本发明涉及医学生物材料制备技术领域，具体涉及一种钛基骨修复材料的制备方法。
背景技术：
随着经济的高速发展，因交通事故、工伤、各种疾病及创伤引起的骨缺损情况越来越频繁，骨组织损伤现已成为人类健康面临的一大难题。目前临床上主要采用自体骨或异体骨实现骨修复，然而自体骨和天然骨的来源有限，同时还会存在异体骨产生排异反应、修复区域的并发症以及修复融合时间长等问题，因此，迫切需求一种新型人工骨修复材料以解决以上问题。
理想的骨修复材料首先应该具备的特性有：
（1）生物相容性：可与骨直接进行化学结合，不阻止骨细胞在其表面的正常活性或干扰其周围骨细胞的自然再生过程，对骨组织的分解吸收具有传导性。
具有可塑性和一定的机械强度。
生物降解性：在一定时间内被宿主骨替代，不影响骨组织的修复，无毒副作用。
诱导再生性：通过自身或添加骨诱导因素，刺激或诱导骨骼生长。
目前在临床上使的修复材料包括以下几大类：天然生物材料主要包括胶原、明胶，纤维蛋白、壳聚糖、蚕丝蛋白、脱细胞基质等。天然生物材料安全性较高且易获得，但最大的缺点是降解太快，新生组织往往达不到很好的塑形，且力学强度不够，被大大限制了应用。无机材料以羟基磷灰石、磷酸三钙为代表。有机材料以pla、pga、plga、聚己内酯、聚环氧乙烯、聚乙烯醇等高分子聚合物为主，其中研究最多的是pla、pga以及plga。虽然人工合成材料具有一定的生物活性，但其存在强度低、断裂韧性低的缺陷，在抗压强度和弹性模量上与其周围的正常组织尚有一定的差别，在受力和疲劳之后断裂和界面有剥离现象，故而一般只能作为骨填充材料或是应用于非承力部位。此外，人工合成材料在不同程度上都存在生物相容性的问题，会引发物理刺激引起的无菌炎症及慢性排异引起的后遗症。
因此研发一种生物学稳定、价格低廉且具有骨形成促进作用的骨修复材料用于骨缺损修复上具有创新和应用价值。
技术实现要素：
本发明主要解决的技术问题，针对目前骨修复材料中天然生物材料主要包括胶原、明胶，纤维蛋白、壳聚糖、蚕丝蛋白、脱细胞基质等，天然生物材料安全性较高且易获得，但最大的缺点是降解太快，新生组织往往达不到很好的塑形，而人工合成骨诱导成骨能力差、成骨量少的缺陷，提供了一种钛基骨修复材料的制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
一种钛基骨修复材料的制备方法，其特征在于具体制备步骤为：
（1）将钛片置于超声清洗机中，依次用无水乙醇和丙酮清洗，将清洗后的钛片放入烘箱中干燥后转移至装有10～15ml氢氧化钠溶液的高压反应釜中，加热升温，保温反应得到纳米线基体；
（2）将0.2～0.3g石墨粉和0.12～0.13g硝酸钠加入到装有10～12ml浓硫酸溶液的烧杯中，将烧杯置于冰水浴中，搅拌反应，撤去冰水浴常温下搅拌反应，向烧杯中加入10～15ml去离子水和20～25ml双氧水，继续搅拌反应直至无气泡产生；
（3）继续向上述烧杯中加入20～25ml硫酸溶液和10～15ml双氧水，搅拌反应45～50min后真空抽滤除去滤液得到滤饼，并用去离子水冲洗所得滤饼直至洗涤液为中性，将冲洗后的滤饼放入烘箱中干燥，得到固态氧化石墨烯；
（4）将上述制备的固态氧化石墨烯置于超声分散机中，加入蒸馏水超声分散，得到氧化石墨烯悬浊液，取10～12ml氧化石墨烯悬浊液，向其中加入1.0～1.2g氢氧化钠和0.8～1.0g氯乙酸超声分散，得到羧基化氧化石墨烯胶体；
（5）将1～2g三羟甲基氨基甲烷加入至上述羧基化氧化石墨烯胶体中，超声分散，得到混合液，向混合液中继续加入2～3g1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和3～4g1，3-丙二胺，反应得到石墨烯纳米片悬浮液；
（6）将丝素蛋白原液、酪蛋白混合得到包膜液，在二电极反应池中将石墨烯纳米片悬浮液作为沉积液，以纳米线基体作为工作电极，铂片电极作为对电极，进行电泳沉积，得到骨架材料，再将包膜液作为新沉积液，对骨架材料进行电泳沉积，得到钛基骨修复材料。
步骤（1）所述的超声清洗时控制超声频率为30～35khz，烘箱设定温度为70～80℃，干燥时间为4～5h，氢氧化钠溶液的质量分数为40%，加热升温为200～240℃，保温反应时间为7～8h。
步骤（2）所述的浓硫酸溶液的质量分数为85%，搅拌反应时间为30～45min，撤去冰水浴常温下搅拌反应时间为1～2h，双氧水的质量分数为10%。
步骤（3）所述的硫酸溶液质量分数为8%，双氧水的质量分数5%，搅拌反应时间为45～50min，烘箱的设定温度为60～70℃，干燥时间20～24h。
步骤（4）所述的超声分散时间为10～15min，氧化石墨烯悬浊液质量浓度为2～3mg/l，加入氢氧化钠和氯乙酸继续超声分散时间为1～2h，控制超声频率为30～33khz。
步骤（5）所述的超声分散时间为30～35min，反应时间为3～4h。
步骤（6）所述的丝素蛋白原液的质量分数为20%，丝素蛋白原液与酪蛋白混合质量比为5:1，两次电泳沉积时控制沉积液的ph为7.00～8.25，沉积电压为1.0～1.2v，沉积时间为5～10min。
本发明的有益效果是：
（1）本发明以钛片为材料制成纳米线基体，将石墨粉、硝酸钠在冰水浴条件下依次加入硫酸溶液、双氧水，搅拌反应后真空抽滤，得到滤饼，经过洗涤干燥后得到固态氧化石墨烯，将固态氧化石墨烯配置成悬浊液，超声分散加入氢氧化钠、氯乙酸后得到羧基化氧化石墨烯胶体，将三羟甲基氨基甲烷掺入羧基化氧化石墨烯胶体中超声分散，继续加入1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1，3-丙二胺，反应得到石墨烯纳米片悬浮液，将丝素蛋白原液与酪蛋白混合配制成包膜液，通过二电极池反应池依次以石墨烯纳米片悬浮液、包膜液作为沉积液，对纳米线基体进行电泳沉积得到钛基骨修复材料，本发明所用纳米线基体化学反应活性高，可将氧化石墨烯沉积修饰在其表面，不仅提高了骨修复材料的生物相容性和生物活性，还可通过电泳沉积时间对骨修复材料进行塑形调控，所用包膜液为丝素蛋白原液和酪蛋白，它们都具有高生物相容性，丝素蛋白可在人体中缓慢降解，酪蛋白在酸性环境中可被肠胃吸收，降解性能良好并且不产生任何毒害物质；
（2）本发明以水热合成法制备出具有网格状微孔结构的纳米线基体，所制得的纳米线基体微孔为2～10μm，形貌规则且分布均匀，能够为骨细胞的生长提供场所，为了改善其生物相容性、生物活性，通过电泳沉积以氧化石墨烯纳米片为沉积物对钛基纳米线基体进行规整、均匀的修饰，并以多孔结构的钛基纳米线薄膜为基底，向外衍生，形成三维的氧化石墨烯孔洞结构，不仅增大了骨修复材料的粗糙度以及细胞的接触点，也提高了材料的机械强度，为细胞的粘附、生长、增殖以及新骨的长入提供一个良好的环境，通过氯乙酸、1，3-丙二胺等对氧化石墨烯的羟基、氨基、羧基的功能化进一步提高了氧化石墨烯修饰的钛基纳米线骨修复材料的alp活性，相对于未功能化的骨修复材料，提高了骨诱导成骨能力，且酪蛋白中所含钙、磷元素为骨细胞增殖提供前期充足养料，应用前景广阔。
具体实施方式
将钛片置于超声清洗机中，依次用无水乙醇和丙酮清洗10～15min，控制超声频率为30～35khz，将清洗后的钛片放入设定温度为70～80℃的烘箱中干燥4～5h后转移至装有10～15ml质量分数为40%的氢氧化钠溶液的高压反应釜中，加热升温至200～240℃，保温反应7～8h，得到纳米线基体；将0.2～0.3g石墨粉和0.12～0.13g硝酸钠加入到装有10～12ml质量分数为85%的浓硫酸溶液的烧杯中，将烧杯置于冰水浴中，搅拌反应30～45min，撤去冰水浴常温下搅拌反应1～2h，向烧杯中加入10～15ml去离子水和20～25ml质量分数为10%的双氧水，继续搅拌反应直至无气泡产生；继续向上述烧杯中加入20～25ml质量分数为8%的硫酸溶液和10～15ml质量分数5%的双氧水，搅拌反应45～50min后真空抽滤除去滤液得到滤饼，并用去离子水冲洗所得滤饼直至洗涤液为中性，将冲洗后的滤饼放入设定温度为60～70℃的烘箱中干燥20～24h，得到固态氧化石墨烯；将上述制备的固态氧化石墨烯置于超声分散机中，加入蒸馏水超声分散10～15min，使得到氧化石墨烯悬浊液质量浓度为2～3mg/l，取10～12ml氧化石墨烯悬浊液，向其中加入1.0～1.2g氢氧化钠和0.8～1.0g氯乙酸超声分散1～2h，控制超声频率为30～33khz，得到羧基化氧化石墨烯胶体；将1～2g三羟甲基氨基甲烷加入至上述羧基化氧化石墨烯胶体中，超声分散30～35min，得到混合液，向混合液中继续加入2～3g1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和3～4g1，3-丙二胺，反应3～4h，得到石墨烯纳米片悬浮液；将质量分数为20%的丝素蛋白原液、酪蛋白按质量比为5:1混合得到包膜液，在二电极反应池中将石墨烯纳米片悬浮液作为沉积液，以纳米线基体作为工作电极，铂片电极作为对电极，进行电泳沉积，得到骨架材料，再将包膜液作为新沉积液，对骨架材料进行电泳沉积，两次电泳沉积时控制沉积液的ph为7.00～8.25，沉积电压为1.0～1.2v，沉积时间为5～10min，得到钛基骨修复材料。
将钛片置于超声清洗机中，依次用无水乙醇和丙酮清洗10min，控制超声频率为30khz，将清洗后的钛片放入设定温度为70℃的烘箱中干燥4h后转移至装有10ml质量分数为40%的氢氧化钠溶液的高压反应釜中，加热升温至200℃，保温反应7h，得到纳米线基体；将0.2g石墨粉和0.12g硝酸钠加入到装有10ml质量分数为85%的浓硫酸溶液的烧杯中，将烧杯置于冰水浴中，搅拌反应30min，撤去冰水浴常温下搅拌反应1h，向烧杯中加入10ml去离子水和20ml质量分数为10%的双氧水，继续搅拌反应直至无气泡产生；继续向上述烧杯中加入20ml质量分数为8%的硫酸溶液和10ml质量分数5%的双氧水，搅拌反应45min后真空抽滤除去滤液得到滤饼，并用去离子水冲洗所得滤饼直至洗涤液为中性，将冲洗后的滤饼放入设定温度为60℃的烘箱中干燥20h，得到固态氧化石墨烯；将上述制备的固态氧化石墨烯置于超声分散机中，加入蒸馏水超声分散10min，使得到的氧化石墨烯悬浊液质量浓度为2mg/l，取10ml氧化石墨烯悬浊液，向其中加入1.0g氢氧化钠和0.8g氯乙酸超声分散1h，控制超声频率为30khz，得到羧基化氧化石墨烯胶体；将1g三羟甲基氨基甲烷加入至上述羧基化氧化石墨烯胶体中，超声分散30min，得到混合液，向混合液中继续加入2g1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和3g1，3-丙二胺，反应3h，得到石墨烯纳米片悬浮液；将质量分数为20%的丝素蛋白原液、酪蛋白按质量比为5:1混合得到包膜液，在二电极池反应池中将石墨烯纳米片悬浮液作为沉积液，以纳米线基体作为工作电极，铂片电极作为对电极，进行电泳沉积，得到骨架材料，再将包膜液作为新沉积液，对骨架材料进行电泳沉积，两次电泳沉积时控制沉积液的ph为7.00，沉积电压为1.0v，沉积时间为5min，得到钛基骨修复材料。
将钛片置于超声清洗机中，依次用无水乙醇和丙酮清洗13min，控制超声频率为33khz，将清洗后的钛片放入设定温度为75℃的烘箱中干燥4h后转移至装有13ml质量分数为40%的氢氧化钠溶液的高压反应釜中，加热升温至220℃，保温反应7h，得到纳米线基体；将0.2g石墨粉和0.12g硝酸钠加入到装有11ml质量分数为85%的浓硫酸溶液的烧杯中，将烧杯置于冰水浴中，搅拌反应37min，撤去冰水浴常温下搅拌反应1h，向烧杯中加入13ml去离子水和23ml质量分数为10%的双氧水，继续搅拌反应直至无气泡产生；继续向上述烧杯中加入23ml质量分数为8%的硫酸溶液和13ml质量分数5%的双氧水，搅拌反应47min后真空抽滤除去滤液得到滤饼，并用去离子水冲洗所得滤饼直至洗涤液为中性，将冲洗后的滤饼放入设定温度为65℃的烘箱中干燥22h，得到固态氧化石墨烯；将上述制备的固态氧化石墨烯置于超声分散机中，加入蒸馏水超声分散13min，使得到的氧化石墨烯悬浊液质量浓度为2mg/l，取11ml氧化石墨烯悬浊液，向其中加入1.1g氢氧化钠和0.9g氯乙酸超声分散1h，控制超声频率为31khz，得到羧基化氧化石墨烯胶体；将1g三羟甲基氨基甲烷加入至上述羧基化氧化石墨烯胶体中，超声分散33min，得到混合液，向混合液中继续加入2g1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和3g1，3-丙二胺，反应3h，得到石墨烯纳米片悬浮液；将质量分数为20%的丝素蛋白原液、酪蛋白按质量比为5:1混合得到包膜液，在二电极池反应池中将石墨烯纳米片悬浮液作为沉积液，以纳米线基体作为工作电极，铂片电极作为对电极，进行电泳沉积，得到骨架材料，再将包膜液作为新沉积液，对骨架材料进行电泳沉积，两次电泳沉积时控制沉积液的ph为7.85，沉积电压为1.1v，沉积时间为7min，得到钛基骨修复材料。
将钛片置于超声清洗机中，依次用无水乙醇和丙酮清洗15min，控制超声频率为35khz，将清洗后的钛片放入设定温度为80℃的烘箱中干燥5h后转移至装有15ml质量分数为40%的氢氧化钠溶液的高压反应釜中，加热升温至240℃，保温反应8h，得到纳米线基体；将0.3g石墨粉和0.13g硝酸钠加入到装有12ml质量分数为85%的浓硫酸溶液的烧杯中，将烧杯置于冰水浴中，搅拌反应45min，撤去冰水浴常温下搅拌反应2h，向烧杯中加入15ml去离子水和25ml质量分数为10%的双氧水，继续搅拌反应直至无气泡产生；继续向上述烧杯中加入25ml质量分数为8%的硫酸溶液和15ml质量分数5%的双氧水，搅拌反应50min后真空抽滤除去滤液得到滤饼，并用去离子水冲洗所得滤饼直至洗涤液为中性，将冲洗后的滤饼放入设定温度为70℃的烘箱中干燥24h，得到固态氧化石墨烯；将上述制备的固态氧化石墨烯置于超声分散机中，加入蒸馏水超声分散15min，使得到的氧化石墨烯悬浊液质量浓度为3mg/l，取12ml氧化石墨烯悬浊液，向其中加入1.2g氢氧化钠和1.0g氯乙酸超声分散2h，控制超声频率为33khz，得到羧基化氧化石墨烯胶体；将2g三羟甲基氨基甲烷加入至上述羧基化氧化石墨烯胶体中，超声分散35min，得到混合液，向混合液中继续加入3g1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4g1，3-丙二胺，反应4h，得到石墨烯纳米片悬浮液；将质量分数为20%的丝素蛋白原液、酪蛋白按质量比为5:1混合得到包膜液，在二电极池反应池中将石墨烯纳米片悬浮液作为沉积液，以纳米线基体作为工作电极，铂片电极作为对电极，进行电泳沉积，得到骨架材料，再将包膜液作为新沉积液，对骨架材料进行电泳沉积，两次电泳沉积时控制沉积液的ph为8.25，沉积电压为1.2v，沉积时间为10min，得到钛基骨修复材料。
对比例以上海市某公司生产的骨修复材料作为对比例
对本发明制得的钛基骨修复材料和对比例中的骨修复材料进行检测，检测结果如表1所示：
材料的表征
采用扫描电子显微电镜观察制备材料的宏观结构、沉积矿化以及细胞铺展。采用透射电子显微镜观察材料的介孔结构。采用氮气等温吸附-脱附测定材料的微孔结构，并通过bet计算材料的比表面积和孔容，根据公式计算平均孔径。采用激光共聚焦观察材料表面的细胞形貌和渗透。采用x-射线仪检测骨缺损处新骨生成情况。
力学性能测试将本发明制得的钛基骨修复材料和对比例中的骨修复材料制成10mm×10mm×10mm的矩形条样，然后在万能材料试验机上进行抗压测试，压缩速度为1mm/min。
孔隙率测试支架材料的孔隙率根据排水法测定。孔隙率p=（w2-w3+ws）/（w1-w3），其中ws为样品质量；w1为称量充满无水乙醇的比重瓶的质量；w2为将样品放入比重瓶中的总质量；w3为将样品取出后，比重瓶的质量。
体外细胞培养将鼠骨髓间充质干细胞（rbmscs）培养于含10%胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素的α-mem培养液中，于37℃、5%co2培养箱内传代培养。将支架高温灭菌后置于24孔细胞培养板中，rbmscs分别接种到材料表面，加入培养基。孵育至培养结束后使用mtt测定法检测细胞活性和细胞增殖，向每孔加入100μl的四甲基偶氮唑盐试剂，37℃继续孵育4h后，吸弃上清液，加入1mldmso，轻轻震荡20min，使结晶物溶解，使用连续光谱酶标仪在490nm处测定溶液的光吸收值。
表1性能测定结果
由表1数据可知，本发明制得的钛基骨修复材料，具有力学性能优良，能很好地满足骨修复部位的受力支撑需求，生物活性和生物相容性好，宏观级和微观级孔洞结构明显，有利于细胞的增殖和分化，且孔隙率高于65%，有利于人体骨细胞的黏附增殖，促进新骨的迅速形成，促使新骨组织长入孔隙，提高了材料的成骨活性，可加速骨修复速率，缩短治疗时间，具有很好的应用价值。