一种高通量数字PCR图像液滴的准确检测方法与流程

本发明涉及基因测序技术领域，尤其涉及一种高通量数字pcr图像液滴的准确检测方法。

背景技术：

高通量基因测序技术也被称为第二代基因测序技术，是近几年应用非常广泛的基因测序法。其与第一代基因测序技术相比有高通量，低成本等特点。高温聚合酶链式反应技术(polymerasechainreaction)简称pcr技术，可以快速扩增dna片段，在数个周期内实现dna片段的指数增长，是目前最常用的dna扩增技术。高通量pcr图像包含海量的待检测荧光液滴，具有数据量大，待测目标多，液滴间隔紧凑，时常发生重叠，图像质量不佳等不易于自动图像检测的特点。如何自动处理这些海量数据成为高通量测序技术的重要课题。

在实际高通量海量液滴数字pcr成像过程中，大面积荧光成像系统的像场范围内有可能各个点的荧光收集效率不同，造成整个像场范围内亮度不均匀，一般同样亮度的微滴在像场中心亮度要远大于在像场边缘，这种亮度不均匀现象随着像场的增加而变得愈发突出，直接导致采集的图像对比度不高、图像不清晰，微滴提取不准确。如何更有效的海量液滴图像处理、准确检测液滴是高通量海量液滴数字pcr系统的重要组成部分。

目前数字pcr技术主要使用绝对定量的荧光监测法检测液滴数量，使用数字图像处理技术的检测法还比较少。在国内的几篇探讨数字图像处理的论文中，对微反应/孔板数字pcr和大规模集成芯片数字pcr的讨论比较多。这两类数字pcr技术，液滴排列较为简单规整，近似为矩阵，容易预测液滴的位置。或是使用相对较简单的方法对海量液滴进行检测，条件要求高。

技术实现要素：

鉴于目前存在的上述不足，本发明提供一种高通量数字pcr图像液滴的准确检测方法，能够准确检测液滴数量并定位液滴位置。

为达到上述目的，本发明的实施例采用如下技术方案：

一种高通量数字pcr图像液滴的准确检测方法，所述高通量数字pcr图像液滴的准确检测方法包括以下步骤：

获取高通量pcr数字图像；

进行图像预处理得到高质量图像；

进行液滴定位；

计算获得液滴面积。

依照本发明的一个方面，所述进行图像预处理得到高质量图像的具体步骤包括：

利用文件读取方式，读入指定格式图像的灰度图像作为源图像；

对源图像进行自适应阈值化处理；

对源图像进行直接阈值化处理；

将自适应阈值化图像和直接阈值化图像做或操作，处理后的图像保存为合并图像；

对得到的合并图像进行开运算操作，处理后的图像保存为开运算图像，完成图像的预处理。

依照本发明的一个方面，所述对源图像进行自适应阈值化处理包括：

对源图像按n*n(n＞0)的滑动框对每一个像素点进行滑动操作；

求滑动框内所有像素点灰度值的平均值；

取平均值减去一个差值delta作为阈值化所取阈值；

对于滑动框中的每一个像素，若其灰度值高于阈值，将其灰度值置为最大灰度值，若小于等于阈值，将其灰度值置为0。

依照本发明的一个方面，所述对源图像进行直接阈值化处理包括：

对源图像中所有像素点进行遍历，求得所有像素点灰度值的平均值；

取平均值乘以一个系数作为阈值化阈值；

对图像中所有像素点，若其灰度值高于阈值，将其灰度值置为最大灰度值，若小于等于阈值，将其灰度值置为0。

依照本发明的一个方面，所述将自适应阈值化图像和直接阈值化图像做或操作，处理后的图像保存为合并图像包括：

新建一个空白的图像，其大小与源图像一致；

比较自适应阈值化和直接阈值化图像，若对于两幅图像中同样位置为(x,y)的一个点，两幅图像在该点的灰度值都为最大灰度值，则在新建的空白图像中，将对应坐标为(x,y)的像素点的灰度值置为最大灰度值；否则，将空白图像中该点的灰度值置为0。

依照本发明的一个方面，所述对得到的合并图像进行开运算操作，处理后的图像保存为开运算图像，完成图像的预处理包括：

对图像进行腐蚀操作；

对进行腐蚀操作后的图像进行膨胀操作。

依照本发明的一个方面，所述对图像进行腐蚀操作包括：

对图像按m*m(m＞0)的滑动框对每一个像素点进行滑动操作；

比较滑动框中所有像素点的灰度值，求得最小值；

将滑动框中所有像素点的灰度值置为所得最小值。

依照本发明的一个方面，所述对进行腐蚀操作后的图像进行膨胀操作包括：

对图像按k*k(k＞0)的滑动框对每一个像素点进行滑动操作；

比较滑动框中所有像素点的灰度值，求得最大值；

将滑动框中所有像素点的灰度值置为所得最大值。

依照本发明的一个方面，所述进行液滴定位的具体步骤包括：

对开运算图像进行canny边缘检测得到边缘检测图像；

对边缘检测图像进行轮廓检测，得到所有液滴的轮廓信息，确定液滴的位置，并绘制在源图像上。

依照本发明的一个方面，所述计算获得液滴面积包括：利用轮廓面积计算函数对所得的液滴轮廓信息中的每个液滴轮廓进行计算，得到所有液滴面积。

本发明实施的优点：

1.这是一种无损的、非接触式的检测。

2.测量、反应速度快；所见即所得的测量方式。

3.测量范围广，测量对象多；可以对整体的复杂状态直接测量和计算，一张照片可以保存非常大的数据量。

4.可以随时摄取图像，在线采集、查询、处理。

5.可以调焦，随时在整体和局部间调节。

6.设备简单，需要的仅是一套照相设备，模数转化模块，以及数据处理模块，程序可以复制到这些设备中。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为步骤s21源图像待处理灰度图像；

图2为步骤s22自适应阈值化图像；

图3为步骤s23直接阈值化图像；

图4为步骤s24合并图像；

图5为步骤s25开运算图像；

图6为步骤s31边缘检测图像；

图7为步骤s32绘制图像；

图8本本发明所述的高通量数字pcr图像液滴准确检测方法示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如图1、图2、图3、图4、图5、图6、图7和图8所示，一种高通量数字pcr图像液滴准确检测方法,包括：

s1、数字图像的获取：利用ccd等感光元件获得目标区域的数字图像；

s2、图像预处理：利用直方图均衡、阈值化等图像处理方法提高图像质量；

s3、液滴定位：确定各液滴在图像中的位置,剔除误检测液滴；

s4、液滴面积计算：利用数字图像处理方法计算得到各个液滴的面积。

所述步骤s2包括：

s21、利用文件读取方式，读入指定格式图像的灰度图像，此图像称为源图像,源图像如图1所示；

s22、对s21所述源图像进行自适应阈值化处理，所述步骤s22包括：

s221、对图像按n*n的滑动框对每一个像素点进行滑动操作，n的取值比如为9；

s222、求滑动框内所有像素点灰度值的平均值；

s223、取平均值减去一个差值delta作为阈值化所取阈值；

s224、对于滑动框中的每一个像素，若其灰度值高于阈值，将其灰度值置为最大灰度值，若小于等于阈值，将其灰度值置为0；

自适应阈值化处理后的图像如图2所示；

s23、对s21所述源图像进行直接阈值化处理，所述步骤s23包括：

s231、对图像中所有像素点进行遍历，求得所有像素点灰度值的平均值；

s232、取平均值乘以一个系数作为阈值化阈值，系数的取值比如为0.75；

s233、对图像中所有像素点，若其灰度值高于阈值，将其灰度值置为最大灰度值，若小于等于阈值，将其灰度值置为0；

直接阈值化处理后的图像如图3所示；

s24、将s22所述自适应阈值化图像和s23所述直接阈值化图像做或操作，所属步骤s24包括：

s241、新建一个空白的图像，其大小与源图像一致；

s242、比较自适应阈值化和直接阈值化图像，若对于两幅图像中同样位置为(x,y)的一个点，两幅图像在该点的灰度值都为最大灰度值，则在新建的空白图像中，将对应坐标为(x,y)的像素点的灰度值置为最大灰度值。否则，将空白图像中该点的灰度值置为0；

合并后图像如图4所示；

s25、对s24中得到的合并图像进行开运算操作，所述步骤s25包括：

s251、对图像进行腐蚀操作，所述步骤s251包括：

s2511、对图像按n*n的滑动框对每一个像素点进行滑动操作，n的取值比如为15；

s2512、比较滑动框中所有像素点的灰度值，求得最小值；

s2513、将滑动框中所有像素点的灰度值置为所得最小值；

s252、对进行腐蚀操作后的图像进行膨胀操作，所属步骤s252包括：

s2511、对图像按n*n的滑动框对每一个像素点进行滑动操作，n的取值比如为15；

s2512、比较滑动框中所有像素点的灰度值，求得最大值；

s2513、将滑动框中所有像素点的灰度值置为所得最大值；

开运算操作得到的图像如图5所示；

s31、对s25所述开运算图像进行canny边缘检测；

所得图像如图6所示；

s32、对s31所述边缘检测图像进行轮廓检测，得到所有液滴的轮廓信息，确定液滴的位置，并绘制在源图像上；

所得的图像如图7所示；

利用轮廓面积计算函数对s32所得的液滴轮廓信息中的每个液滴轮廓进行计算，得到所有液滴面积，将结果存储在本地文件中。

本发明实施的优点：

1.这是一种无损的、非接触式的检测。

2.测量、反应速度快；所见即所得的测量方式。

3.测量范围广，测量对象多；可以对整体的复杂状态直接测量和计算，一张照片可以保存非常大的数据量。

4.可以随时摄取图像，在线采集、查询、处理。

5.可以调焦，随时在整体和局部间调节。

6.设备简单，需要的仅是一套照相设备，模数转化模块，以及数据处理模块，程序可以复制到这些设备中。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本发明公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。