负载microRNA的氧化铈纳米复合水凝胶及制备方法和应用与流程

本发明涉及急慢性创伤复合生物材料，具体涉及一种负载microrna的氧化铈纳米复合水凝胶及制备方法和应用。

背景技术

在我国，由于环境、饮食、人口老龄化等各种因素影响，急慢性皮肤创伤和急慢性脏器损伤患者人数迅速上升。急慢性创伤患者不仅需要消耗大量的医疗资源，而且会增加家庭和社会的负担。诸如糖尿病足等慢性创伤的治疗手段仍相对缺乏，患者得不到及时有效的治疗，严重可导致截肢或死亡。因此，亟需开发针对各种急慢性创伤的新型有效的治疗手段。

在急慢性皮肤创伤和急慢性器官损伤中，损伤部位的炎症反应会导致活性氧自由基大量累积，使得创伤组织中有修复作用的核酸分子，生长因子，干细胞失活坏死，阻碍损伤组织或器官的的修复与再生。此外损伤组织或器官内部的血管通常也会被破坏，降低血氧和营养物质的供应，也会导致阻碍损伤组织或器官的的修复与再生。

当前的基础研究和临床治疗主要集中在通过局部递送血管生长因子，干细胞等方式来促进损伤组织或器官的修复与再生。但是，经过上述方式递送的血管生长因子，干细胞等活性组分会被损伤部位的活性氧自由基氧化失活，使得应用受到了极大的限制，增加了治疗的成本，甚至可能会产生毒性副产物。

快速有效地促进患者组织器官损伤的修复与再生，不仅可以降低医疗卫生系统的负担，同时也可以促进大量患者恢复劳动能力，有利于国家经济的发展。然而现有治疗手段难以充分满足临床治疗和患者需求，因此针对急慢性创伤致病机理，构建能够同时调控损伤部位氧化微环境和促进血管生成的复合生物材料为当务之急。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种负载microrna的氧化铈纳米复合水凝胶，能够同时调控损伤部位氧化微环境和促进血管生成。

本发明所提供的技术方案为：

一种负载microrna的氧化铈纳米复合水凝胶，包括交联后的胶原蛋白，分散在胶原蛋白内的阳离子聚合物修饰的氧化铈纳米晶；所述阳离子聚合物修饰的氧化铈纳米晶通过静电吸附作用负载有microrna。

本发明中负载microrna的氧化铈纳米复合水凝胶是由具有抗氧化作用的氧化铈纳米晶与刺激血管生成的microrna在胶原蛋白溶液中经过交联得到的纳米复合水凝胶，具有降低氧化应激反应和激活血管生成的作用。

在创伤部位的高氧化应激微环境中，氧化铈纳米晶借助表面铈离子价态可逆转化降低活性氧自由基浓度，减少创伤部位的氧化应激损伤，同时抑制氧化微环境对负载的microrna的破坏作用，提高microrna激活血管新生的活性。其次，水凝胶中的胶原蛋白能够促进创伤修复。

本发明中microrna可以选择现有技术中已知的microrna，用于刺激血管生成。作为优选，所述microrna为mir-26ainhibitor，其序列为seqidno.1。其中mir-26ainhibitor的序列为：5′-agccuauccuggauuacuugaa-3′。

本发明中所述氧化铈纳米晶的尺寸为1～10nm。

本发明中所述阳离子聚合物选自聚乙烯亚胺、精胺、腐胺中的一种或多种。阳离子聚合物带有正电荷，microrna带有负电荷，两者通过静电吸附作用进行负载。

本发明中所述胶原蛋白选自i型胶原蛋白、ⅱ型胶原蛋白、ⅲ型胶原蛋白、ⅳ型胶原蛋白、ⅴ型胶原蛋白中的一种或多种。

本发明提供一种如上述的负载microrna的氧化铈纳米复合水凝胶的制备方法，包括：

1)氧化铈纳米晶采用2-溴代异丁酸和柠檬酸在n,n-二甲基甲酰胺和氯仿混合溶剂中进行取代反应，然后用阳离子聚合物进行修饰，得到阳离子聚合物修饰的氧化铈纳米晶；

2)将microrna通过静电吸附作用负载到阳离子聚合物修饰的氧化铈纳米晶；

3)将负载有microrna的阳离子聚合物修饰的氧化铈纳米晶分散于胶原蛋白溶液中，进一步使用京尼平交联得到负载microrna的氧化铈纳米复合水凝胶。

本发明中所述步骤1)中氧化铈纳米晶的制备方法包括：将醋酸铈溶解在油胺和二甲苯中并升温，加水反应，经不良溶剂离心沉淀，得到氧化铈纳米晶。作为优选，所述升温的温度为80～120℃；所述醋酸铈、油胺和二甲苯的投料比为0.1～1g:1～10g:5～50ml；所述不良溶剂选自甲醇、乙醇、二甲基亚砜、丙酮中的一种或多种。

进一步优选，所述氧化铈纳米晶的制备方法包括：将醋酸铈溶解在油胺和二甲苯中，室温下搅拌3～12小时；将混合物升温至80～120℃，升温时间20～120分钟，温度稳定后保持0～60分钟加超纯水反应，老化1～12小时，经不良溶剂沉淀，得到氧化铈纳米晶。

进一步优选，所述升温的温度为85～95℃；所述醋酸铈、油胺、二甲苯和超纯水的投料比为0.4～0.5g:3～3.5g:13～17ml:0.5～1.5ml。

本发明所述步骤1)中阳离子聚合物修饰的氧化铈纳米晶的制备具体包括：将氧化铈纳米晶加入到含有2-溴代异丁酸和柠檬酸的n,n-二甲基甲酰胺和氯仿混合溶剂中搅拌反应，中间产物离心分散于n,n-二甲基甲酰胺；然后将含有阳离子聚合物的n,n-二甲基甲酰胺加入到上述含有中间产物的n,n-二甲基甲酰胺中搅拌反应得到。

作为优选，所述步骤1)中氧化铈纳米晶与阳离子聚合物的质量比为1:4～1:10。

作为优选，所述阳离子聚合物选自聚乙烯亚胺、精胺、腐胺中的一种或多种。

作为优选，所述步骤1)中氧化铈纳米晶、2-溴代异丁酸、柠檬酸和阳离子聚合物的投料比为5～20mg:0.1～2g:0.01～0.2g：20～200mg。进一步优选为13～17mg:0.4～0.6g:0.04～0.06g：70～90mg。

作为优选，所述步骤1)混合溶剂中n,n-二甲基甲酰胺与氯仿的体积比为1:9～9:1。进一步优选为1:0.9～1.1。

本发明所述步骤2)中microrna与阳离子聚合物修饰的氧化铈纳米晶的氮磷比为2.5:1～40:1。进一步优选为9～11:1。

作为优选，所述microrna为mir-26ainhibitor，其序列为seqidno.1。其中mir-26ainhibitor的序列为：5′-agccuauccuggauuacuugaa-3′。

本发明所述步骤3)中交联反应具体包括：将负载有microrna的阳离子聚合物修饰的氧化铈纳米晶分散在胶原蛋白溶液中，加入交联剂京尼平，交联温度为25～60℃，得到负载microrna的氧化铈纳米复合水凝胶。

作为优选，所述胶原蛋白选自i型胶原蛋白、ⅱ型胶原蛋白、ⅲ型胶原蛋白、ⅳ型胶原蛋白、ⅴ型胶原蛋白中的一种或多种。

作为优选，所述步骤3)中胶原蛋白溶液的浓度为1～3mg/ml。

作为优选，所述步骤3)中京尼平在反应液中的浓度为0.8～1.2mm。

本发明提供一种如上述的负载microrna的氧化铈纳米复合水凝胶在制备药物中的应用，所述药物用于治疗急慢性创伤。急慢性创伤包括：急慢性皮肤创伤和急慢性器官损伤，优选为糖尿病足。

本发明提供一种如上述的负载microrna的氧化铈纳米复合水凝胶在制备药物中的应用，所述药物用于调控创伤部位氧化微环境和促进血管生成。

同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：将清除活性氧自由基的氧化铈纳米晶，促进血管新生的microrna和促进创伤修复的胶原蛋白结合起来，用于促进创伤组织修复与再生。在创伤部位的高氧化应激微环境中，氧化铈纳米晶借助表面铈离子价态可逆转化降低活性氧自由基浓度，减少创伤部位的氧化应激损伤，同时抑制氧化微环境对负载的microrna的破坏作用，提高microrna激活血管新生的活性。

附图说明

图1为实施例1制备的氧化铈纳米晶的tem照片；

图2为实施例9制备的负载microrna的氧化铈纳米复合水凝胶的sem照片；

图3为应用例1中负载microrna的氧化铈纳米复合水凝胶清除活性氧自由基的荧光定量比较图；

图4为应用例2中经负载microrna的氧化铈纳米复合水凝胶治疗后，创伤部位血管生成cd31免疫荧光比较图；

图5为应用例3中经负载microrna的氧化铈纳米复合水凝胶治疗后的修复创面比较图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和说明书附图对本发明作进一步说明。

实施例1：氧化铈纳米晶的制备

将430mg醋酸铈、3.2g油胺与15ml二甲苯混合，室温下搅拌3小时，以2℃/min的速度将混合物升温至90℃，当体系温度到达90℃时保持该温度30分钟，快速注射1ml超纯水，老化3小时，丙酮沉淀离心得到氧化铈纳米晶。对银纳米粒子用透射电镜进行形貌表征，结果如图1所示，粒径约为3～5nm。

实施例2：氧化铈纳米晶的制备

将430mg醋酸铈、3.2g油胺与15ml二甲苯混合，室温下搅拌12小时，以2℃/min的速度将混合物升温至90℃，当体系温度到达90℃时保持该温度30分钟，快速注射1ml超纯水，老化3小时，丙酮沉淀离心得到氧化铈纳米晶，粒径约为3～5nm。

实施例3：氧化铈纳米晶的制备

将430mg醋酸铈、3.2g油胺与15ml二甲苯混合，室温下搅拌12小时，以2℃/min的速度将混合物升温至100℃，当体系温度到达100℃时保持该温度30分钟，快速注射1.5ml超纯水，老化3小时，丙酮沉淀离心得到氧化铈纳米晶，粒径约为3～5nm。

实施例4：氧化铈纳米晶的制备

将400mg醋酸铈、3g油胺与15ml二甲苯混合，室温下搅拌12小时，以2℃/min的速度将混合物升温至90℃，当体系温度到达90℃时保持该温度30分钟，快速注射1ml超纯水，老化3小时，丙酮沉淀离心得到氧化铈纳米晶，粒径约为3～5nm。

实施例5：阳离子聚合物修饰的氧化铈纳米晶的制备

将15mg氧化铈纳米晶加入到含有0.5g2-溴代异丁酸和0.05g柠檬酸的15mln,n-二甲基甲酰胺/氯仿体积比为1：1的混合溶剂中，在30℃下搅拌6小时，中间产物离心分散在n,n-二甲基甲酰胺中。

将1ml聚乙烯亚胺25k(80mg/ml)的n,n-二甲基甲酰胺溶液缓慢加入5ml2-溴代异丁酸取代的氧化铈纳米晶(3mg/ml)的n,n-二甲基甲酰胺溶液中，在室温下搅拌3小时，得到阳离子聚合物修饰的氧化铈纳米晶。

实施例6：阳离子聚合物修饰的氧化铈纳米晶的制备

将15mg氧化铈纳米晶加入到含有0.5g2-溴代异丁酸和0.05g柠檬酸的15mln,n-二甲基甲酰胺/氯仿体积比为1：1的混合溶剂中，在30℃下搅拌6小时，中间产物离心分散在n,n-二甲基甲酰胺中。

将1ml聚乙烯亚胺0.8k(80mg/ml)的n,n-二甲基甲酰胺溶液缓慢加入5ml2-溴代异丁酸取代的氧化铈纳米晶(3mg/ml)的n,n-二甲基甲酰胺溶液中，在室温下搅拌3小时，得到阳离子聚合物修饰的氧化铈纳米晶。

实施例7：阳离子聚合物修饰的氧化铈纳米晶的制备

将15mg氧化铈纳米晶加入到含有0.5g2-溴代异丁酸和0.05g柠檬酸的15mln,n-二甲基甲酰胺/氯仿体积比为1：1的混合溶剂中，在30℃下搅拌6小时，中间产物离心分散在n,n-二甲基甲酰胺中。

将1ml精胺(80mg/ml)的n,n-二甲基甲酰胺溶液缓慢加入5ml2-溴代异丁酸取代的氧化铈纳米晶(3mg/ml)的n,n-二甲基甲酰胺溶液中，在室温下搅拌3小时，得到阳离子聚合物修饰的氧化铈纳米晶。

实施例8：阳离子聚合物修饰的氧化铈纳米晶的制备

将15mg氧化铈纳米晶加入到含有0.5g2-溴代异丁酸和0.05g柠檬酸的15mln,n-二甲基甲酰胺/氯仿体积比为1：1的混合溶剂中，在30℃下搅拌6小时，中间产物离心分散在n,n-二甲基甲酰胺中。

将1ml腐胺(80mg/ml)的n,n-二甲基甲酰胺溶液缓慢加入5ml2-溴代异丁酸取代的氧化铈纳米晶(3mg/ml)的n,n-二甲基甲酰胺溶液中，在室温下搅拌3小时，得到阳离子聚合物修饰的氧化铈纳米晶。

实施例9：负载microrna的氧化铈纳米复合水凝胶的制备

将microrna(mir-26ainhibitor，其序列为seqidno.1，生产厂家为：生工生物工程(上海)股份有限公司，序列为：5′-agccuauccuggauuacuugaa-3′)和阳离子聚合物修饰的氧化铈纳米晶按照氮磷比10：1混合并涡旋，然后静置30分钟使其复合完全。

将microrna阳离子聚合物修饰的氧化铈纳米晶的复合物与i型胶原蛋白和1nnaoh充分混合(体积比为10:25:6)，随后加入交联剂京尼平，使胶原蛋白的最终浓度为2mg/ml，京尼平最终浓度为1mm，然后在37℃下静置交联3小时。最后，磷酸缓冲液润洗后得到负载microrna的氧化铈纳米复合水凝胶。

使用扫描电镜对得到的负载microrna的氧化铈纳米复合水凝胶进行形貌表征，结果如图2所示，结果显示，该负载microrna的氧化铈纳米复合水凝胶具有良好的分散性和均一性。

应用例1：负载microrna的氧化铈纳米复合水凝胶清除活性氧自由基

取对数生长期的人脐静脉内皮细胞接种于含有负载microrna的氧化铈纳米复合水凝胶(按照实施例9制备得到)的六孔板内，100000细胞/孔，培养48小时。

弃去上层培养液，磷酸缓冲液润洗三遍，加入含有500μm双氧水的磷酸缓冲液培养2小时。弃去上层培养液，磷酸缓冲液润洗三遍，应用荧光探针h2dcf-da染色，检测细胞内活性氧水平。

通过比较空白对照组，空白对照双氧水处理组和负载microrna的氧化铈纳米复合水凝胶处理组的细胞内活性氧水平，结果如图3所示，证明负载microrna的氧化铈纳米复合水凝胶具有明显的活性氧清除作用。

应用例2：负载microrna的氧化铈纳米复合水凝胶促进血管新生

通过给重量为200g左右的sd大鼠腹腔注射链脲佐菌素(剂量：70mg/kg)诱发糖尿病模型。饲养四周后，在糖尿病大鼠背部构建直径为1.5cm的糖尿病创伤模型。

在创伤部位局部给予负载microrna的氧化铈纳米复合水凝胶(按照实施例9制备得到)进行治疗，治疗后第28天将创伤组织取出并进行血管标记物cd31免疫荧光染色。

通过比较空白对照组和负载microrna的氧化铈纳米复合水凝胶处理组的创面，结果如图4所示，空白对照组创面血管结构较少，而负载microrna的氧化铈纳米复合水凝胶处理组的创面组织有丰富的血管生成，证明负载microrna的氧化铈纳米复合水凝胶具有显著的促进血管新生作用。

应用例3：负载microrna的氧化铈纳米复合水凝胶促进糖尿病创伤愈合

通过给重量为200g左右的sd大鼠腹腔注射链脲佐菌素(剂量：70mg/kg)诱发糖尿病模型。饲养四周后，在糖尿病大鼠背部构建直径为1.5cm的糖尿病创伤模型。在创伤部位局部给予负载microrna的氧化铈纳米复合水凝胶(按照实施例9制备得到)进行治疗，治疗后第28天对创面进行观察拍照。

通过比较空白对照组和负载microrna的氧化铈纳米复合水凝胶处理组的创面，结果如图5所示，空白对照组创面呈溃疡状，而负载microrna的氧化铈纳米复合水凝胶处理组的创面已基本愈合，接近正常皮肤，证明负载microrna的氧化铈纳米复合水凝胶具有显著的促进糖尿病创伤愈合作用。

以上所述实施例对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改，补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>浙江大学

<120>负载microrna的氧化铈纳米复合水凝胶及制备方法和应用

<130>18120-1210

<141>2018-07-11

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

agccuauccuggauuacuugaa22