骨修复水凝胶支架及其制备方法与流程

本发明涉及生物医用材料领域，尤其涉及一种骨修复水凝胶支架及其制备方法。

背景技术

3d打印用水凝胶材料表现出极好的机械性能、载药能力、仿生特性，同时由于其可根据缺损部位复杂结构个性化聚合成型，是组织工程材料中出现较晚但是极具发展潜力的新型材料，在临床上具有广阔应用前景。与此同时，3d打印用水凝胶也由于其先进的成型工艺和受损组织修复能力，在国内外生物医学工程领域，如仿生人工器官，以及干细胞/肿瘤与材料相互作用的研究上也具有极大的科研价值。

为了使细胞/组织在水凝胶内部更好地长入、整合，并使其降解与组织长入相匹配，需要在材料内部构建连通的微米尺寸多孔结构。水凝胶的制孔途径有多种，按照成孔机理可分为冷冻干燥法、相分离法、模板法、起泡法等。然而，以上方法制备的多孔水凝胶，随着孔隙率和孔连通性的增大，会导致其弹性模量减小，机械强度下降，使其局限于软组织再生修复的设计上，因此限制了水凝胶材料的应用范围。其次，水凝胶也因为其制备多孔结构时所需的复杂成型体系、苛刻的成型条件，以及交联剂、有机溶剂或制孔剂的残留，不利于加载细胞和机体植入，从而进一步限制了多孔水凝胶在生物材料和组织再生领域的应用。

生物分子响应型智能多孔水凝胶，需要能在机体生理环境下，通过对特定的生物分子(如葡萄糖、酶和dna分子等)产生智能响应，从而发生水解、酶解，从高分子、大分子物质降解成对机体无损害的小分子物质，如氨基酸、乳酸等，并对机体无毒副作用。因此，通过生物分子识别响应的水凝胶，可以模拟生命活动过程中的分子信号识别途径，能识别特定生物分子从而产生刺激响应。这样的水凝胶智能体系类似于具有反馈和平衡功能的生物系统，在组织工程和再生医学领域有非常诱人的应用前景。

技术实现要素：

本发明提供一种在保证骨修复材料具有高孔隙率、机械强度的同时，具有智能响应骨髓间充质干细胞或骨细胞体系和促组织长入并诱导骨愈合的能力，且工艺简单的骨修复水凝胶支架及其制备方法。

为解决上述技术问题，本发明采用下述技术方案：

一种骨修复水凝胶支架，包括高分子凝胶载体和矿化纳米骨颗粒，所述高分子凝胶载体包括高分子凝胶和基质金属蛋白酶响应肽链，所述高分子凝胶与所述基质金属蛋白酶响应肽链直接交联，所述骨修复水凝胶支架在紫外光激发下经过3d打印成型。

根据本发明的设计构思，本发明所述高分子凝胶为胶原蛋白、丝素蛋白、纤连蛋白、明胶、壳聚糖、透明质酸、硫酸角质素、海藻酸钠、纤维丝、糖胺聚糖中的一种或几种。

根据本发明的设计构思，本发明所述基质金属蛋白酶响应肽链为甘氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-氨基(gplgvrgdg-nh2)或甘氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-精氨酸-甘氨酸-氨基(gplgvrg-nh2)。

根据本发明的设计构思，本发明所述矿化纳米骨颗粒修复材料为矿化纳米钙磷颗粒。

另外，本发明要求保护一种骨修复水凝胶支架的制备方法，包括如下制备步骤：

(1)高分子凝胶载体的制备：按重量份计，将10-20份的高分子凝胶溶液、1-5份基质金属蛋白酶响应的肽链、50-100份光交联剂溶解在三乙胺和丙酮的混合溶液，在常温下磁力搅拌进行化学反应，反应完成后，对反应物进行提纯，将纯化产物冻干，于冰箱-20℃保存；

(2)矿化纳米骨颗粒的制备：在含有钙离子的溶液中加入高分子矿化模板的溶液，混合均匀，逐滴加入含有磷酸根离子的溶液，并同时滴加碱溶液，调整溶液ph值为7～8，置于37℃水浴中搅拌并陈化后，用超纯水抽滤或离心清洗所得沉淀，冷冻干燥研磨后得到矿化纳米钙磷颗粒；

(3)多孔水凝胶固化成型：制备浓度为5-20g/ml的高分子凝胶载体溶液，加入1-5％的泡沫稳定剂，1-10％的矿化纳米骨颗粒，1％的光引发剂，置于均质分散机中分散气泡5-10分钟后，置于注射容器中注射成型并于紫外照射下固化形成多孔水凝胶。

根据本发明的设计构思，本发明步骤s1中所述光交联剂为甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酰氯、甲基丙烯酸异氰基乙酯和甲基丙烯酸n-羟琥珀酸亚胺酯中的任意一种。

根据本发明的设计构思，本发明步骤s2中所述高分子矿化模板为胶原蛋白、丝素蛋白、海藻酸钠。

根据本发明的设计构思，本发明步骤s2中所述含有钙离子的溶液为氯化钙溶液或硝酸钙溶液，所述含有磷酸根离子的溶液为磷酸氢二纳或磷酸氢二氨溶液。

根据本发明的设计构思，本发明步骤s3所述的泡沫稳定剂为泊洛沙姆pf127、peo-ppo-peo、椰油酰胺丙基甜菜碱、乙酰基六肽-8、椰油酰胺丙基胺、月桂基羟基磺基甜菜碱中的任意一种；所述光引发剂为irgacure2959、irgacure784、irgacure651、irgacure1173、irgacure819或二苯基乙二酮中的任意一种。

根据本发明的设计构思，本发明步骤s3中所述紫外照射的紫外光波长为365nm，功率为1～50w。

与现有技术相比，本发明具有下述有益效果：

(1)本发明所述的骨修复水凝胶支架可在3d打印注射成型的同时直接加载干细胞，并保持水凝胶的高孔隙率、孔连通性，于是可以在保持细胞活力的同时并利于细胞长入和增殖。

(2)本发明还通过在改性凝胶高分子溶液中引入骨矿化纳米颗粒可以以提高其骨诱导能力；并通过引入基质金属蛋白酶(mmps)敏感的短肽，从而进一步获得一种智能型多孔凝胶支架，实现体内的智能组织响应。

(3)本发明制备的3d打印用骨修复水凝胶支架，相较现有技术，成型工艺更加简单，聚合反应过程更加温和，同时没有毒性溶剂参与合成，且此骨修复水凝胶支架具有良好的组织相容性、低免疫原性、机械性能优异、降解速率更加可控，具有极好的临床应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为3d打印用骨修复支架的扫描电镜(sem)照片。

图2为3d打印用骨修复支架植入大鼠皮下的h&e组织染色切片图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰明白，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要进行说明的是，本发明中，除特别指明，涉及的百分数均为质量百分比。

第一方面，本发明提供一种骨修复水凝胶支架，包括高分子凝胶载体和矿化纳米骨颗粒，所述高分子凝胶载体包括高分子凝胶和基质金属蛋白酶响应肽链，所述高分子凝胶与所述基质金属蛋白酶响应肽链直接交联，所述骨修复水凝胶支架在紫外光激发下经过3d打印成型。

所述高分子凝胶为胶原蛋白、丝素蛋白、纤连蛋白、明胶、壳聚糖、透明质酸、硫酸角质素、海藻酸钠、纤维丝、糖胺聚糖中的一种或几种，所述基质金属蛋白酶响应肽链为甘氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-氨基(gplgvrgdg-nh2)或甘氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-精氨酸-甘氨酸-氨基(gplgvrg-nh2)，所述矿化纳米骨颗粒修复材料为矿化纳米钙磷颗粒。

所述高分子凝胶的结构骨架均为天然高分子，使支架与细胞或体内待修复组织有良好的亲和能力，原料简单易得，成本较低，天然无毒性，并且具有良好的可成型性、可降解能力和可控的机械性能。

所述矿化纳米骨颗粒是由羟基磷灰石(ha)和高分子矿化模板复合而成。所述高分子矿化模板为天然生物高分子材料，所述天然生物高分子材料可以选择胶原蛋白、骨形态发生蛋白、纤连蛋白、层连蛋白、骨唾液酸蛋白、丝素蛋白、血清蛋白、氨基聚糖、蛋白聚糖、壳聚糖、海藻酸钠、合成两性肽分子和合成两性自组装分子中的一种或几种；其优选的高分子矿化模板为胶原蛋白、丝素蛋白、海藻酸钠。所述羟基磷灰石是一种脆性材料，具有骨引导的作用，与所述天然生物高分子复合形成的矿化纳米骨颗粒具有良好的力学性能以及可加快新骨的形成速度。同时所述天然生物高分子是骨组织中的主要有机成分，与羟基磷酸钙复合后与天然骨的成分相近，与人体组织具有良好的生物相容性，且矿化纳米骨颗粒中的天然生物高分子材料对羟基磷酸钙颗粒有一定的束缚和增韧作用，对纤维细胞和成骨细胞起营养、刺激作用，有利于纤维血管、骨组织的长入。且矿化纳米骨颗粒的加入也可以增加多孔水凝胶的机械性能，即使水凝胶变成多孔形式，机械强度变弱，加入后其机械强度可以保持不变，便可促进细胞或组织在水凝胶内部更好地生长、整合。

本发明所述骨修复水凝胶支架中的高分子凝胶上交联基质金属蛋白酶响应的肽链，使整个骨修复材料具备更优异的仿生能力，当其被机体内的基质金属蛋白酶识别后，可程序性地降解，从而可达到植入材料的降解速率与机体组织长入速率相匹配的效果。

第二方面，本发明提供一种骨修复水凝胶支架的制备方法，包括如下制备步骤：

步骤s1、高分子凝胶载体材料的制备：按重量份计，将10-20份的高分子凝胶溶液、1-5份基质金属蛋白酶响应的肽链、50-100份光交联剂溶解在三乙胺和丙酮的混合溶液，在常温下磁力搅拌进行化学反应，反应完成后，对反应物进行提纯，将纯化产物冻干，于冰箱-20℃保存。

详细地，步骤s1是将高分子凝胶溶液改性，将高分子凝胶溶液和基质金属蛋白酶响应的肽链，在三乙胺和丙酮环境中，分别与光交联剂反应，使得高分子凝胶溶液接上了光交联剂所带的双键，同时基质金属蛋白酶响应的肽链也接上光交联剂所带的双键，随后在步骤s3中经过光引发和交联，使基质金属蛋白酶响应的肽链直接交联在高分子凝胶上。

所述高分子凝胶可以选胶原蛋白、丝素蛋白、纤连蛋白、明胶、壳聚糖、透明质酸、硫酸角质素、海藻酸钠、纤维丝、糖胺聚糖中的一种或几种。

所述基质金属蛋白酶响应的肽链可选甘氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-氨基(gplgvrgdg-nh2)或甘氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-精氨酸-甘氨酸-氨基(gplgvrg-nh2)。

所述光交联剂可选甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酰氯、甲基丙烯酸异氰基乙酯和甲基丙烯酸n-羟琥珀酸亚胺酯中的任意一种。由于光交联剂分子内含有碳碳双键，可分别与高分子凝胶与基质金属蛋白酶响应的肽链连接。随后在步骤(3)中经过光引发和交联，使得基质金属蛋白酶响应的肽链直接交联在高分子凝胶上。同时，可通过控制光交联剂接枝率以及交联体系的高分子浓度来调节水凝胶的固化程度和弹性模量。

步骤s2、矿化纳米骨颗粒修复材料的制备：在含有钙离子的溶液中加入高分子矿化模板的溶液，混合均匀，逐滴加入含有磷酸根离子的溶液，并同时滴加碱溶液，调整溶液ph值为7～8，置于37℃水浴中搅拌并陈化后，用超纯水抽滤或离心清洗所得沉淀，冷冻干燥研磨后得到矿化纳米钙磷颗粒；

详细地，所述含有钙离子的溶液为为氯化钙溶液或硝酸钙溶液，所述含有磷酸根离子的溶液为磷酸氢二纳或磷酸氢二氨溶液。

所述的高分子矿化模板可以是胶原蛋白、骨形态发生蛋白、纤连蛋白、层连蛋白、骨唾液酸蛋白、丝素蛋白、血清蛋白、壳聚糖、海藻酸钠、合成两性钛分子、合成两性自组装分子中的一种或几种；优选地，所述高分子矿化模板为胶原蛋白、丝素蛋白、海藻酸钠。

所述调整溶液ph的碱溶液可以为氢氧化钠溶液。

通过所述碱溶液调控溶液的ph值，从而使溶液中的钙离子和磷酸根离子的浓度达到饱和而沉积到高分子矿化模板表面或者是和高分子矿化模板共沉淀而形成矿化纳米骨修复材料。

步骤s3、制备浓度为5-20g/ml的高分子凝胶载体溶液，加入1-5％的泡沫稳定剂，1-10％的矿化纳米骨颗粒，1％的光引发剂，置于均质分散机中分散气泡5-10分钟后，置于注射容器中注射成型并于紫外照射下固化形成多孔水凝胶。

详细地，所述泡沫稳定剂为洛沙姆pf127、peo-ppo-peo、椰油酰胺丙基甜菜碱、乙酰基六肽-8、椰油酰胺丙基胺、月桂基羟基磺基甜菜碱中的任意一种；所述光引发剂为irgacure2959、irgacure784、irgacure651、irgacure1173、irgacure819或二苯基乙二酮中的任意一种。

通过均质分散机和泡沫稳定剂在材料内部构建连通的微米尺寸多孔结构，极大地促进了3d打印支架的多孔结构的形成和高孔隙率，并通过光引发剂在紫外光的照射下使水凝胶固化成型。步骤s3使凝胶材料造孔、高分子凝胶与金属基质蛋白酶响应肽链直接交联、水凝胶材料固化成型三个过程一次完成，且反应条件温和，不添加任何有毒溶剂，同时通过调节紫外光的强度，可调节水凝胶的固化程度和机械强度，最终细胞或组织可以在水凝胶内部更好地生长、整合，同时组织长入与材料降解速度相匹配。

本发明提供的一种骨修复水凝胶支架制备方法，在保证修复材料具有高孔隙率、好的机械强度的同时，水凝胶制孔方法步骤简单，无需进行挤压、冷冻干燥、烧结等过程就可以形成多孔结构，制孔过程与交联固化过程一次成型，形成多孔结构的效率高且孔径尺寸太大，可以很好地加载外源细胞，使材料与组织更好地整合。此法工艺条件温和易实现，简单易操作，在3d打印的同时，便能很温和地同时形成特定200微米以下直径的多孔结构。

以下通过结合具体实施例来对本发明作进一步说明。

实施例1

步骤s1：将1g胶原蛋白以5mg/ml浓度溶解于0.5m的乙酸溶液中，加入0.1g多肽gplgvrgdg-nh2，和溶有10ml三乙胺和10ml的甲基丙烯酸缩水甘油酯的丙酮溶液50ml，在37℃环境中磁力搅拌2天；然后将混合溶液加入透析袋中，置于超纯水的外环境中，每隔6小时换超纯水一次，以充分除去残余有机溶剂和杂质离子，透析2天后将透析纯化的产物冻干，于冰箱-20℃保存待用；

步骤s2：在0.05m、200ml的cacl2溶液中，加入20ml5mg/ml的丝素蛋白溶液，逐滴加120ml、0.05m的na2hpo4溶液，并同时滴加1m的naoh溶液调整ph值为7-8之间，置于37℃水浴中搅拌1天后，用超纯水抽滤清洗所得沉淀，冻干研磨即得到丝素蛋白-羟基磷灰石(sf-ha)矿化纳米骨颗粒；

步骤s3：将步骤s1中改性的溶液配置成10g/ml，加入1％的peo-ppo-peo、5％的sf-ha矿化纳米骨颗粒、1％的irgacure2959，置于均质分散机中分散起泡5分钟后，置于5ml注射器中注射中注射成型，并于365nm的紫外光下照射10分钟固化成多孔的复合水凝胶支架，经冷冻干燥后置于扫描电镜下观察，如附图1所示。

实施例2

步骤s1：将1g透明质酸以10mg/ml浓度溶解于pbs缓冲溶液中，加入0.1g多肽gplgvrg-nh2，和溶有30ml三乙胺和30ml甲基丙烯酸异氰基乙酯的丙酮溶液150ml，在37℃环境中磁力搅拌2天；然后将混合溶液加入到5倍体积的丙酮中沉淀后，用pbs溶解，重复该步骤3次以充分除去残余有机溶剂和杂质离子，将纯化的产物冻干，于冰箱-20℃保存待用；

步骤s2：在0.05m、200ml的ca(no3)2溶液中，加入20ml用0.5m乙酸溶解、浓度为5mg/ml的胶原蛋白溶液，逐滴加120ml、0.05m的(nh4)2hpo4溶液，并同时滴加1m的naoh溶液调整ph值为7～8之间，置于37℃水浴中搅拌2h、陈化2天后，用超纯水抽滤清洗所得沉淀，冻干研磨得到胶原-羟基磷灰石(col-ha)矿化纳米骨颗粒；

步骤s3：将步骤s1中改性的溶液配置成15g/ml，加入2％的椰油酰胺丙基胺、10％的col-ha矿化纳米骨颗粒、2％的二苯基乙二酮，置于均质分散机中分散起泡5分钟后，置于3d生物打印机墨水管内，打印成一定结构的多孔水凝胶支架,并置于紫外反应仪中照射10min，紫外光波长365nm，固化成型后植入于sd大鼠皮下，将sd大鼠皮下缝合后培养2周后取出植入物，进行石蜡包埋切片并h&e染色后显微镜下观察附图2所示。