肠道内梭状芽胞杆菌丰度显著低于对照组(结果仅显示丰度前三)，提示在纲水平上梭状芽胞杆菌粘附定植数量显著下降。

综合以上结果，说明穗花杉双黄酮对产气荚膜梭菌所致的鸡坏死性肠炎具有良好的保护作用。

本发明的积极效果在于：提供了穗花杉双黄酮的一种新医用用途，用于治疗鸡坏死性肠炎，可显著降低坏死性肠炎肉鸡肠道的病理变化程度，对产气荚膜梭菌所致的鸡坏死性肠炎具有良好的治疗效果。

附图说明

图1为穗花杉双黄酮的分子结构；

图2为穗花杉双黄酮均能显著抑制产气荚膜梭菌在bhia上的滑动运动图片；

图3为穗花杉双黄酮能够有效抑制产气荚膜梭菌生物被膜的形成图；

图4为根据肠道损伤程度进行肠道损伤评分图；

图5为镜下观察病理组织学变化照片；

图6为穗花杉双黄酮治疗后对患坏死性肠炎肉鸡肠道纲水平菌群丰度的影响图。

具体实施方式

实施例1

穗花杉双黄酮在制备治疗鸡坏死性肠炎药物中的应用，以穗花杉双黄酮为活性制成药学上可接受任何剂型。

实施例2

穗花杉双黄酮所述的治疗鸡坏死性肠炎指由细菌引起的坏死性肠炎。

实施例3

穗花杉双黄酮所述的治疗鸡坏死性肠炎是指由产气荚膜梭菌引起的坏死性肠炎。