二氢杨梅素卵磷脂基液晶分散颗粒的制备及体外释放，抗氧化和细胞毒性效应的制作方法

本发明属于二氢杨梅素药物载体领域，特别涉及二氢杨梅素卵磷脂基液晶分散颗粒的制备及体外释放，抗氧化和细胞毒性效应。

背景技术：

二氢杨梅素是从藤条等植物中提取的一种天然黄酮类化合物。具有保护肝脏、调节血脂、抗癌、抗氧化、消炎、抑菌、止咳、镇痛等功效。但水中溶解度低，因此其生物利用度的提高受到一定的限制。由两亲性脂自组装形成的溶致液晶(lc)结构已被确定为潜在的缓释药物载体。在过量水中分散反相的液晶可以得到液晶分散颗粒，这些液晶分散颗粒能够保持母体液晶的非层状结构。药物包封于液晶分散颗粒既可以实现缓释又能够提高药物的溶解度及稳定性等。大多数研究都集中在油酸单甘油酯作为液晶形成的脂质，其中以单油酸甘油酯(gmo)和植物三醇(phy)最为引起人们的兴趣。但gmo构筑的药物载体在用于口服给药时，由于脂键导致其在胃肠道中容易被脂肪酶消化分解。另外，barauskas等人发现gmo基液晶分散颗粒与小鼠血混合后，能够引起溶血。phy虽能够较好的抵抗胃肠液的消化，但是价格比较昂贵，由它制备的液晶分散颗粒的细胞毒性也相对较高。

磷脂是构成细胞膜的主要成分。卵磷脂，是磷脂的典型亚类。它是一种双尾表面活性剂，具有两性离子极性头，包括带正电的胆碱部分和带负电的磷酸基团。单独的卵磷脂可以在水中以自组装形式堆积成层状相液晶，当引入合适的助剂如醇，油时，能够促使反六角相液晶结构的形成。有研究发现大豆磷脂酰胆碱(spc)和二油酸甘油酯(gdo)制备的液晶分散颗粒对比单纯gmo基液晶分散颗粒展现出较低的溶血活性。chen等人在体内药代动力学的研究中发现包载紫杉醇的spc/gdo基液晶分散颗粒使得药物更高的auc和更慢的体内清除速率。

液晶分散颗粒作为载体用于药物递送正得到广泛的研究，但是对于其潜在毒性效应的理解也是不可或缺的。液晶分散颗粒的组成，相态，粒径，剂量以及表面特性，如表面电荷和涂层等因素都会对细胞毒性产生影响。hinton等人的研究表明两种非常相似且常用的gmo基和phy基立方相液晶分散纳的细胞毒性存在显著差异，由于phy基液晶分散颗粒较高的溶血活性和氧化应激使得它显示出更高的毒性。drummond等人的研究发现组分相同的乳液和六方相液晶分散颗粒比立方相的毒性要小。zhai等人发现与传统的稳定剂f-127相比，聚乙二醇化磷脂稳定的植烷三醇基液晶分散颗粒减小了对a549和cho细胞毒性。

但用于负载二氢杨梅素的液晶分散颗粒的报道较少，因此，本申请研发了一种适用于二氢杨梅素新型液晶分散颗粒，以满足二氢杨梅素缓释以及多途径给药等需求。

技术实现要素：

为了克服上述不足，本发明用已有的卵磷脂反六角相液晶体系引入稳定剂后，采用超声破碎的方法制备成液晶分散颗粒用于包封二氢杨梅素。研究了dmy在液晶分散颗粒中的体外释放行为以及载药液晶分散颗粒的清除自由基活性。进一步研究了液晶分散颗粒的细胞毒性效应以及载药后样品对细胞生长的抑制作用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的目的之一是提供了一种二氢杨梅素卵磷脂基液晶分散颗粒，由反六角相大块液晶超声分散而成，其中，反六角相大块液晶由如下原料组成：卵磷脂70.5-77.85重量份、蓖麻油coil0-7.52重量份、1,2-丙二醇pg0-7.99重量份，聚乙二醇peg4000-9.4重量份、油酸oa0-4.7重量份、水7.99-15.98重量份、tween806-8重量份。

为了丰富二氢杨梅素的给药途径，本申请研发了一种卵磷脂基液晶分散颗粒，实验结果表明：二氢杨梅素包封在该液晶分散颗粒中可使得其抗氧化能力得到提高，同时，该液晶分散颗粒显示出较好的细胞毒性效应，能对癌细胞的生长发挥一定的抑制作用。

另一方面，在制备卵磷脂基液晶分散颗粒的过程中，为了避免液晶分散颗粒的聚集，本申请加入一定量的tween80，通过tween80对液晶颗粒的包覆，实现了液晶颗粒地有效分散。

优选的，所述反六角相大块液晶由如下原料组成：卵磷脂70.5重量份、蓖麻油coil7.52重量份、水15.98重量份、tween806-8重量份。

优选的，反六角相大块液晶由如下原料组成：卵磷脂70.5重量份、蓖麻油coil7.52重量份、1,2-丙二醇pg4.794-7.99重量份、水7.99-11.186重量份、tween806重量份。

优选的，反六角相大块液晶由如下原料组成：卵磷脂72.85重量份、聚乙二醇4009.4重量份、水11.75重量份、tween806-8重量份。

优选的，反六角相大块液晶由如下原料组成：卵磷脂77.85重量份、聚乙二醇4004.7重量份、油酸oa4.7重量份、水11.75重量份、tween806-8重量份。

优选的，超声分散的条件为：功率400w，超声总时间18min，脉冲模式——工作时间10s，间歇时间5s。

本发明的目的之二是提供了一种载体药物，包括：二氢杨梅素、任一上述的二氢杨梅素卵磷脂基液晶分散颗粒。

优选的，所述二氢杨梅素的含量为1-5％，以载体药物总质量计。

优选的，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂或颗粒剂。

本发明的目的之三是提供了二氢杨梅素卵磷脂基液晶分散颗粒在制备具有保护肝脏、调节血脂、抗癌、抗氧化、消炎、抑菌、止咳或镇痛作用的药物中的应用。

本发明的有益效果

(1)本发明提供了一种新型的液晶分散颗粒被成功制备用作药物递送的载体。液晶分散颗粒显示出对二氢杨梅素双相释放控制，包括释放初期的突释以及中后期的缓释。体外释放动力学表明，药物在释放前期属于浓度扩散控制过程，释放中后期包含了其他扩散机制的影响。二氢杨梅素包封在液晶分散颗粒中使得其抗氧化能力得到提高。卵磷脂基液晶分散颗粒显示出较好的细胞毒性效应，载药液晶分散颗粒能对癌细胞的生长发挥一定的抑制作用。本申请可能对设计和选择更好的液晶分散颗粒作为药物递送系统有一定的指导意义。

(2)本发明制备方法简单、控释效率高、实用性强，易于推广。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1.液晶分散颗粒的粒径曲线；

图2.37℃时，液晶分散颗粒中二氢杨梅素的体外释放曲线。插图为二氢杨梅素在乙醇溶液中的释放曲线。实线对应于释放动力学模型拟合出的累计释放百分率值(i：释放前期，ii：释放中期，iii：释放后期)；

图3.载药液晶纳米粒子对abts·⁺清除活性曲线；

图4.载药液晶纳米粒子对dpph自由基清除活性曲线；

图5.4t1小鼠乳腺癌细胞的存活率随空白和载药液晶分散颗粒浓度的变化。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本申请使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

实施例1

1、实验材料与方法

1.1.材料

卵磷脂(sl)购买于alfaaesar公司。蓖麻油(coil)，1,2-丙二醇(pg)，油酸(oa)都为分析纯，peg400为化学纯，购买于中国国药化学试剂有限公司。2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(abts)和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(dpph)购买于上海麦克林生化科技有限公司。

1.2.液晶分散颗粒的制备

1)反六角相大块液晶的组成列于表1；按照表1中组分的比例，先称取卵磷脂和tween80于比色管中，后加入油相，在60-80℃的水浴中充分搅拌混匀，然后加入二氢杨梅素和水相，充分搅拌混匀。反复离心后置于37℃恒温水浴中平衡一周，即制得反六角相大块液晶。

m1，m2，m3样品中的油相是蓖麻油(coil)；m4样品的油相为peg400；m5样品的油相为peg400和油酸(oa)。m1，m4，m5样品中的水相是水，m2和m3样品中的水相为1,2-丙二醇和水。

使用超声波细胞破碎仪对含有稳定剂的大块反六角相液晶进行分散，分散之前，先将液晶样品置于25ml的小烧杯中，加入过量水后在超声波细胞破碎仪上进行分散，分散时需用冰水浴对小烧杯进行降温，最终得到乳状分散体。超声波细胞破碎仪参数设置为：功率400w，超声总时间18min，脉冲模式(工作时间10s，间歇时间5s)。

1.3.粒径和zeta-电位的测定

液晶分散颗粒的粒径，多分散指数(pdi)和zeta-电位由马尔文激光粒度仪(zs90,英国马尔文仪器有限公司)进行了测定。测试温度为25℃，仪器参数中溶剂选为水，平衡时间120s，测定角度90°。为避免多重散射，样品用双蒸水稀释20倍后再盛入样品中进行测定。粒径结果选用的强度平均粒径。

1.4.二氢杨梅素的体外释放

采用透析法研究二氢杨梅素在液晶分散颗粒中的释放性能。以含30％(v/v)乙醇(ph＝6.8)的磷酸盐缓冲液为释放介质，模拟小肠环境。在透析袋中加入适当体积的载药纳米粒子，夹子封口后浸没于40mlpbs缓冲液中。不同温度下的恒温水浴中释放药物，搅拌速率100rap/min.每隔一段时间取出3.5ml释放介质并且补充相同体积的新鲜介质，以确保释放介质的恒定体积。紫外的方法被使用来测定二氢杨梅素在292nm波长下的吸光度。

1.5.释放动力学模型

释放动力学数学模型在药物释放方面应用广泛，其参数可以用来评估药物的释放动力学，甚至可以在药物释放之前预知其释放过程。常用的经典模型主要有以下几种:

higuchi模型，qt＝kht^1/2(1)

其中kh为溶解常数，qt是药物的累计释放百分率，t为释放时间。

korsmeyer-peppas模型，

其中k为动力学常数，n为释放速率常数，用来描述不同的释放过程，mt/m∞是药物在t时刻的释放百分比。

一级动力学模型，

其中k为一阶速率常数，m0为最初药物释放量。

零级动力学模型，m0-mt＝k0t(4)

其中m0为药物在载体中的最初含量，mt为药物在时间t时的释放量，k0为零级速率常数。

hixson-crowell立方根模型，q0^1/3-qt^1/3＝khct(5)

其中qt为药物在t时刻时的累计释放率，q0为药物的最初含量，khc为动力学常数。

1.6.清除abts·⁺能力的测定

包载二氢杨梅素的液晶分散颗粒对于abts·⁺清除活性(rsa)是用先前报道的方法进行的，但做了一些小的修改。配置浓度为7mmol/l的abts水溶液。abts水溶液中加入过硫酸钾产生abts自由基阳离子，保证过硫酸钾在abts水溶液中的浓度为2.45mmol/l。将混合液置于黑暗环境中反应16h后使用，原因是abts的氧化反应在加入过硫酸钾后立即开始，但吸光度在超过6小时后才能达到最大和稳定。自由基在室温黑暗中贮藏2天以上能够保持阳离子的性质稳定。abts·⁺在使用之前用双蒸水稀释至734nm波长下的吸光度为0.70±0.02。待测样品用双蒸水稀释至不同的浓度，后在1ml不同稀释度的样品中加入3ml的abts自由基阳离子，旋涡混匀器混匀。避光反应30min后，734nm波长下测定吸光度，记作a1，空白对照样品由1ml的双蒸水和3ml的abts自由基阳离子制成，734nm波长下的吸光度记作a0。

1.7.清除dpph自由基能力的测定

dpph自由基清除活性(rsa)参照he等人的方法。用双馏水按一定浓度梯度稀释二氢杨梅素液晶分散颗粒。dpph乙醇溶液的浓度配制成6×10^-5mol/l。2ml不同稀释度的样品溶液加到2mldpph乙醇溶液中，旋涡混匀器混匀后避光反应1h。在3000r/min离心后518nm波长下测定样品的吸光度，记作a1，等量蒸馏水代替样品作为对照组，以a0表示，用等体积乙醇代替dpph乙醇溶液作为空白组，记为a2。

1.8.细胞培养

将4t1小鼠乳腺癌细胞培养于由90％1640培养基，10％胎牛血清(fbs)和1％青链霉素组成的培养液中。细胞生长在37℃，5％co2的培养箱中，待细胞融合达到80％，弃去培养基，用0.25％胰蛋白酶消化，接种到96孔板中。96孔板中每孔加入200μl的培养液，细胞接种密度为5000个/孔。细胞在标准环境下孵育24小时后，将原培养液更换成培养液稀释过的液晶分散颗粒，继续孵育6小时。空白对照组只加培养液和细胞。每个浓度设置4个复孔。培养液稀释的液晶分散颗粒的浓度梯度为1.0，5.0，25，75，250μg/ml。

1.9.细胞活力的测定

配制5mg/ml的mtt溶液，96孔板每孔中加入40μl的mtt溶液，co2培养箱中培养4小时，取出孔板中的培养基，pbs清洗后向每孔中加入100μl的dmso，溶解孔中的甲瓒。使用多功能微孔板检测仪(synergy2，美国伯腾仪器有限公司)在490nm波长下测定各孔的od值。

细胞存活率＝od490nm(样品)/od490nm(对照)×100％

表1.分散前载药液晶样品的组成。

2、结果与讨论

2.1.液晶分散颗粒的粒径分布和zeta电位

如图1所示，制备的二氢杨梅素液晶纳米颗粒的粒径在100-160nm左右。与本实验室先前制备的姜黄素液晶分散颗粒粒径一致。各个样品的粒径，多分散指数(pdi)以及zeta-电位参数值列于表2中。组分的含量影响了样品的粒径尺寸。对于相对较低卵磷脂含量的m1→m3样品，pg含量最高的m3样品显示出最大的粒径。较高卵磷脂含量的m4和m5样品，油酸的引入减小样品的粒径。较低的pdi值意味着样品较均匀的粒径分布。样品的pdi值最大的仅为0.210，说明样品粒径分布均匀。

zeta电位是胶体分散系稳定性的重要指标，zeta电位的绝对值越高，分散颗粒之间抵抗聚集的能力越强，体系的稳定程度更好。五个样品中分散颗粒都带有负电荷，样品m3和m4拥有较高的zeta-电位值，在此系列液晶分散颗粒中属于高稳定性体系。对于m5样品，其zeta-电位值接近于0，推测可能是中性条件下油酸解离的h⁺抵消分散颗粒表面负电荷的缘故。

表2.载药液晶纳米粒子的粒径，多分散指数和zeta电位。

2.2.二氢杨梅素的体外释放

液晶分散颗粒中二氢杨梅素的累积释放百分率(cr)随时间(t)的变化关系如图2所示。样品在释放的前5个小时表现出累积释放率随时间线性增大的趋势，是一种突释现象。造成这种现象的原因主要有两方面的因素，一是载体中药物的起始浓度较大以及部分dmy会吸附在液晶分散颗粒的表面，二是样品较小的粒径使得液晶分散颗粒具有大的比表面积。在释放的5-10小时之间，dmy的释放速率有所减缓。释放达到10个小时后，累计释放率缓慢上升，基本达到释放平台。5个样品保持较高累计释放率的时间都能够达到40个小时以上，综合来看液晶分散颗粒对dmy仍然具有良好的缓释效果。观察插图中dmy乙醇溶液中二氢杨梅素的释放曲线可知，相比与载体中dmy的释放，dmy乙醇溶液达到释放平台的时间快了近一倍，并且一直保持95％左右的高释放率，释放时间仅为27个小时左右。表明液晶纳米颗粒对dmy具有缓释效果。

对于仅有水相pg含量不同的m1→m3样品，达到释放平台的dmy累积释放百分率与样品粒径的大小呈负相关，即较小的粒径值对应较大的累积释放率。说明液晶分散颗粒的比表面积对释放百分率的影响起到了主要作用。但在释放时间8小时之前，m2样品的释放速率却是低于m1样品，此阶段可能是由药物起初浓度和分散颗粒表面dmy的吸附造成的。对于油相中油酸含量不同的m4和m5样品，m4样品的释放速率和累积释放百分率都高于含有油酸的m5，这可能是m5样品中油酸导致了样品粘度增大的结果。

2.3.二氢杨梅素的释放动力学

由于各种内部或外部因素的干扰，药物在载体中的释放不能保持单一的释放模式。换句话说，药物在不同的释放阶段会遵循不同的释放动力学。在isabellemartiel等人的工作中，仅仅用higuchi方程拟合了咖啡因在大豆磷脂酰胆碱液晶中不到30％的释放数据。korsmyer-peppa模型仅用于拟合了前60％的药物释放数据。因此，为了更好的理解dmy的释放过程，释放数据用多种动力学方程进行了分段拟合。释放过程被分成了三个阶段，释放前期，中期和后期(图2)。表3列出了样品释放适用方程的回归拟合结果。

释放前期，m5样品较好的遵循higuchi模型，说明该载体中dmy的释放属于浓度控制的fick扩散过程。其余样品以及对照组都较好的遵循一级动力学模型，说明这些样品在释放前期都遵循浓度控制的扩散释放。释放中期，m2，m3以及对照组继续遵循一级动力学浓度控制扩散的释放模式。m1，m4和m5样品较好的释放模式变成了korsmeyer-peppas模型，说明药物的释放可能有多个扩散机制控制，但主要还是由浓度扩散控制。相比于释放前期，释放中期的药物释放动力学模型的拟合指数已相对较低，可能是由于释放介质对载体的侵蚀作用导致了液晶分散颗粒的体积以及表面积等发生了改变。释放后期，除了m4样品中有较高的一级动力学拟合指数外，其余样品各种动力学方程的拟合指数都不高，无法准确反映药物的释放过程。

表3.37℃时，液晶分散颗粒中二氢杨梅素在不同释放时期的释放动力学。

2.4.抗氧化活性

为了进一步研究载药液晶分散颗粒的体外性能，对载药液晶纳米粒子进行了抗氧化方面的研究。abts·⁺和dpph·的清除能力是一种用来评估混合或者单纯抗氧化剂抗氧化活性的广泛使用的模型。抗氧化剂的abts·⁺和dpph·清除活性归因于抗氧化剂的供氢能力。

2.4.1.abts·⁺清除活性

图3是载药液晶分散颗粒清除abts·⁺能力的曲线。每条清除曲线的数据可以通过logistic方程拟合，获得重要的拟合参数ic50值。低的ic50值意味着更好的抗氧化活性。图3中含有蓖麻油体系的3个样品都拥有较小的ic50值，其中以m1样品最为突出，表现出最好的自由基清除活性。说明该体系的液晶分散颗粒与dmy具有更好的组合抗氧化效应。体系中pg的引入削弱了样品对abts·⁺的清除能力。对于油相含有peg400的体系，m4和m5的ic50值高于其他样品，这可能是液晶分散颗粒本身的性质所决定的。与单纯的二氢杨梅素溶液相比，载药液晶分散颗粒的抗氧化活性有一定的提高。二氢杨梅素的50％乙醇溶液清除abts·⁺的ic50值为3.78μg/ml.与之相比，载药液晶分散颗粒的ic50值都小于或明显小于单纯二氢杨梅素溶液的ic50值，说明液晶分散颗粒改善了二氢杨梅素的抗氧化活性。

在清除曲线趋于平稳时，本申请提出了关于一个临界点s(cs,rs)的概念。参数cs和rs分别反映了自由基清除效率和清除过程的有效性(清除效果)。载药样品对abts·⁺的清除效率以及清除过程有效性的结果列于表4。可以发现，较好自由基清除效率的样品同时也拥有较好的自由基清除活性。载药样品对abts·⁺都展现良好的清除过程的有效性，有效性几乎都能达到100％。

2.4.2.dpph·清除活性

进一步，载药液晶分散颗粒对dpph·的清除能力作为评价其抗氧化能力的另一个指标。二氢杨梅素乙醇溶液的清除dpph·的ic50值为5.7μg/ml。如图4所示，载药液晶分散颗粒清除dpph·的ic50值都小于二氢杨梅素乙醇溶液的，说明载药液晶分散颗粒具有良好的自由基清除活性。与abts·⁺的清除活性相比，图4中含有蓖麻油体系的3个样品对dpph·的清除活性低于了油相含有peg400的体系样品，说明含有peg400的液晶散颗粒体系对dpph自由基有更好的清除能力。在两个体系中的样品清除自由基ic50值次序与图3对应体系样品保持一致。同样拥有较好自由基清除效率的样品也具有较好的自由基清除活性。载药样品对dpph·清除过程的有效性仅在75％左右，明显低于abts·⁺清除过程的有效性。这可能与dpph分子有较大的空间位阻有关。

表4.载药液晶纳米粒子清除abts·⁺和dpph自由基的临界参数值。

2.5.细胞毒性

为了探究卵磷脂液晶分散颗粒的生物相容性以及液晶分散颗粒包载dmy后对癌细胞的抑制能力，我们测定了样品对4t1小鼠乳腺癌细胞存活率的影响，如图5所示。

对于cm2和m2样品，在五个浓度梯度下，都出现了一个细胞存活率反常的浓度。其他的样品则随着液晶分散颗粒浓度的提高，细胞的存活率依次降低。4t1细胞对样品的浓度有一定的耐受值。空白样品对细胞发生明显作用的浓度达到25μg/ml以上，在此浓度之前，cm1，cm2和cm3样品作用下的细胞存活率能够达到93％以上，cm4和cm5作用的细胞整体存活率也在87％以上。相比于对应的空白样品，载药液晶分散颗粒几乎每个浓度下细胞的存活率都有所降低，说明dmy对癌细胞的存活起到了一定的抑制作用。xie等人发现在所研究的dmy浓度范围内，dmy对正常人肝细胞l02的活力的影响并不明显，但是却明显降低了肝癌细胞hepg2活力。dmy对当样品浓度达到250μg/ml时，无论dmy存在与否，都基本完全抑制了4t1癌细胞的生长。

单纯比较空白样品的细胞毒性可以发现，含有蓖麻油体系的样品在5，25以及75μg/ml这三个浓度梯度时，其对细胞存活率的作用都优于含peg400体系的两个样品。说明含蓖麻油体系的液晶分散颗粒的生物相容性更好。对于含蓖麻油的三个体系，cm3样品作用下的细胞存活率相对较低，可能是体系中pg含量较多的缘故。对于含peg400的两个体系，代表样品对细胞存活率的影响没有表现出明显差异。引入dmy后，在样品浓度高于25μg/ml时，载药样品作用下的细胞存活率明显降低，其中以m3和m5样品最为突出。

结论

一种新型的液晶分散颗粒被成功制备用作药物递送的载体。液晶分散颗粒显示出对二氢杨梅素双相释放控制，包括释放初期的突释以及中后期的缓释。体外释放动力学表明，药物在释放前期属于浓度扩散控制过程，释放中后期包含了其他扩散机制的影响。二氢杨梅素包封在液晶分散颗粒中使得其抗氧化能力得到提高。卵磷脂基液晶分散颗粒显示出较好的细胞毒性效应，载药液晶分散颗粒能癌细胞的生长发挥的一定的抑制作用。本申请可能对设计和选择更好的液晶分散颗粒作为药物递送系统有一定的指导意义。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。