本发明涉及山奈酚-3-o-芸香糖苷在制备pcsk9抑制剂中的应用，可用于治疗pcsk9介导的疾病。
背景技术：
以低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)升高为主的血脂代谢紊乱是导致心血管疾病的危险因素之一。目前临床的首选降脂药物为他汀类药物。然而，临床长期服用他汀类药物易引起肝脏毒性及肌痛等副作用[1]。并且超过50％的冠心病患者在使用强化他汀治疗后，ldl-c仍未能达到相关指南推荐的目标值，对降低冠心病的发病率、病死率的效果亦不显著[2]。为弥补他汀类药物应用的局限性并解决临床需要，新型调脂药物的研究将成为医药开发的一个新目标。
前蛋白转化酶枯草溶菌素9(pcsk9)，又称为神经细胞凋亡调节转化酶-1，属于前蛋白转化酶家族(pc)蛋白酶k亚家族，是一个脂质代谢的调节蛋白。现代研究证明pcsk9通过结合于低密度脂蛋白受体(ldlr)的表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，egf)样结构域，与ldlr共同内化，进而抑制ldlr的释放与返回细胞膜，诱导ldlr进入溶酶体降解途径，因此pcsk9对ldl-c的代谢发挥着重要作用[3]。携带pcsk9缺失功能突变的人群血浆中ldl-c较普通人降低15％-40％，并且其15年心血管疾病发生率下降88％[4,5]。另外，虽然他汀类药物是目前临床治疗高血脂症的首选药物，但是相当一部分高血脂症患者在服用他汀类降脂药物时会产生他汀不耐受现象，并且他汀类药物会增加pcsk9的转录及表达，从而减弱了他汀类药物的降血脂作用[6]。因此，pcsk9抑制剂可用于治疗高血脂症，特别是对他汀不耐受的高脂血症患者亦具有良好治疗作用。
目前上市及在研的pcsk9抑制剂主要包括单克隆抗体类[7,8]、小干扰rna(sirna)类[9]、反义寡核苷酸类[10]和小分子类[11]。目前全球已上市的pcsk9抑制剂均为单抗类，分别为2015年7-8月依次上市的alirocumab和evolocumab，对高胆固醇血症患者有良好的疗效，同时可显著降低对他汀类药物不耐受的高胆固醇血症患者的ldl-c水平。但pcsk9单抗类药物均为注射剂，临床常表现出不良反应如注射部位肿胀、疼痛及过敏等，使用顺应性差。单抗类药物研发成本高，价格昂贵，例如alirocumab及evolocumab分别需14300美元/年及14523美元/年的高额治疗费用，长期应用使患者不堪重负。近年来，人们逐渐着眼于开发小分子pcsk9抑制剂，以克服患者对pcsk9单抗类注射剂顺应性差及价格昂贵的弊端。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种通过特异性作用于pcsk9靶点，治疗高血脂症的药物，该药物可用于他汀类药物不耐受和他汀类耐受的高胆固醇血症治疗。
山奈酚-3-o-芸香糖苷在制备治疗pcsk9介导的疾病药物中的应用。
山奈酚-3-o-芸香糖苷作为pcsk9抑制剂在制备降血脂药物中的应用。
有益效果
山奈酚-3-o-芸香糖苷降脂领域；山奈酚-3-o-芸香糖苷在制备pcsk9靶点抑制药物中的应用；首次发现山奈酚-3-o-芸香糖苷具有特异性的抑制pcsk9与ldlr结合的活性，可亲和结合于pcsk9晶体结构的活性口袋区域，并与多个氨基酸残基形成稳定的氢键，是一种新型的小分子pcsk9的抑制剂。山奈酚-3-o-芸香糖苷可降低高脂血症模型小鼠血浆中tc、tg和ldl-c水平，升高hdl-c水平，具有改善高脂血症的脂质代谢紊乱的作用，可用于预防或治疗心血管疾病(包括治疗高脂血症)。
附图说明
图1为his-pcsk9蛋白表达纯化的sds-page图，其中
a.his-pcsk9蛋白表达的sds-page图(m.marker；1.bl21-his-pcsk9；2.空白菌株)
b.his-pcsk9蛋白纯化洗脱sds-page电泳图(m.marker；1.洗柱流出液；2.50mm咪唑洗脱液；3.250mm咪唑洗脱液)
图2gst-egf-a蛋白表达纯化的sds-page图,(m：marker；1.空白菌株；2.bl21-gst-egf-a；3.洗柱流出液；4.洗脱液)
图3山奈酚-3-o-芸香糖苷对pcsk9致ldlr降解的抑制作用:his-pcsk9与药液共孵育30min，加入hepg2细胞中，检测24h后ldlr蛋白水平的变化。(n＝3,#p＜0.05,##p＜0.01,comparedwithcontrolgroup；*p＜0.05,**p＜0.01,comparedwithpcsk9group)
图4山奈酚-3-o-芸香糖苷竞争抑制gst-egf-a与pcsk9的结合；其中a.gst-egf-a与his-pcsk9竞争抑制实验原理图；b.阳性抑制剂sbc-115076竞争抑制结果；c.山奈酚-3-o-芸香糖苷竞争抑制结果；sbc-115076及山奈酚-3-o-芸香糖苷均可显著降低gst/his比值，且呈剂量依赖性，具有抑制gst-egf-a与pcsk9磁珠结合的能力。(n＝3,*p＜0.05,**p＜0.01,comparedwithcontrolgroup)
图5山奈酚-3-o-芸香糖苷与pcsk9分子对接结果。
具体实施方式
山奈酚-3-o-芸香糖购自成都瑞芬思生物科技有限公司。
实施例1、山奈酚-3-o-芸香糖苷对高脂小鼠tg、tc、hdl-c及ldl-c的影响
1.实验动物
健康雌性icr小鼠，清洁级，体重为18-22g，由扬州大学动物中心提供。实验动物饲养于12h-12h昼夜交替的独立环境中，室温维持在24±2℃，自由饮水和摄食，在适应环境1周后进行实验。对动物的所有处理均遵循国际疼痛研究协会伦理委员会的要求。
2.实验材料
山奈酚-3-o-芸香糖苷(成都瑞芬思生物科技有限公司)。基础饲料与高脂饲料(含3％胆固醇)。甘油三酯(tg)测试盒、总胆固醇(tc)测试盒、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)和高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)测试盒，购自南京建成生物工程研究所。
3.动物分组及指标检测
小鼠随机均分为5组，分别为空白对照组、高脂模型组、低剂量给药组(20mg/kg)、中剂量给药组(30mg/kg)及高剂量给药组(40mg/kg)。除空白对照组喂养基础饲料，其他组均喂养高脂饲料。高脂模型组、低剂量给药组、中剂量给药组及高剂量给药组在进入正试前，连续喂食高脂饲料30天进行建模，然后按试验设计连续给药28天。试验结束后，小鼠摘眼球取血，3500rpm离心10min后，得血清。相关试剂盒检测血清中tc、tg、ldl-c及hdl-c含量。大鼠肝指数的测定，按肝指数(％)＝肝脏湿重/大鼠体重×100％，计算各组大鼠肝指数。4.实验结果
如表1所示，与空白对照组比较，高脂模型组血清tc、tg和ldl-c水平均显著升高(p<0.05)，hdl-c水平显著下降(p<0.05)。与高脂模型组比较，山奈酚-3-o-芸香糖苷给药组tc、tg和ldl-c水平均显著下降(p<0.05)，hdl-c水平均显著升高(p<0.05)，且呈剂量依赖性。
如表2所示，与空白对照组比较，高脂模型组的肝指数显著升高(p<0.05)。与高脂模型组比较，山奈酚-3-o-芸香糖苷给药组的肝指数显著下降(p<0.05)，且呈剂量依赖性。
表1山奈酚-3-o-芸香糖苷对高脂模型小鼠血清tg、tc、hdl-c及ldl-c的影响
mmol/ml
(n＝6,#p＜0.05,##p＜0.01,comparedwithcontrolgroup；*p＜0.05,**p＜0.01,comparedwithmodelgroup)
表2山奈酚-3-o-芸香糖苷对小鼠肝指数的影响
(n＝6,#p＜0.05,##p＜0.01,comparedwithcontrolgroup；*p＜0.05,**p＜0.01,comparedwithmodelgroup)
实施例2、pcsk9及egf-a蛋白的表达纯化
pcsk9主要与ldlr的egf-a结构域结合，进而导致ldlr的降解，降低细胞吸收ldl的能力，发挥其调控脂质代谢的活性。为方便纯化及后续检测，分别进行pcsk9及egf-a蛋白的表达纯化。在pcsk9的n端加入his标签，egf-a的n端加入gst标签。his-pcsk9[12]及gst-egf-a[13]蛋白的的表达及纯化参照文献进行。his-pcsk9粗菌液由ni柱吸附，咪唑依次洗脱，即得his-pcsk9蛋白(图1)。gst-egf-a粗菌液由gst吸附柱捕集，谷胱甘肽洗脱，即得gst-egf-a蛋白(图2)。
实施例3、山奈酚-3-o-芸香糖苷抑制pcsk9的机制研究
3.1pcsk9诱导ldlr降解细胞模型及化合物干预
3.1.1实验材料
山奈酚-3-o-芸香糖苷(成都瑞芬思生物科技有限公司)。tris、temed、β-mercaptoethanol、甘氨酸、吐温-20、sds、30％acrylamide/bis、ammoniumpersulfate、gapdh购自sigma；marker购自thermo；溴酚蓝、甘油、bovineserumalbumin购于sunshine；甲醇、氯化钠、丙三醇购于南京化学试剂有限公司；ldlr抗体、anti-rabbit购于cellsignaling；ripa裂解液购自beyotimebiotechnology；ecl发光液购自pierce。
hepg2人肝癌细胞购自美国atcc公司。
3.1.2实验分组
取对数生长期hepg2人肝癌细胞，消化后，用含10％fbs的dmem培养基重悬，以密度为2×105个细胞/ml接种于6孔板，每孔加入2ml含10％fbs的dmem培养基，置37℃、5％co2培养箱中正常培养，待细胞进入对数生长期，按照下述方法进行分组实验。
(1)空白对照组(control)：采用含10％fbs的dmem培养基于37℃、5％co2培养箱中正常培养。
(2)模型组(pcsk9)：将适量纯化后his-pcsk9蛋白(终浓度15μm)加入含10％fbs的dmem培养基中，室温孵育30min。hepg2细胞弃去上清，加入上述pcsk9溶液，放入恒温培养箱培养24h。
(3)给药组：将待测化合物(终浓度为1.5μm)加入含10％fbs的dmem培养基中，室温孵育30min。hepg2细胞弃去上清，加入上述孵育液，放入恒温培养箱培养24h。
(4)模型+给药组：将不同浓度的待测化合物(终浓度分别为0.5μm、1.5μm及5.0μm)与适量his-pcsk9(终浓度15μm)加入含10％fbs的dmem培养基中，室温孵育30min。hepg2细胞弃去上清，加入上述孵育液，放入恒温培养箱培养24h。
3.1.3实验方法
免疫印迹(westernblotting)：hepg2细胞给药孵育24h后，取出置于冰上以冷pbs轻轻荡洗2次，加入适量冷pbs以细胞刮子刮下细胞，按一定比例加入中等强度ripa裂解液，冰浴孵育30min，4℃12000rpm离心15min，吸取上清，加入5×loadingbuffer涡旋后100℃金属浴5min，取20μg蛋白样品上样于8％sds-page进行凝胶电泳，4℃110v电转。一定时间后取出，5％bsa-tbs封闭2小时，分别加入一抗(1:2000)室温孵育3h，4℃过夜，tbst洗10min×3，加入二抗，室温下孵育3h，tbst洗10min×3，加入ecl发光底物显色。用分子显影仪(geldoctmxr，170-8170)联合quantityone-4.6.5(bio-radlaboratories)软件分析数据。用目的蛋白灰度值与胞浆蛋白内参gapdh灰度值之比进行半定量分析。
3.1.4实验结果
如图3所示，山奈酚-3-o-芸香糖苷可剂量依赖性地抑制pcsk9诱导降解ldlr的作用，说明山奈酚-3-o-芸香糖苷具有抑制pcsk9与ldlr结合的能力。
3.2山奈酚-3-o-芸香糖苷对pcsk9与ldlr活性结构域egf-a结合的影响
3.2.1实验材料
sbc-115076(selleck)；山奈酚-3-o-芸香糖苷(成都瑞芬思生物科技有限公司)。ni磁性琼脂糖微球(英芮诚生化科技有限公司)；his-pcsk9及gst-egf-a蛋白为本实验室表达纯化。
tris、temed、β-mercaptoethanol、甘氨酸、吐温-20、sds、30％acrylamide/bis、ammoniumpersulfate、gapdh购自sigma；marker购自thermo；溴酚蓝、甘油、bovineserumalbumin购于sunshine；甲醇、氯化钠、丙三醇购于南京化学试剂有限公司；his-tag抗体、gst-tag抗体购自上海翊圣生物科技有限公司；anti-mouse购于cellsignaling；ripa裂解液购自beyotimebiotechnology；ecl发光液购自pierce。
3.2.2实验方法
pcsk9主要与ldlr的egf-a结构域结合，进而导致ldlr的降解，降低细胞吸收ldl的能力。基于pcsk9与ldlr在体内的结合过程，pcsk9磁珠在体外亦可特异性结合gst-egf-a，基于pcsk9及egf-a蛋白标签的差异，可通过his标签及gst标签对上述蛋白进行半定量，并通过比值差异初步评价其结合作用的大小，原理如图4a所示。gst-egf-a与pcsk9磁珠在一定条件下可充分结合，但当pcsk9抑制剂存在时，his-pcsk9与gst-egf-a的结合将被竞争性的减弱或阻断，致使偶联于磁珠上的gst-egf-a含量降低，表现为相应gst/his比值变小。因此当pcsk9磁珠与gst-egf-a体系中加入待测化合物后，可以通过比较洗脱液中gst/his比值的变化来评价其抑制pcsk9-ldlr结合的能力。
his-pcsk9与ni磁珠室温旋转孵育60min，得到pcsk9磁珠。pcsk9磁珠与药液旋转孵育2h，pbs清洗2次后，加入过量gst-egf-a旋转孵育1h，pbs清洗2次后，200μlelutionbuffer(400mm咪唑)洗脱，检测洗脱液中gst/his比值的变化。
3.2.3实验结果
以阳性药物sbc-115076为例，按上述方法进行抑制活性检测。结果如图4b所示，sbc-115076组gst/his值显著降低，且呈剂量依赖性，显示sbc-115076可以抑制gst-egf-a与pcsk9磁珠的结合，说明了此方法的可行性。如图4c所示，山奈酚-3-o-芸香糖苷组可降低体系gst/his比值，显著抑制gst-egf-a与pcsk9磁珠的结合，且呈剂量依赖性。
3.3山奈酚-3-o-芸香糖苷与pcsk9晶体的分子对接
3.3.1实验材料
chemdraw(美国cambridgesoft公司)；molecularoperatingenvironment(moe，chemicalcomputinggroup)
3.3.2实验方法
分子对接前分别进行protonate，tetherandminimize及deleteunboundwaters操作，并通过molecularoperatingenvironment(moe)软件的docking模块，将前期得到的pcsk9亲和成分与pcsk9晶体结构(pdbcode:3gcx)进行分子对接，探讨化合物与pcsk9蛋白的主要位点及亲和力参数等。
3.3.3实验结果
山奈酚-3-o-芸香糖苷与pcsk9进行分子对接，结果如图5所示，山奈酚-3-o-芸香糖苷可与pcsk9结合，与374位天冬氨酸(asp374)，379位苯丙氨酸(phe379)，372位丝氨酸(ser372)等多个氨基酸残基形成稳定的氢键，进一步比较其与pcsk9亲和力的大小，发现山奈酚-3-o-芸香糖苷有较高的亲和力，mm/gbvivalue为-13.273kcal/mol，pki5.07。
综上，山奈酚-3-o-芸香糖苷能较特异性的抑制pcsk9靶点，从而改善脂质代谢紊乱。
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