本发明属于中药技术领域，特别是涉及一种天然药物组合物和含有该天然药物的中药组合物及其应用。
背景技术
近50年来，持续、快速发展的异基因造血干细胞移植(allo-hsct)成为了治疗乃至治愈恶性血液病最有效的方法。到目前为止，在世界范围内完成的allo-hsct病例每年已超过2万例，然而，allo-hsct治疗各类白血病的长期无病生存率平均大约仅为50％左右，这主要是由于移植带来的并发症(主要包括移植物抗宿主病、病原微生物感染等)严重影响了病人的预后及生存。因此，寻找安全有效的治疗方法控制各种移植并发症的发生和发展，对于提高移植成功率、改善患者预后及增加血液病患者和脓毒症患者的长期生存率具有重要意义。
移植物抗宿主病(gvhd)是异基因造血干细胞移植后，异基因供者的t淋巴细胞通过受者体内的“细胞因子风暴”和炎症反应对受者器官和组织(如皮肤、肠道和肝脏等)造成的损伤。包括以受者靶器官为目标发动细胞毒攻击而引发的免疫反应等，根据其在移植后发生的时间长短分为急性和慢性两种。其中，急性移植物抗宿主病(agvhd)发生在移植后0～100天，主要累及皮肤、胃肠道及肝脏，少数情况下也可累及其他脏器，是移植后引起早期死亡的重要并发症之一。因此，及时有效地防治急性移植物抗宿主病对保证移植成功及移植后长期生存有着极为重要的意义。
针对异基因造血干细胞移植后发生agvhd的高危患者，如hla不相合供者、无关供者、减低强度预处理移植的受者、高龄患者、发生感染患者等，目前钙调磷酸酶抑制剂如环孢素(csa)或他克莫司联合短疗程糖皮质激素或甲氨蝶呤是预防agvhd最常用的方案。糖皮质激素仍为目前agvhd的标准一线治疗药物。ⅳ度agvhd治疗的起始剂量为甲泼尼龙(mp)每天2mg/kg或其他等效激素，但由于部分患者对药物不敏感，单药激素治疗的有效率仅为50％，而更高剂量的激素不宜用于一线治疗。
值得注意的是，基于此类免疫抑制思路的治疗方案，不仅会增加复发和感染的几率，同时也存在着植入失败等严重并发症的危险。另外，csa有潜在致癌的危险性，在临床应用中已有并发淋巴瘤、皮肤恶性肿瘤的报告，同时，csa和他克莫司均可引起心血管系统的不良反应；甲氨蝶呤具有肠胃道反应、肝肾损伤等副作用。总之，现有用于移植物抗宿主病的药物在发挥治疗作用的同时，其不良反应也会增加其他健康风险，从而对机体造成不同程度的伤害。
除移植物抗宿主病外，移植手术过程中由于受者处于自身免疫缺陷状态，极易被环境中的各种致病真菌感染，进而引起真菌性脓毒症，其进一步发展可导致脓毒性休克、多器官功能障碍综合征，因此脓毒症也成为移植患者死亡的重要原因之一，其病死率高达30％～50％。目前，抗菌素和输液是治疗脓毒症的主要干预措施，尚缺少预防脓毒症发生的临床干预措施。
技术实现要素：
如上所述，目前移植物抗宿主病的常规治疗方案对机体存在伤害、可能增加其它健康风险，且存在患者对药物不敏感，移植后脓毒症发病风险增高等隐患，因此，本发明针对这一系列问题提供一种天然药物组合物，旨在降低以上风险隐患。
以及，本发明还提供上述天然药物组合物在制备预防移植物抗宿主病和/或真菌性脓毒症药物方面的应用。
以及，本发明还提供一种中药组合物。
以及，本发明还提供上述中药组合物在制备预防移植物抗宿主病和/或真菌性脓毒症药物方面的应用。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种天然药物组合物，包括以下重量份数配比的原料：芍药苷40～200份、阿魏酸1～20份、羟基红花黄色素10～50份和原儿茶醛1～20份。
相对于现有技术，本发明所提供的天然药物组合物具有多靶点多通道调节作用，能同时防治移植物抗宿主病及真菌性脓毒症两大造血干细胞移植并发症，具有药效更强、安全性更好的优点，同时该组合物无毒副作用，对机体几乎不存在伤害、且不会增加其他健康风险。如图1所示，本发明所提供的组合物在防止组织损伤、炎症因子释放、供体t细胞激活及靶细胞凋亡的效应阶段均有作用靶点，具有良好的药效。在本发明中，以芍药苷和羟基红花黄色素的免疫调节功效为主，兼具活血化瘀、防止和逆转器官衰竭，抗细胞凋亡、抗炎和抗感染等一系列的保护作用，从而达到系统防治效果。本组合物以芍药苷为君，羟基红花黄色素为臣，阿魏酸和原儿茶醛为佐、使，形成一个完整的君臣佐使中药复方配伍来发挥抗agvhd和真菌性脓毒症的作用。
中药药理分析表明，芍药苷、羟基红花黄色素具有活血化瘀、镇痛镇静、抗炎解毒的作用，能够缓解急性移植物抗宿主病引起的皮肤斑疹等症状。同时，芍药苷具有显著的抗溃疡作用，且芍药苷、羟基红花黄色素、阿魏酸、原儿茶醛均具有抗炎作用，能在一定程度上保护和修复胃肠道损伤。另外，羟基红花黄色素具有的细胞保护活性以及原儿茶醛对生物膜的保护作用能够进一步减轻急性移植物抗宿主病和真菌性脓毒症对胃肠道及其它器官(如肾脏等)的伤害。
药理实验揭示，芍药苷能够明显地改善和恢复肝损伤所导致的血清谷丙转氨酶升高、血清白蛋白及肝糖原含量下降、肝细胞变性和坏死等症状。羟基红花黄色素能够抑制肝纤维化、改善肝脏架构、改善血液循环、减少肝损。原儿茶醛能抑制肝星形细胞增殖、减轻肝纤维化程度、降低生化指标参数及组织病理学形态改变。以上三种成分共同作用，修护agvhd引起的肝损伤。
由于agvhd患者的免疫系统在临床药物干预后处于免疫抑制状态，使其容易被真菌感染而患真菌性脓毒症，而本发明在研究过程中意外发现，以上四种成分在发挥抗agvhd作用的同时，还具有抗真菌感染和保护肾脏等作用。
优选地，所述天然药物组合物包括以下重量配比的原料：芍药苷80～160份、阿魏酸2～4份、羟基红花黄色素20～40份和原儿茶醛2～4份。
优选地，所述天然药物组合物包括以下重量配比的原料：芍药苷80～160份、阿魏酸10～20份、羟基红花黄色素20～40份和原儿茶醛10～20份。
以及，本发明实施例还提供上述天然药物组合物在制备移植物抗宿主病和/或真菌性脓毒症药物方面的应用，具体应用方法为：
将上述天然药物组合物溶于注射用生理盐水，制成所述组合物含量为1～5mg/ml的溶液，过滤、灭菌、制成注射液。
将本发明所提供的组合物制成移植物抗宿主病的注射液后，通过注射给药方式，使其直接更快进入血液循环，从而在移植物受体体内发挥抗gvhd和抗真菌感染的作用。同时，可明显改善gvhd及真菌感染患者的生活质量，并避免现有药物对机体的伤害和潜在的健康风险。
优选地，所述注射液的给药方式为静脉注射或皮下注射，这两种给药方式能够使药物快速起效，能够更快地缓解agvhd和真菌感染症状，对于移植成功和移植后的长期生存发挥更好的辅助作用。
优选地，在制备预防移植物抗宿主病药物方面的应用还包括，在所述预防移植物抗宿主病药物中加入csa，使用过程中所述天然组合物与所述csa分别注射，其中所述组合物与所述csa的质量比为1∶1～5。本发明所提供的组合物与csa联用显示出更好的系统防治gvhd的作用，既可以减少csa用量，又可以预防csa造成的副作用，如肾衰竭等，以达到对csa减毒增效的效果，从而对异基因造血干细胞移植和器官移植的广泛应用起到积极作用，具有重要的临床意义。
以及，本发明实施例还提供一种中药组合物，包括含有芍药苷的中药、含有阿魏酸的中药、含有羟基红花黄色素的中药和含有原儿茶醛的中药，且所述中药组合物中含有芍药苷40～200份、阿魏酸1～20份、羟基红花黄色素10～50份和原儿茶醛1～20份。
该中药组合物包含芍药苷、阿魏酸、羟基红花黄色素和原儿茶醛四种成分，经实验发现，该中药组合物也具有抗gvhd和抗真菌感染的作用。
优选地，所述含有芍药苷的中药包括赤芍或白芍中的至少一种；和/或含有阿魏酸的中药包括当归、川芎、益母草、车前子、车前叶、木贼中的至少一种；和/或含有羟基红花黄色素的中药包括红花、葛根、山楂中的至少一种；含有原儿茶醛的中药包括丹参、鼠尾草、四季青叶中的至少一种。
以及，本发明实施例还提供上述中药组合物在制备预防移植物抗宿主病和/或真菌性脓毒症药物方面的应用。
实验发现，上述中药组合物在制成预防移植物抗宿主病和/或真菌性脓毒症药物后，具有显著的抗gvhd和抗真菌感染的作用。
附图说明
图1为移植物抗宿主病的病理通路及药物靶点；
图2为实施例21中各组移植物抗宿主病小鼠生存曲线；
图3为实施例22中各组移植物抗宿主病小鼠生存曲线；
图4为实施例22中各组移植物抗宿主病小鼠gvhd评分；
图5为实施例22中各组移植物抗宿主病小鼠体重变化曲线；
图6为实施例23中96小时后流式细胞仪检测图；
图7为实施例23中96小时后cd4阳性与cd8阳性t细胞的统计柱状图；
图8为实施例23中cd8阳性t细胞增殖情况；
图9为实施例24中血管环生成的效果；
图10为实施例25中各组真菌性脓毒症小鼠的生存曲线；
图11为实施例25中各组真菌性脓毒症小鼠的肾脏真菌负荷；
图12为实施例25中各组真菌性脓毒症小鼠的肾脏病理结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步举例说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本发明实施例提供了一种天然药物组合物，包括以下重量配比的原料：芍药苷40份，阿魏酸1份，羟基红花黄色素10份，原儿茶醛1份。
实施例2
本发明实施例提供了一种天然药物组合物，包括以下重量配比的原料：芍药苷80份，阿魏酸2份，羟基红花黄色素20份，原儿茶醛2份。
实施例3
本发明实施例提供了一种天然药物组合物，包括以下重量配比的原料：芍药苷120份，阿魏酸3份，羟基红花黄色素30份，原儿茶醛3份。
实施例4
本发明实施例提供了一种天然药物组合物，包括以下重量配比的原料：芍药苷160份，阿魏酸4份，羟基红花黄色素40份，原儿茶醛4份。
实施例5
本发明实施例提供了一种天然药物组合物，包括以下重量配比的原料：芍药苷200份，阿魏酸5份，羟基红花黄色素50份，原儿茶醛5份。
实施例6
本发明实施例提供了一种天然药物组合物，包括以下重量配比的原料：芍药苷80份，阿魏酸10份，羟基红花黄色素20份，原儿茶醛10份。
实施例7
本发明实施例提供了一种天然药物组合物，包括以下重量配比的原料：芍药苷160份，阿魏酸20份，羟基红花黄色素40份，原儿茶醛20份。
实施例8
本发明实施例提供了一种中药组合物，包括白芍、当归、红花和丹参，该组合物中含有芍药苷120份、阿魏酸3份、羟基红花黄色素3份和原儿茶醛3份。
实施例9
本发明实施例提供了一种中药组合物，包括白芍、川芎、葛根和鼠尾草。该组合物中含有芍药苷40份、阿魏酸1份、羟基红花黄色素10份和原儿茶醛1份。
实施例10
本发明实施例提供了一种中药组合物，包括白芍、益母草、车前子、山楂、四季青叶。该组合物中含有芍药苷80份、阿魏酸2份、羟基红花黄色素20份和原儿茶醛2份。
实施例11
本发明实施例提供了一种中药组合物，包括赤芍、车前叶、红花、丹参。该组合物中含有芍药苷160份、阿魏酸4份、羟基红花黄色素40份和原儿茶醛4份
实施例12
本发明实施例提供了一种中药组合物，包括赤芍、木贼、红花、丹参。该组合物中含有芍药苷200份、阿魏酸20份、羟基红花黄色素50份和原儿茶醛20份。
实施例13
本发明实施例提供了一种中药组合物，包括赤芍、川芎、葛根、四季青叶。该组合物中含有芍药苷80份、阿魏酸10份、羟基红花黄色素20份和原儿茶醛10份。
实施例14
本发明实施例提供了一种中药组合物，包括白芍、益母草、红花、鼠尾草。该组合物中含有芍药苷160份、阿魏酸20份、羟基红花黄色素40份和原儿茶醛20份。
实施例15
本发明实施例提供了一种天然药物组合物在制备预防移植物抗宿主病和真菌性脓毒症药物方面的应用，具体方法为：将实施例3所得组合物溶于注射用生理盐水中，制成组合物含量为2.6mg/ml的溶液，过滤、灭菌、制成注射液。
实施例16
本发明实施例提供了一种天然药物组合物在制备预防移植物抗宿主病和真菌性脓毒症药物方面的应用，具体方法为：将实施例3所得组合物溶于注射用生理盐水中，制成组合物含量为1.0mg/ml的溶液，过滤、灭菌、制成注射液。
实施例17
本发明实施例提供了一种天然药物组合物在制备预防移植物抗宿主病和真菌性脓毒症药物方面的应用，具体方法为：将实施例3所得组合物溶于注射用生理盐水中，制成组合物含量为5.0mg/ml的溶液，过滤、灭菌、制成注射液。
实施例18
本发明实施例提供了一种天然药物组合物在制备预防移植物抗宿主病和真菌性脓毒症药物方面的应用，具体方法为：将实施例6所得组合物溶于注射用生理盐水中，制成组合物含量为2.6mg/ml的溶液，过滤、灭菌、制成注射液。
实施例19
本发明实施例提供了一种中药组合物在制备预防移植物抗宿主病和真菌性脓毒症药物方面的应用，具体方法为：将实施例8所得中药组合物用水进行提取，得到提取物干品，将所得提取物干品溶于注射用生理盐水中，制成芍药苷、阿魏酸、羟基红花黄色和原儿茶醛总含量为2.6mg/ml的溶液，过滤、灭菌、制成注射液。
实施例20
本发明实施例提供了一种中药组合物在制备预防移植物抗宿主病和真菌性脓毒症药物方面的应用，具体方法为：将实施例13所得中药组合物用水进行提取，得到提取物干品，将所得提取物干品溶于注射用生理盐水中，制成芍药苷、阿魏酸、羟基红花黄色和原儿茶醛总含量为2.6mg/ml的溶液，过滤、灭菌、制成注射液。
实施例21
本发明实施例提供了实施例15、实施例19所得注射液与csa共同给药的药理学实验对生存率的影响。
试验对象：
骨髓移植雄性balb/c小鼠42只，健康雄性c57小鼠2只，10周龄，体重23-25g。其中雄性balb/c小鼠作为受者，雄性c57小鼠作为供者。标记balb/c小鼠并进行随机分组(对照组、空白组、实施例15a组、实施例15b组、实施例19组、csa组)。
agvhd模型制作：
对对照组以外的各组小鼠第一天第一次4.25gy放疗照射，实施例15a组、实施例15b组、实施例19组分别按各自的给药剂量、给药方法给予对应的试验样品。3～4h后进行第二次照射。第二天(设为第0天)上午取c57小鼠骨髓和脾细胞，通过尾静脉注射对空白组、实施例15a组、实施例15b组、实施例19组、csa组健康雄性小鼠balb/c进行移植。各组小鼠均出现外周血wbc＞1.0×109/l，且伴有倦怠、活动减少、精神萎靡、嗜睡，食欲下降、体重下降、弓背、脱毛、腹泻、出血的症状，病理检查可见肝脏、脾脏组织淋巴细胞浸润，正常组织结构破坏，即各组小鼠agvhd模型建立成功。
试验样品：
实施例15a组、实施例15b组使用的是本发明实施例15所得的注射液，并同时给予csa；实施例19组使用的是本发明实施例19所得的注射液；空白组给予生理盐水。
给药方法：
实施例15a组和实施例19组的给药量均为0.8ml/kg，实施例15b组的给药量为2ml/kg，均在第-1、2、4、6、8、10、12、14天皮下注射给药，并均在第0-6天按5mg/kg(以csa的质量计)的给药量每天腹腔注射csa；空白组在第-1、2、4、6、8、10、12、14天连续腹腔注射生理盐水；csa组在第0-6天按5mg/kg的给药量连续腹腔注射csa。
对各组小鼠存活量进行考察，结果见图2。
由图2的结果可以看出，实施例15a组、实施例19组与空白组对比，p<0.05，说明两组小鼠生存比率具有明显差异，且实施例15a组的生存率优于实施例15b组。
实施例22
本发明实施例提供了实施例15所得注射液与csa分别给药的药理学实验对生存率的影响。
试验对象、agvhd模型制作方法和试验样品同实施例21。
给药方法：
实施例15a组的给药量为0.8ml/kg，实施例15b组的给药量为2ml/kg，均在第3-18天隔日给药(共8次)，并在第4～10天连续给药csa(以csa的质量计，给药量为5mg/kg)；空白组给予生理盐水；csa组在0-6天连续给予5mg/kgcsa。结果见图3～图5。
由图3可见，各组与空白组相比，生存比率具有明显差异，且实施例15a组的生存率优于csa组。
由图4可见，实施例15a组、实施例15b组、csa组与空白组相比，gvhd评分显著降低，说明联合用药优于环孢素单独用药，具有潜在临床意义。随着实验的进行，空白组小鼠陆续死亡，存活者为症状稍轻小鼠，因此实验后期gvhd评分下降，但并不代表空白组小鼠gvhd症状发生改善。
由图5可见，实施例15组与csa组相比，对小鼠体重有一定增长，说明实施例15组小鼠的身体状况更优，不良反应更小。
实施例23
本发明实施例提供了实施例3所得天然药物组合物以及实施例19所得中药组合物注射液的体外抑制t细胞增殖实验。
实验细胞：c57小鼠原代脾细胞。
实验步骤：
实验分组方案设计为：阴性对照组，阳性对照组，csa组、天然药物1组、天然药物2组、中药1组，中药2组。将含1640全培(10％fbs+1％ps)的细胞悬液浓度调整为5×106个/ml，取650μl作为阴性对照组；其余细胞悬液与cd3&cd28抗体(cd3抗体浓度为3μg/ml，cd28抗体浓度为1μg/ml)混合后，取出650μl作为阳性对照组；剩余细胞悬液中，取611μl细胞悬液与csa混合作为csa组，取637μl细胞悬液与13μl实施例19所得注射液(用全培稀释成中药提取物含量为2mg/ml)混合作为中药1组，取646.8μl细胞悬液与3.25μl实施例19所得注射液(用全培稀释成中药提取物含量为0.5mg/ml)混合作为中药2组，取637μl细胞悬液与13μl实施例3所得组合物的高浓度溶液(用全培稀释成2mg/ml)作为天然药物1组，取646.8μl细胞悬液与3.25μl实施例3所得组合物的低浓度溶液(用全培稀释成0.5mg/ml)作为天然药物2组。各组细胞悬液按100μl/well加入96孔板内，每组6孔。其中csa终浓度为30ng/ml。
种板48小时后，各给药组加入50μl/well的相同浓度的含药全培，阴性对照组和阳性对照组中各孔分别加入50μl/well的全培。
在种板96小时后，从各组中收集细胞于ep管中，进行细胞计数，然后从每组中取出50万个细胞进行cd4和cd8抗体染色。以cd4抗体：cd8抗体＝1:1的数量比，用pbs配制成双染液。800g，3min离心细胞，去上清，每组加100μlpbs重悬，再加2μl双染液，室温避光放15min，加1mlpbs洗涤一次，离心弃上清，加300μlpbs定容，用流式细胞仪检测各组t细胞的体外增殖情况，结果如表1、图6～图8所示。
表1
如图6所示，脾细胞经cd3&cd28抗体刺激后，用流式细胞仪检测，先从总细胞中圈出淋巴细胞，再进一步圈出各组的cd4阳性与cd8阳性t细胞。
如图7所示，96小时后，天然药物组及中药组的cd4+与cd8+t细胞数量明显少于阳性对照组。
如图8所示，天然药物组及中药组能够抑制cd8阳性t细胞的增殖。
实施例24
本发明实施例提供了实施例3所得天然药物组合物的体外促进血管新生实验。
实验细胞：人脐静脉内皮细胞ea.hy926。
实验流程：
1、实验准备
①第一天，对细胞进行传代培养。
②第二天，待细胞长满(80％-90％)时，换成0.1％fbs的培养基继续培养(饥饿)24h，将matrixgel(bdbioscience)提前置于4℃冰箱过夜解冻，同时200μl灭菌枪头、96孔黑板置-20℃冰箱预冷12h，准备第二天实验使用。
2、正式实验
①在超净台中，将96孔黑板放在冰盒上，用移液枪将matrixgel迅速加入各孔底中央(45μl/孔)，振荡使其均匀铺满孔底。
②将96孔黑板放在4℃冰箱静置>2h。
③配药：提前将实验用药在室温条件下溶解，根据加药方案用dmem基础培养基稀释药物。
④待96孔板胶面平整后，室温，2500rpm，10min，离心96孔板，并于37℃，5％co2培养箱中平衡30min。
⑤将培养箱中的细胞取出，并用胰酶消化，弃上清，用0.1％fbs培养基重悬细胞。
⑥进行细胞计数，并将其浓度调整至3.6*105个/ml。
⑦加药：将上述各孔细胞分为空白组、对照组、实施例组、羟基红花黄色素组、芍药苷组、原儿茶醛组和阿魏酸组，每组均设为高浓度组和低浓度组，高浓度组分别加入2mg/ml的生理盐水、血管内皮生长因子、实施例3所得组合物、羟基红花黄色素、芍药苷、原儿茶醛和阿魏酸，低浓度组分别加入0.5mg/ml的生理盐水、血管内皮生长因子、实施例3所得组合物、羟基红花黄色素、芍药苷、原儿茶醛和阿魏酸，每孔加药体积均为50μl，每种药设3个复孔。
⑧种板：每孔加50μl细胞悬液，再将板转移至培养箱中培养16h。
⑨固定：提前将多聚甲醛放在37度水浴中预热半小时。从培养箱中取出96孔板，先用排枪吸出孔中液体，再加入多聚甲醛(100μl/孔)进行固定。
⑩高内涵筛选：待固定半小时之后用高内涵仪器对96孔黑板进行扫描，并统计每个孔中血管环的生成数量。
由实验结果可见，实施例3高浓度溶液(2mg/ml)与低浓度溶液(0.5mg/ml)所得结果与空白组对比，p<0.05，其中实施例3低浓度溶液与空白组相比p<0.01，说明实施例3提供的天然药物组合物在体外具有明显的促进血管新生作用，而各化合物单独用药对血管新生无明显作用。
实施例25
本发明实施例提供了实施例18所得注射液与实施例20所得注射液的抗真菌感染效果的药理学实验。
试验对象：
健康雄性balb/c小鼠35只，10周龄，体重23-25g。
真菌感染模型制作：
将白念珠菌菌种接种于琼脂平皿培养基上，于30℃条件下培养，待其长满备用。离心收集白念珠菌，用pbs洗涤并计数。按文献方法取白念珠菌通过尾静脉注射法接种于小鼠体内，使小鼠患真菌性脓毒症(domínguez-andrésj,feo-lucasl,minguitodelaescaleram,gonzálezl,lópez-bravom,ardavínc.inflammatoryly6c(high)monocytesprotectagainstcandidiasisthroughil-15-drivennkcell/neutrophilactivation.immunity.2017jun20；46(6):1059-1072.citedinpubmed；pmid:28636955.)。将真菌性脓毒症小鼠随机分为天然药物组、中药组和空白组。
试验样品及给药方法：
实施例20所得注射液作为中药组所用样品；天然药物组使用的是本发明实施例18制得的产品。给药方案：接种白念珠菌前3天(-3到-1天)每天给药一次(给药量均为6ml/kg)，同时观察小鼠的生存情况。结果如图10所示，中药组和天然药物组与空白组相比，生存率均有显著性提高(p<0.05)。
试验方法及结果：
(1)肾脏中真菌负荷
小鼠感染三天后，在无菌条件下，将其肾脏分离出来并称重，然后用pbs将其制成组织匀浆。进一步将组织匀浆稀释至合适浓度后接种到琼脂平皿培养基中，于30℃条件下培养48h后计数菌落形成单位。结果如图11所示，天然药物组及中药组小鼠的存活率及肾脏真菌负荷都明显优于空白组。
(2)肾脏病理切片
将取出的肾脏组织先用中性福尔马林溶液固定，然后乙醇脱水、石蜡包埋，再切片染色，最后显微镜下观察，结果如图12所示，天然药物组及中药组小鼠肾脏中真菌量明显少于空白组。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。