治疗难治性耐药胶质瘤的药物组合及应用和包装的制作方法

本发明属于药物技术领域，特别涉及难治性人脑胶质瘤药物。

背景技术

近年来研究显示胶质瘤起源与神经干细胞恶性转化高度相关，而胶质瘤约占颅内原发性恶性肿瘤的40～50％。其中高级别胶质瘤(whoiii～iv)因其肿瘤细胞生物学特征的高度异质性和侵袭性，依然是临床上最难治疗的实体肿瘤之一。尽管近几年在恶性胶质瘤手术、放疗、化疗、生物治疗及免疫治疗等综合治疗方面取得了长足进步，但患者的生存获益仍极为有限。正因其浸润性生长，手术及局部放疗等手段难以根治，化疗仍是高级别胶质瘤患者重要治疗手段之一。传统烷化剂能够到达中枢神经系统病灶的药物浓度较低，且易出现严重的骨髓抑制及胃肠道反应。替莫唑胺(tmz)作为一种新型烷化剂类抗肿瘤药，通过造成dna的烷基化损伤致瘤细胞死亡，可以口服，应用方便，具有良好的生物利用度和易通过血脑屏障，中枢神经系统通过性好，且不良反应相对较轻，目前已成为胶质瘤化疗的标准用药。然而近年来的临床应用发现，相当一部分mgmt基因启动子区未甲基化(基因功能完整)的恶性胶质瘤患者tmz化疗疗效不佳。

目前，胶质瘤化疗药物选择较为有限，在缺乏更为高效的化疗药物情况下，如何提高tmz对肿瘤细胞，特别是高表达功能完整的mgmt胶质瘤干细胞的杀伤疗效，是当前胶质瘤化疗领域研究的热点。abcg2与侧群细胞(sidepopulationcells,sp)关系密切，sp细胞对化疗药物具有内在的高抵抗性，是引起肿瘤耐药的重要原因，而sp细胞中富含肿瘤干细胞。研究发现，abcg2cdna转染不同类型的肿瘤细胞，转染后的肿瘤细胞增强了对多种化疗药物的耐药性，药物在细胞内的积聚明显减少，进而推论胶质瘤化疗效果不佳的原因之一是肿瘤实质中所含的肿瘤干细胞高表达abcg2。abcg2的拮抗剂在逆转肿瘤耐药中发挥一定作用。fumitremorginc(ftc)是abcg2特异性拮抗剂，有文献报道ftc能够逆转由abcg2介导的对阿霉素、米托蒽醌的耐药，但因其细胞毒性较大，难以应用于临床。ftc类似物ko143，细胞毒性小，通过与抗肿瘤药物竞争abcg2的结合位点阻止药物外排，实验动物已证实ko143可逆转abcg2介导的化疗耐药，但其作为药物的安全性仍有待评估。尼卡地平是临床上常用的、安全可靠的钙通道拮抗剂，研究发现其对abcg2也有拮抗作用，shukla等人利用光亲和标记的方法发现尼卡地平作用于abcg2底物结合位点，作为反应底物竞争性抑制其转运功能。tmz能够筛选性增加sp细胞数量，由此间接富集了abcg2在残留肿瘤细胞的活性。abcg2作为gscs标志物之一，在高级别胶质瘤中广泛高水平表达。发明人所在课题组前期体外和体内动物模型研究表明，尼卡地平能够显著抑制胶质瘤细胞群中干细胞的比例，并能与化疗药物协同增加对胶质瘤干细胞的杀伤，从而为tmz发挥抗肿瘤作用扫除障碍。

此外，目前已有一些文献报道，tmz联合左乙拉西坦或丙戊酸钠等抗癫痫药物，可增加tmz的抗肿瘤敏感性，为提高胶质瘤患者tmz化疗的收益并延长生存期带来了新的希望。其中丙戊酸钠作为tmz化疗的增敏剂近年来日益受到重视。除可作为一种常见的抗癫痫药物，近年来研究发现，丙戊酸钠还具有诱导肿瘤干细胞分化及促凋亡的作用。有临床研究表明，较tmz单药化疗，采用tmz联合丙戊酸钠化疗患者的生存期延长。丙戊酸钠作为抗肿瘤药物阿霉素的增敏剂，能够显著增强阿霉素的抗肿瘤活性。

迄今为止，尚未见有关以tmz为基础，abcg2拮抗剂(尤其是尼卡地平)联合丙戊酸钠靶向胶质瘤干细胞化疗方案以增强tmz对难治性耐药胶质瘤化疗效果的报道。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供了治疗难治性耐药胶质瘤的药物组合方案组合物及其应用和包装件。本发明使用两种靶向胶质瘤干细胞的常见临床药物通过本发明的技术方案得到治疗难治性耐药胶质瘤的，并提供了相应包装。

根据本发明的一个方面，提供一种治疗难治性耐药胶质瘤的药物组合，包括同时、分开或顺序使用的尼卡地平、丙戊酸钠和治疗有效量的替莫唑胺。本发明组合作为联合制剂用于治疗难治性耐药胶质瘤时，能获得优于tmz单独使用的药效，提高临床治疗的效果。

根据本发明的一个方面，提供一种尼卡地平、丙戊酸钠和治疗有效量的替莫唑胺的应用，尼卡地平、丙戊酸钠和治疗有效量的替莫唑胺在制备难治性耐药胶质瘤化疗药物中的应用。

根据本发明的一个方面，提供一种难治性耐药胶质瘤化疗药物组合物，该组合物包括所述尼卡地平、丙戊酸钠和治疗有效量的替莫唑胺。

根据本发明的一个方面，提供一种难治性耐药胶质瘤化疗药物组合物包装，包装包括含有尼卡地平的nc药盒、含有丙戊酸钠的vpa药盒和含替莫唑胺的tmz药盒。

在一些实施方式中，nc药盒内的尼卡地平为有效剂量的，vpa药盒内的丙戊酸钠为有效剂量的，tmz药盒内的替莫唑胺为有效剂量的。

在一些实施方式中，nc药盒、vpa药盒和tmz药盒为彼此独立的。

在一些实施方式中nc药盒、vpa药盒和tmz药盒内还含有内包，尼卡地平、丙戊酸钠和替莫唑胺分别包装于内包中。

在一些实施方式中，内包为泡罩包装或者药瓶。

在一些实施方式中，难治性耐药胶质瘤化疗药物组合物包装还包括说明书，所述说明书中规定，临床有效剂量替莫唑胺、临床有效剂量的尼卡地平和临床有效剂量的丙戊酸钠，作为联合应用于难治性耐药胶质瘤化疗的制剂。

在一些实施方式中，nc药盒、vpa药盒和tmz药盒包装于同一外包装中。

本发明进行的实验证明了本发明的技术方案在治疗难治性耐药胶质瘤中的技术突破。如，abcg2表达水平与胶质瘤级别及肿瘤耐药相关的试验；尼卡地平抑制肿瘤细胞生长体外试验，采用流式细胞技术检测细胞凋亡、mtt检测肿瘤细胞活性；tmz为基础，尼卡地平和丙戊酸钠靶向胶质瘤干细胞化疗方案，针对难治性耐药胶质母细胞瘤化疗的临床试验，采用免疫组化检测胶质瘤组织中abcg2表达、msp检测肿瘤组织中mgmt启动子甲基化状态。初步随访结果表明，tmz联合尼卡地平及丙戊酸钠化疗方案较之传统化疗方案，不仅能够有效控制胶质瘤患者术后癫痫发生率，新的tmz联合化疗方案对mgmt甲基化阴性及高表达abcg2胶质瘤患者临床缓解率已显示出优于stupp标准化疗方案的初步疗效。

本发明提供了尼卡地平及丙戊酸钠这两种临床常用药物的新用途，靶向胶质瘤干细胞，和tmz联用使用，增加其对难治性耐药胶质瘤的抑制作用，能提高临床疗效；所述药物组合物、药盒及包装件含有作为联合制剂供同时、分开或顺序使用的治疗有效量的tmz、治疗有效剂量的尼卡地平和治疗有效量的丙戊酸钠；该药物组合物、药盒及包装件用于治疗难治性耐药胶质瘤时，能获得优于tmz单独使用的药效。

为了便于理解，以下将通过具体的附图、实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。

附图说明

图1是本发明一种实施方式中abcg2在临床胶质瘤标本显微图；

图2是本发明一种实施方式中用mtt法检测不同浓度的尼卡地平对细胞增殖率的影响示意图；

图3是本发明一种实施方式中流式细胞仪检测尼卡地平对cd133+细胞凋亡率的影响示意图；

图4是本发明一种实施方式中gbm患者mgmt和abcg2表达状况检测；

图5是本发明一种实施方式中是本发明一种实施方式中靶向肿瘤干细胞治疗组与标准治疗组患者生存曲线。

具体实施方式

实施例1.abcg2表达水平与胶质瘤级别及肿瘤耐药相关的试验

实验材料：

dmem/f12培养基(gibco，美国)；胎牛血清(hyclone，美国)；小鼠抗人abcg2单克隆抗体(abcam，英国)；胶质瘤组织标本来源于苏州大学附属第二医院神经外科临床手术病例。

实验方法：

1)免疫组化检测abcg2表达

收集临床胶质瘤患者肿瘤组织手术标本，福尔马林液固定，石蜡包埋后组织切片。pbs清洗三遍，室温下山羊血清封闭1小时，去除血清后加入abcg2小鼠单克隆抗体抗(abcam，ab3380，)，4℃过夜，除去一抗，pbs清洗两遍，加入山羊抗小鼠二抗(beyotime，a0258)，孵育1小时，dab显色；

结果如图1所示，(a)胶质瘤i级；(b)胶质瘤ii级；(c)胶质瘤iii级；(d)胶质瘤iv级；(e)胚胎脑组织；(f)胶质瘤干细胞。abcg2表达水平与胶质瘤级别呈正相关，且胶质瘤干细胞高表达abcg2。

实施例2.尼卡地平抑制肿瘤细胞生长体外试验

实验材料：gbm胶质瘤体外细胞系为本实验室自建，胎牛血清(杭州四季青)，mtt(sigma)，胰酶(sigma)，rhannexinvfitckit(bendermedsystems公司)，tmz(美国先灵葆雅)，盐酸尼卡地平(日本山之内制药株式会社)。

1)mtt检测药物对gbm细胞活性影响

gbm细胞以每孔1×10⁴细胞数接种于96孔板，待培养12小时贴壁后，尼卡地平组加入0.5μg/ml，2.5μg/ml，5ug/ml浓度的尼卡地平，tmz组加入1μg/ml，2μg/ml，4μg/ml，16μg/ml浓度的tmz。联合用药组内同时加入无细胞毒性浓度(5μg/ml)的尼卡地平，孵育48小时，随后每孔加入20μlmtt(5mg/ml)，避光孵育4小时，每孔加入100μl的dmso(二甲基亚砜)，振荡仪上振动10分钟，置酶标仪上570nm波长测定光密度值(od值)，参考波长为630nm。细胞存活率＝试验孔平均od值/对照组平均od值，细胞生长抑制率＝(1－细胞存活率)×100％。图2显示，结果显示。

图2.用mtt法检测不同浓度的尼卡地平对细胞增殖率的影响，实验表明当尼卡地平浓度介于0.5ug/ml到5ug/ml之间时，对肿瘤干细胞无明显毒性作用(图2a)。尼卡地平分别在tmz对cd133+细胞及未经cd133免疫磁珠分离细胞的生长抑制率方面的影响：尼卡地平显著增加tmz对cd133+细胞生长抑制率(图2b)；尼卡地平未能明显增加tmz对未经cd133免疫磁珠分离的肿瘤干细胞生长抑制率(图2c)。尼卡地平对tmz的增敏作用：尼卡地平能够显著增强tmz对各类胶质瘤干细胞的杀伤能力(图2d、图2e、图2f)，差异存在统计学意义。

2)流式细胞仪检测细胞周期与细胞凋亡

将gbm细胞以1×10⁶/瓶的浓度接种于培养瓶，分成4组，一组单独加入6μg/ml的tmz，另一组同时加入5μg/ml的尼卡地平和6μg/ml的tmz，孵育48小时后离心收集细胞，常规以预冷的70％乙醇固定，pi染色，流式细胞术检测细胞周期。凋亡分析采用rhannexinvfitckit，收集前述细胞后经冰磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤1次，将细胞重悬于结合缓冲液，调整细胞浓度至5×10⁵/ml，取195μl加入5μlannexinv-fitc混匀，于室温下孵育10分钟，pbs洗涤1次，将细胞重悬于190μl结合缓冲液，加10μl的pi(20μg/m1)至终浓度为1μg/ml，在流式细胞仪上采用cellquest软件分析。

图3.流式细胞仪检测尼卡地平对cd133+细胞凋亡率的影响：a未加任何药物组，无明显细胞凋亡；b为单独加入tmz(10^-6μm)组，细胞凋亡率为30.71±3.79％；c为尼卡地平(2.5μm)+tmz组，细胞凋亡率上升至58.54±7.06％,两者有显著性差异(p<0.01)。

实施例3.tmz联合尼卡地平、丙戊酸钠靶向胶质瘤干细胞化疗方案针对难治性胶质母细胞瘤化疗的临床试验

实验材料：dmem/f12培养基(gibco，美国)；胎牛血清(hyclone，美国)；小鼠抗人mgmt单克隆抗体(abcam，英国)；qiaamprffpetissue试剂盒(qiagen，德国)；bisulfiteconversion试剂盒(zymoresearch，美国)；annexinv-fitc试剂盒(beyotime，中国)。

1)msp检测mgmt甲基化状态

石蜡包埋肿瘤标本切取10μm厚石蜡切片5片，qiaamprffpetissue试剂盒提取dna，将dna用bisulfiteconversion试剂盒将未甲基化的c转化为t。pcr扩增，pcr反应条件：95℃3min-95℃10s-62℃15s-68℃30s，共45循环。生成相距12bp成对扩增片段。甲基化引物序列，mf：tttcgacgttcgtaggttttcgc,mr:gcactcttccgaaaacgaaacg；非甲基化引物序列，uf:tttgtgttttgatgtttgtaggtttttgt,ur:aactccacactcttccaaaaacaaaaca。

2)免疫组化检测肿瘤组织mgmt表达方法同实施例1

图4.gbm患者mgmt和abcg2表达状况检测。病例1、2为入组临床试验gbm患者，肿瘤标本mgmt甲基化均阴性(a、b)，mgmt免疫组化阳性(d、e)，肿瘤组织标本同时表达abcg2(g、h)；病例3为排除临床试验gbm患者，肿瘤标本mgmt甲基化阳性(c)，mgmt免疫组化阴性(f)，肿瘤组织标本abcg2弱阳性(i)。

3)临床资料

治疗方案：初治患者在标准tmz同步放化疗期间予丙戊酸钠0.5gbid口服，尼卡地平40mgbid口服，续以28天为一周期的联合化疗：第1～5日：口服tmz200mg/m2/d；尼卡地平30mg缓慢泵注，用药期间控制收缩压不低于110mmhg；丙戊酸钠0.4g静脉推注q8h；试验6～28日：继续口服丙戊酸钠缓释片，0.5gbid。重复6个治疗周期，患者不能耐受或出现肿瘤快速进展时终止。

特别说明：本发明不限制医生治疗疾病的治疗方法。

2013年1月1日至2016年6月30日，14例患者入组该项临床研究，10例患者完成全部治疗且随访治疗完整，4例患者治疗过程中转回当地医院治疗后中断治疗方案。全部患者均已行开颅胶质瘤切除术，术后病理证实为gbm(whoiv级)。其中男性患者4例，女性患者6例，平均年龄52.9岁。

结果如图5显示本发明方案的靶向肿瘤干细胞治疗组生存期较标准治疗组为优。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的创造构思的前提下，还可以做出其它变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。