一种用于膀胱灌注靶向膀胱癌递送药理活性物质的高分子凝胶及其制备方法与流程

本发明涉及一种用于靶向膀胱癌的递送药理活性物质的高分子凝胶以及制备方法，还涉及一种在所述的高分子凝胶中加入了药理活性物质制备得到的高分子复合凝胶药物制剂。本发明属于医药技术领域。

背景技术

膀胱灌注药物治疗是目前非肌层浸润膀胱癌术后常规的辅助治疗手段，其目的是杀灭手术过程中释放的肿瘤细胞以及微小残余灶。但目前膀胱灌注的药物剂型为单纯药物水溶液，在进行膀胱灌注时药物不能有效富集于肿瘤组织，同时药物持续时间短(两小时以内)，因此药物的疗效不能最大发挥。仍然存活的肿瘤细胞能够再次种植于膀胱壁，同时残余的癌组织也不能被完全杀灭，这导致了即使进行了规范的灌注治疗，膀胱癌的5年复发率仍然高达44.8％[sylvester,etal.europeanurology,2016,69(2):231:244]。

为了延长药物作用时间，增加药物对组织的穿透性，有效的方法之一是将药物溶解在凝胶载体中，使凝胶贴附在膀胱组织表面进行持续给药，达到延长药物作用时间、增加药物穿透的目的，进而更好的杀伤肿瘤组织。目前已有相关文献对此进行了报道。guhasarkar报道了采用离子激发凝胶为载体，包裹化疗药物紫杉醇对膀胱进行灌注治疗，提高了治疗效果[guhasarkar,etal.journalofcontrolledrelease,2017]。但目前的凝胶载体不能有效的区分肿瘤组织与正常膀胱粘膜，而广泛且长时间的贴附于膀胱粘膜会增加药物对正常组织的刺激，引起严重的膀胱刺激症状。

胶原作为细胞外基质的重要组成成分，含有丰富的氨基。肿瘤组织因其外生性生长的特点，相比正常尿路上皮表面具有更多的胶原。有文献报道，醛基与胶原组织的氨基可以通过席夫碱紧密结合[oliva,etal.sciencetranslationalmedicine,2015,7(272):272ra11]。因此能够特异性粘附氨基的药物递送系统可以将胶原作为潜在的肿瘤靶点，用于区分肿瘤组织与正常组织，进而达到靶向递送药物的目的。

此外，热疗对于灌注化疗具有明显的促进作用，目前临床上应用synergosb-ts101系统对患者进行热灌注化疗，强化药物对膀胱灌注的治疗作用[lammers,etal.europeanurology,2011,60(1):81-93.]。但是目前的加热系统体积庞大，设备费用昂贵。同时患者在进行热灌注时需要特定的手术空间与医护人员的监护测，医疗资源需求大，不能有效的进行推广。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种用于膀胱灌注靶向膀胱癌递送药理活性物质的高分子凝胶及其制备方法，以达到对于游离肿瘤细胞进行早期隔离；对于肿瘤残余灶能够靶向贴附，延长药物作用时间，加强药物穿透的目的。通过针对以上两种膀胱癌复发的原因，彻底杀灭肿瘤组织，解决膀胱灌注药物疗效不能最大发挥的问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的一种用于膀胱灌注靶向膀胱癌递送药理活性物质的高分子凝胶，其是通过以下步骤制备得到：

1)将树状大分子pamam用去离子水配制成质量百分比浓度为10％的pamam溶液；

2)将cooh-peg-oh加入到步骤1)获得的10％pamam溶液中，混合均匀；

3)将质量百分比浓度为5％的醛基化多聚糖溶液与步骤2)获得的溶液进行混合，获得所述的高分子凝胶。

其中，优选的，步骤1)所述的树状大分子pamam为末端为氨基的g5代树状大分子。

其中，优选的，步骤2)所述cooh-peg-oh和所述树状大分子pamam的质量比为7:1。

其中，优选的，步骤3)所述的醛基化多聚糖是由高碘酸钾氧化多聚糖制备而成，其中高碘酸钾与多聚糖的质量比为19:17。

其中，优选的，步骤3)中是将质量百分比浓度为5％的醛基化多聚糖溶液与步骤2)获得的溶液按照体积比为1:1进行混合。

进一步的，本发明还提出了所述的高分子凝胶在制备用于膀胱灌注靶向膀胱癌递送药理活性物质载体中的应用。

本发明的高分子凝胶通过承载药物的树状大分子pamam与特异性粘附肿瘤的醛基化多聚糖制备而成。而cooh-peg-oh则是用于封闭pamam末端的部分氨基，用于调节最终凝胶的粘度。经过实验证实cooh-peg-oh和pamam的优选质量比为7:1，树状大分子pamam具有立体多孔网状结构，能够有效承载多种药物活性物质。同时末端的氨基能够与醛基化多聚糖的醛基通过席夫碱作用形成网状凝胶。而多余的醛基可以通过特异性识别肿瘤组织表面的氨基，进行靶向性粘附，将凝胶内的药物活性物质进行定向释放。

当注入膀胱时，该高分子凝胶会在膀胱内表面形成一层广泛的保护膜，以早期隔离漂浮的肿瘤细胞，阻止其进行膀胱再种植。其中，正常膀胱粘膜上的凝胶会短时间内随着尿液的冲刷而降解；而残余肿瘤表面由于表达丰富的胶原，该凝胶能够特异性持续地贴附于肿瘤表面，达到持续递送药物的目的。

本发明的第二目的在于提供一种靶向治疗膀胱癌的高分子复合凝胶，其是在所述的高分子凝胶中加入了药理活性物质制备得到，所述药理活性物质包括但不限于吉西他滨、具有治疗作用的纳米颗粒、阿霉素、丝裂霉素、表柔比星以及卡介苗中的一种或几种联合使用。

其中，优选的，所述的药理活性物质为吉西他滨联合纳米金棒。

其中，优选的，所述复合凝胶中吉西他滨的浓度为10mg/ml，纳米金棒浓度为50μg/ml。

其中，优选的，所述的纳米金棒紫外吸收峰在760nm-800nm之间，经过近红外激光照射后能够升温到45℃左右，所述近红外激光的能量为1w，光照时间为5分钟。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

1、本发明的一种高分子凝胶主要包括可承载药物活性物质的树状分子pamam和靶向粘附膀胱癌的醛基化多聚糖，首先通过靶向肿瘤组织的高分子凝胶作为药物载体，进行靶向性释放，增加膀胱内药物滞留时间的同时，减少了药物对正常膀胱组织的刺激，进而减少副作用。

2、向所述的高分子凝胶中加入药理活性物质可制备得到靶向治疗膀胱癌的高分子复合凝胶，以载有纳米金棒和吉西他滨的靶向治疗膀胱癌的复合凝胶为例，该复合凝胶具有以下三个优势：第一，靶向贴附膀胱癌，可以缓释药物并且延长药物作用时间，同时正常膀胱上皮药物存留少，副作用小；第二，纳米金棒的光热作用不仅可以作为热消融单独杀伤肿瘤组织，其提供的热疗作用可以协同加强吉西他滨的化疗作用，促进肿瘤细胞对药物的摄取，达到热化疗的目的。光热治疗膀胱癌，能够通过光热消融杀伤肿瘤组织；第三，化疗联合热疗，通过热化疗治疗促进化疗对肿瘤组织的杀伤作用，所应用的光热设备仅为近红外激光发射器，相比传统热化疗仪器，造价相对低廉，应用简便，易于临床推广。

附图说明

图1是吉西他滨在高分子凝胶与生理盐水的药物释放曲线图；

图2是纳米金棒吸收峰和电镜图；

图3是载有纳米金棒的高分子凝胶的时间-温度曲线图；

图4是靶向膀胱癌的高分子复合凝胶图；

图5是复合凝胶、吉西他滨、生理盐水抑制细胞种植的效果图；

图6是复合凝胶、吉西他滨、生理盐水杀伤肿瘤组织的效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但下述实施例不会在任何方面限制本发明的保护范围。

实施例1：靶向膀胱癌递送药理活性物质的高分子凝胶的制备

(1)将g5代树状大分子pamam溶解在去离子水中，制备成质量分数为10％的溶液。

(2)将cooh-peg-oh粉末加入到pamam溶液中制成溶液a，其中cooh-peg-oh粉末与溶质pamam的质量比例为7:1。

(3)将多聚糖溶解在去离子水中，制备成质量百分比浓度为5％的溶液。将高碘酸钾粉末加入到多聚糖溶液中，反应过夜并透析，制备成5％的醛基化多聚糖溶液，即溶液b。其中高碘酸钾粉末与溶质多聚糖的质量比为19:17。

(4)将溶液a和溶液b等体积混合制备成可靶向膀胱癌递送药理活性物质的高分子凝胶。

实施例2：载吉西他滨高分子凝胶的制备。

将吉西他滨粉末溶解于实施例1制备的高分子凝胶中，制备成载有吉西他滨的靶向高分子凝胶。其中吉西他滨的浓度为10mg/ml。

为说明本实施例中的载药高分子凝胶能够缓释给药，通过以下实验证明：

将吉西他滨分别溶解在1ml生理盐水溶液和高分子凝胶溶液中，制备成浓度为10mg/ml的水溶液和胶溶液，密封于1000da的透析袋中，并分别放入两只装有500ml生理盐水的烧杯中，持续搅拌。按不同时间点取样，通过高效液相色谱仪检测两只烧杯生理盐水中吉西他滨浓度，最后计算并绘制出二者的药物释放曲线。如图1所示，高分子凝胶中能够更有效的缓释药物吉西他滨。

实施例3：载纳米金棒高分子凝胶的制备

用种子生长法制备出直径约40nm，吸收峰在760mm-800nm之间的纳米金棒，如图2。将纳米金棒溶解于实施例1中制备的高分子凝胶中，制成浓度为50μg/ml载有纳米金棒的高分子凝胶。

为说明本实施例中的载有纳米金棒的高分子凝胶具有光热效应，通过以下实验证明：

将1ml浓度为50μg/ml载有纳米金棒的高分子凝胶置入ep管中，分别用能量为0.5w、1w、1.5w的波长为785nm的近红外激光照射10分钟，用热成像摄像机记录时间-温度曲线。结果如图3，载有纳米金棒的高分子凝胶在功率为1w的近红外激光照射下能够达到50℃以上的温度，能够实现热疗消融肿瘤的作用。

实施例4：载有纳米金棒和吉西他滨的靶向膀胱癌的高分子复合凝胶的制备

将纳米金棒、吉西他滨分别溶解在实施例1制备的高分子复合凝胶中。其纳米金榜、吉西他滨的浓度分别为50μg/ml和10mg/ml。制备出高分子复合凝胶，如图4。

为说明本实施例中复合凝胶中具有更有效的杀伤肿瘤作用，通过以下实验证明：

复合凝胶抑制膀胱癌细胞膀胱种植：

膀胱癌细胞种植模型的构建：将5周龄的balb/c雌性裸鼠30只随机平均分成a、b、c三组，每组10只。将小鼠麻醉消毒后，用24g留置针经尿道插入小鼠膀胱内。将电刀通过留置针内芯导电破坏膀胱内膜，以模拟经尿道膀胱肿瘤电切术对膀胱的损伤。其能量为2.5w，作用时间为1秒。将膀胱癌细胞5637制备成浓度1×10⁶/ml的pbs悬液。经留置针注入0.1ml膀胱癌细胞悬液于膀胱中，并在膀胱内留置60分钟后排出。

药物灌注：a组灌注本实施例制备的载有纳米金棒和吉西他滨的高分子复合凝胶；b组灌注浓度为10mg/ml的吉西他滨水溶液；c组灌注无菌生理盐水。分别在膀胱内滞留60分钟后排出。之后在体外用波长为785nm，能量为1w的近红外激光体外照射a、b、c三组小鼠的膀胱区域5分钟。30天后分别取各组小鼠膀胱，检验成瘤情况。

实验结果：a、b、c三组小鼠药物灌注后均存活，a组检出膀胱肿瘤0例；b组检出膀胱肿瘤4例；c组检出膀胱肿瘤9例。其成瘤率分别为0％、40％、90％，如图5。实验结果证明复合凝胶具有更有效的抑制膀胱癌细胞种植的作用。

复合凝胶能够杀伤膀胱癌组织：

小鼠原位膀胱癌模型的构建：将5周龄的balb/c雌性裸鼠15只随机平均分成a、b、c三组，每组5只。用细胞灌注法建立小鼠原位膀胱癌模型，并用彩超监测小鼠肿瘤大小，当肿瘤生长到50mm³大小时进行下一步实验。

单次灌注治疗膀胱肿瘤：用24g留置针经尿道插入小鼠膀胱内，a组灌注本实施例制备的载有纳米金棒和吉西他滨的高分子复合凝胶；b组灌注浓度为10mg/ml的吉西他滨水溶液；c组灌注无菌生理盐水。分别在膀胱内滞留60分钟后排出。之后在体外用波长为785nm，能量为1w的近红外激光体外照射a、b、c三组小鼠的膀胱区域5分钟。20天后分别取各组小鼠膀胱，测量肿瘤大小。

实验结果：a组膀胱肿瘤体积为0±0mm³；b组膀胱肿瘤体积为43.28±5.47mm³；c组膀胱肿瘤体积为78.36.28±11.21mm³，如图6。实验结果证明载有纳米金棒和吉西他滨的高分子复合凝胶组具有更显著的杀伤肿瘤效果。