大蒜素及其衍生物在制备防治他汀药物引起的肾损伤的药物中的应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及大蒜素及其衍生物在制备防治他汀药物引起的肾损伤的药物中的应用。

背景技术：

他汀类药物（如辛伐他汀），即3-羟基-3甲基戊二酰辅酶a（hmg-coa）还原酶抑制药，是目前最有效的降脂调脂药物。临床上主要用于降低胆固醇尤其是低密度脂蛋白-胆固醇(ldl-c)，治疗动脉粥样硬化，现已成为冠心病预防和治疗的最有效药物。近年来，研究发现他汀类药物具有多方面非降脂作用，其中包括抑制动脉粥样硬化与血栓形成，还具有缓解器官移植后的排异反应、治疗骨质疏松症、抗肿瘤、抗老年痴呆等多种作用，以及适于高胆固醇血症和以胆固醇升高为主的混合型高脂血症。防治冠心病、心肌梗死、脑卒中，延缓动脉粥样硬化。

但是，他汀类药物引起的肾细胞损伤在临床上较为常见，用药及用药量不当可能会导致严重的肾损伤、肾衰竭，甚至是致死。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有肾损伤防治技术的不足，提供了一种新的防治他汀类药物引起肾损伤的药物选择，即大蒜素及其衍生物在防治他汀药物引起的肾损伤中的应用。

本发明的目的是提供大蒜素及其衍生物在制备防治他汀药物引起的肾损伤的药物中的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明以肾小管上皮细胞nrk-52e为代表作为实验对象，研究证明了大蒜素能够抑制辛伐他汀对肾小管上皮细胞的毒性。因此，以下应用均应在本发明的保护范围之内：

大蒜素及其衍生物在制备防治他汀药物引起的肾损伤的药物中的应用。

大蒜素及其衍生物在制备能够抑制辛伐他汀对肾小管上皮细胞毒性的药物中的应用。

具体地，所述肾损伤是指肾细胞损伤。

优选地，所述肾细胞为肾小管上皮细胞。

优选地，所述大蒜素为大蒜新素、大蒜辣素或其代谢产物。

大蒜新素（二烯丙基三硫醚，dats）；cas:2050-87-5，结构式如下所示。大蒜辣素（二烯丙基二硫醚，dads），（ch2=ch-ch2-s(o)-s-ch2-ch=ch2）；cas号：539-86-6，结构式如下所示。烯丙基二甲基砜（allylmethylsulfone，cas号16215-14-8）和烯丙基二甲基亚砜（allylmethylsulfoxide）的结构式如下所示：

烯丙基二甲基砜烯丙基二甲基亚砜

优选地，所述大蒜素的衍生物包括以大蒜素或其代谢产物（包括二烯丙基二硫醚和二烯丙基三硫醚、烯丙基二甲基砜和烯丙基二甲基亚砜）为母核的化合物、类似物或其药物可接受的盐。

更优选地，所述大蒜素的衍生物的结构如式（i）、式（ii）或式（ⅲ）所示：

其中：r为与s的生物电子等排体；r1与r2相同或不同，分别为h、取代或未取代的低级烷基或其它生物电子等排体（oh,f,cl,br,nh2等）；r3与r4相同或不同，分别为h、取代或未取代的低级烷基、双键o或其生物电子等排体。

优选地，上述大蒜素的代谢产物为烯丙基二甲基砜或烯丙基二甲基亚砜。

大蒜素（allicin）是天然存在于葱科葱属植物大蒜大蒜的鳞茎、洋葱和其他葱科植物中提取的硫代烯丙醚类化合物，为淡黄色粉末或淡黄色油状液体，一般有较浓的气味。它是一种广谱抗菌药，具有消炎、降血压、降血脂等多种生物学功能。在本发明之前，大蒜素在防治他汀类药物引起肾损伤方面还未见有报道，本发明首次研究并公开了大蒜素在防治他汀类药物引起肾损伤方面的应用前景。

由于大蒜素性质不稳定，常温下极易挥发，可进一步分解生成性质稳定的二烯丙基二硫化物(dads)，后者在体内可进一步代谢为烯丙基二甲基砜和烯丙基二甲基亚砜。因此在本发明的方案中，大蒜素及其衍生物可以以一种药学可接受的盐或药物复合物的形式对病人给药。某个复合物需与适当载体或赋形剂混合形成药物组合物从而保证达到有效治疗。所用剂型包括固体剂型、半固体剂型、液体制剂和气雾制剂。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次研究发现大蒜素及其衍生物具有抑制他汀类药物引起的肾细胞损伤的作用。提供了大蒜素及其衍生物的一种新用途，即其在防治他汀类药物引起的肾损伤中的应用，也为他汀类药物引起肾损伤的治疗提供了新的选择方案，提供了一种从天然大蒜等食品中提取的二烯丙基硫醚及其衍生物，为以大蒜为基础的他汀类药物引起肾损伤的食疗提供了研究基础，具有很好的应用前景。

附图说明

图1是说明不同浓度的辛伐他汀对肾小管上皮细胞活力变化的影响及大蒜素dats对于辛伐他汀引起的肾小管上皮细胞损伤具有一定的保护作用。*表示线条所指示的组之间比较，p<0.05。

图2是说明不同浓度的甘珀酸对肾小管上皮细胞活力变化的影响及大蒜素dats和dads对于高浓度甘珀酸引起的肾小管上皮细胞损伤具有一定的保护作用。*表示线条所指示的组之间比较，p<0.05。

图3是说明不同浓度的草酸钠（草酸钙）对肾小管上皮细胞活力变化的影响及dats对于草酸钠（草酸钙）晶体引起的肾小管上皮细胞损伤具有一定的保护作用。*表示线条所指示的组之间比较，p<0.05。

图4说明不同浓度的多西他赛对肾小管上皮细胞活力变化的影响及3、10、30μm的dats对于多西他赛引起的大鼠肾小管上皮细胞损伤无抑制作用。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

实施例1大蒜素及其衍生物对于辛伐他汀引起的肾小管上皮细胞损伤中具有一定的保护作用

一、材料与方法

1、主要试剂

dulbecco’smodifiedeagle’smedium干粉(dmem，低糖)、胎牛血清(fbs)、胰酶(typsin)、二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，dmso)、tris均购自sigma-aldrich(st.louis，mo，usa)；辛伐他汀、甘珀酸（cbx）、大蒜辣素（diallyldisulfide,dads）从sigma-aldrich(st.louis，mo，usa)购买。多西他赛购自selleck公司。大蒜新素（diallyltrisulfide,dats）购自广东省药品检定所。其它常用的实验室试剂均为国产分析纯级。

2、细胞培养

在37℃、5%co2及湿度饱和的条件下，我们用含10%胎牛血清的dmem（低糖）培养基来培养大鼠肾小管上皮nrk-52e细胞和人肾小管上皮细胞hk-2。细胞培养在培养皿中进行，约2-3天用pbs清洗1-2次后再更换培养液。

3、实验用到的主要仪器及设备

二氧化碳培养箱（hepacclass100，thermo）；

超净工作台（thermo）；

水浴箱（shelllab）；

电子天平（ab204-s，mettlertoledo）；

ph计（inlab413，mettlertoledo）；

除热源型超纯水仪（purelgaclassisuf，elga）；

nucleicacidandproteinanalyzer(du640，beckmancoulter)；

bioimagingsystem(genegenius)；

倒置显微镜（lw200-27xb，上海光电）；

荧光显微镜(ix51，olympus)；

低温冰箱（thermo-fisher）；

bio-rad蛋白电泳系统；

96孔发光检测仪(promegaglomax™)；

超速离心机(beckmanl-100xp)

4、mtt或mts法检测细胞活力：

首先将细胞按一定密度（约3000-5000个每孔）接种到96孔板中，待24小时细胞贴壁后，换液加入要测定的不同浓度的药物处理24小时。将培养基吸弃后加入配好的每孔含15µlmtt或mts的培养基，经过4小时(mts的时间2-4h)的反应后，用酶标仪(bio-tekinstruments)在490nm波长时测定其吸光度。通过扣除对应空白组的吸光度之后，与对照组吸光度的比值并换算成百分率来表示细胞的存活率。

5、统计学方法

所有实验至少重复三次。实验数据以spss16.0软件统计分析，2组的组间比较采用studenttest比较，3组以上的组间比较采用单因素方差分析，lsd法（方差齐时）或dunnett’st3法（方差不齐时）行组间两两比较，以p<0.05为显著性差异；*表示与相应的组比较，p<0.05。图中柱状图的结果以均值和标准误表示。

二、实验结果

结果显示，1、3、10、30μm的大蒜新素（dats）不会引起nrk-52e细胞的毒性；辛伐他汀2μm和10μm会引起nrk-52e细胞的毒性，但10、30μm大蒜新素（dats）可抑制其毒性，见图1。

实施例2大蒜素及其衍生物对于甘珀酸引起的肾细胞损伤具有抑制作用

1、实验方法

实验材料同例1。细胞培养、mtt的实验测定方法及其它试剂盒统计学方法同例1；在细胞接种到96孔板中24小时后，设定不同的药物组别，换液加入要测定的不同浓度的药物处理24小时。在甘珀酸引起的损伤实验中，将大蒜素（dats、dads）和甘珀酸同时加入到细胞中处理24h;24h后加入相应的mtt后测定各组的吸光度，并通过设定相应空白对照组后计算存活率。

所有实验至少重复三次。实验数据以spss16.0软件统计分析，2组的组间比较采用studenttest比较，3组以上的组间比较采用单因素方差分析，lsd法（方差齐时）或dunnett’st3法（方差不齐时）行组间两两比较，以p<0.05为显著性差异；*表示与相应的组比较，p<0.05。图中柱状图的结果以均值和标准误表示。

2、实验结果

结果显示，50μm的甘珀酸(cbx)可引起nrk-52e细胞的毒性，而大蒜新素(dats)可抑制其毒性；见图2。3、10、30μm的大蒜辣素（dads）不会引起nrk-52e和hk-2细胞的毒性，30μm的甘珀酸(cbx)可引起nrk-52e细胞的毒性，而大蒜辣素（dads）可抑制甘珀酸(cbx)可引起的细胞毒性；见图2。

实施例3大蒜素及其衍生物对于草酸钠引起的肾细胞损伤具有抑制作用

一、实验方法

细胞培养、mtt或mts的实验测定方法及其它试剂盒统计学方法同例1；在细胞接种到96孔板中24小时后，设定不同的药物组别，换液加入要测定的不同浓度的药物处理24小时。在草酸钠引起的损伤实验中，将大蒜素（dats）预先加入到细胞中处理，3h后，再往细胞中加入不同浓度的草酸钠（草酸钠与培养基中的钙结合后形成草酸钙晶体）；24h后加入相应的mts测定各组的吸光度，并通过设定相应的空白对照孔（因考虑到草酸钙晶体及药物可能会影响吸光度的值，故也设定了对应的草酸钙晶体和药物空白对照孔）后，减去对应的空白吸光度后计算nrk-52e细胞的存活率。

所有实验至少重复三次。实验数据以spss16.0软件统计分析，2组的组间比较采用studenttest比较，3组以上的组间比较采用单因素方差分析，lsd法（方差齐时）或dunnett’st3法（方差不齐时）行组间两两比较，以p<0.05为显著性差异；*表示与相应的组比较，p<0.05。图中柱状图的结果以均值和标准误表示。

二、实验结果

结果显示，草酸钠加入到细胞后，可见晶体形成并沉淀在细胞表面；0.5、1、2mm的草酸钠可引起nrk-52e细胞的毒性；而dats可抑制草酸钠引起的细胞毒性，3、10、30μm的dats对2mm草酸钠引起的损伤具有保护作用；见图3。

实施例4大蒜素及其衍生物对于多西他赛引起的肾细胞损伤无抑制作用

一、实验方法

细胞培养、mtt或mts的实验测定方法及其它试剂盒统计学方法同例1；在细胞接种到96孔板中24小时后，设定不同的药物组别，换液加入要测定的不同浓度的药物处理24小时。在多西他赛（docetaxel）引起的损伤实验中，将大蒜素（dats）预先加入到细胞中处理，3h后，再往细胞中加入一定浓度的多西他赛（0.3μm、1μm、3μm）；24h后加入相应的mtt测定各组的吸光度，并通过设定相应的空白对照孔后，减去对应的对照孔的吸光度后计算nrk-52e细胞的存活率。

所有实验至少重复三次。实验数据以spss16.0软件统计分析，2组的组间比较采用studenttest比较，3组以上的组间比较采用单因素方差分析，lsd法（方差齐时）或dunnett’st3法（方差不齐时）行组间两两比较，以p<0.05为显著性差异；*表示与对照组比较，p<0.05。图中柱状图的结果以均值和标准误表示。

二、实验结果

结果显示，多西他赛（0.3μm、1μm、3μm）加入到细胞24h后，可见细胞的存活率显著下降；而3、10、30μm的dats对多西他赛引起的大鼠肾小管上皮细胞nrk-52e的损伤无保护作用；见图4。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。