用于软组织再生促血管化的溶致液晶注射剂及其制备方法与流程

本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种用于软组织再生促血管化的溶致液晶注射剂及其制备方法。

背景技术：

由于外伤、先天畸形、手术等原因引起的软组织缺损，不仅影响患者的外观，对患者心理健康也会造成一定影响，严重者甚至损害机体功能。目前临床上主要采用皮瓣或者组织移植来进行软组织缺损的修补。但这类外科手术方法也有明显的不足，如操作复杂、费用昂贵、增加患者痛苦，且供区移植组织量有限，易产生免疫排斥反应和炎症反应等。因此，开发一种理想的软组织替代物在临床上有极大需求。

可注射水凝胶材料由于其微创、良好的生物相容性和生物可降解性，被广泛用于软组织再生研究。然而，这些材料注射进入体内后，面临的很大一个问题是血管化不足导致的组织坏死。目前已报导的诱导软组织材料血管化的方法很多，主要分以下几种：1)调节炎症反应，通过细胞激素来提高促血管生长的m2表型变化，比如白细胞介素、单核细胞驱化蛋白等；2)引入细胞因子，比如血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子等；3)间充质干细胞的移植；4)基因疗法引入血管内皮生长因子。在这些方法中，引入血管内皮细胞生长因子(vegf)是最直接、简单可行、能大规模生产的方法。

大量研究表明，这些具有促血管化效果的生长因子只有在释放出足够量以及足够长时间的条件下，才会诱导再生出功能化的血管网络。但是，简单的将将促血管生长因子和材料混合，药物很难得到时间空间上的控制。为了实现生长因子的缓释，通常有两种方式：物理包埋和化学结合。物理包埋一般是通过孵化将蛋白插入预成型的凝胶，或者将蛋白与凝胶单体混合来进行蛋白装载，后通过扩散作用、膨胀吸水、溶蚀作用等进行蛋白释放。化学结合是通过蛋白分子和凝胶功能性基团如羟基、胺基、羧基等的结合，将蛋白分子连接到凝胶上，后通过水解作用、氧化还原反应或酶促反应断开连接进而实现蛋白分子的释放。但是，化学结合的方法的合成过程十分复杂繁琐，在制备过程中也很可能对蛋白分子的生物活性造成影响，很难得到大规模的工业应用。

因此，为了弥补传统软组织再生手段在临床治疗中的各种不足，开发一种制备简单、可大规模生产的可注射凝胶，用于促血管化生长因子的控释，是十分必要的。

溶致液晶主要是由一种或多种两亲性化合物在溶剂中自组装形成的有序的体系。溶致液晶的形成主要依赖于两亲性分子间的相互作用，极性基团间的静电力和疏水基团间的范德华力。目前广泛研究的溶致液晶相主要有层状相、六角相和立方相。决定各相形成的因素主要有除了两亲性分子的结构，还有溶剂的含量和温度等。不同晶格结构的液晶晶相间的相互转换可通过改变液晶材料、溶剂种类以及调整组分含量等手段来实现。

溶致液晶前体溶液在室温下是流动性好粘度低的流体，当注射到皮下后，在生理环境中遇体液可以形成高粘度的立方液晶凝胶，并缓慢地释放药物，因此前体溶液可以作为原位凝胶广泛地应用于药物制剂领域。但是立方液晶的较小水通道(<4nm)严重限制它的进一步应用，由于很多蛋白质药物分子直径大于其水通道大小，难以释放，大部分研究只将其作为小分子化合物的载体，很少运用于大分子蛋白质类药物。目前还没有vegf溶致液晶运用于软组织再生促血管化的相关报道。

技术实现要素：

基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了本发明提供了一种用于软组织再生促血管化的溶致液晶注射剂。

具体技术方案如下：

一种溶致液晶注射剂的载体，其特征在于，按重量份数计，由以下原料制备得到：

脂质基质40～90份；

有机溶剂10～30份；

水化调节剂10～40份；

所述水化调节剂为辛基葡萄糖苷、己基-β-d-吡喃葡萄糖苷、十二烷基-β-d-麦芽糖苷蔗糖硬脂酸脂、胆固醇、聚甘油酯中的至少一种。

在其中一些实施例中，所述脂质基质、有机溶剂与水化调节剂的重量比为：(5～19)∶(2.5～9)∶1。

在其中一些实施例中，所述脂质基质为磷脂、单油酸甘油酯、植烷三醇、亚油酸单甘油酯、单棕榈油酸甘油酯、单反油酸甘油酯中的至少一种；和/或

所述有机溶剂为乙醇、丙二醇、peg300、n-甲基吡咯烷酮、n,n-二甲基乙酰胺、2-吡咯烷酮中的至少一种。

在其中一些实施例中，所述脂质基质为单油酸甘油酯，所述有机溶剂为乙醇或n,n-二甲基乙酰胺。

在其中一些实施例中，所述载体，按重量份数计，由以下原料制备得到：

单油酸甘油酯53～63.00份；

n,n-二甲基乙酰胺26～27.00份；

水化调节剂6～9.45份。

本发明的另一个目的还在于，提供上述溶质液晶注射剂的载体的应用，具体技术方案如下：

上述溶致液晶注射剂的载体在制备用于软组织再生促血管化的溶致液晶注射剂中的应用。

本发明的另一个目的还在于，提供一种用于软组织再生促血管化的溶致液晶注射剂，具体技术方案如下：

一种用于软组织再生促血管化的溶致液晶注射剂，由如上所述的载体与促进血管生长的细胞因子类药物制备而成。

在其中一些实施例中，所述促血管生长的细胞因子类药物为血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子、血管生成素-1、血管生成素-2、碱性成纤维细胞生长因子的至少一种。

在其中一些实施例中，所述促血管生长的细胞因子类药物在溶致液晶中的浓度为0.05μg/mg～10.00μg/mg。

本发明的另一个目的还在于，提供一种溶质液晶注射剂的制备方法，具体技术方案如下：

上述溶致液晶注射剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)将水化调节剂溶于有机溶剂中；

(2)将促血管生长的细胞因子类药物溶于水中；

(3)将熔融状态的脂质基质与用于有机溶剂的水化调节剂混合，形成液晶载体；

(4)将所述液晶载体与促血管生长的细胞因子类药物的水溶液混合，摇匀至澄清透明，即得。

基于上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：

(1)本发明的溶致液晶注射剂的载体，通过选用合适的水化调节剂及调节其比例，控制形成立方液晶凝胶模量与软组织类似，在释放药物的同时对缺损区域起到支撑作用。且形成凝胶拥有自愈力，在受到较大外力作用时，适应外力改变，成为类液体状态，减少对皮肤肌肉的刚性冲击；当外力撤销后，又可以自行恢复至正常凝胶维持形态。

(2)本发明的溶致液晶注射剂的载体，通过水化调节剂的扩孔，增大了立方液晶水通道的孔径，实现了血管内皮生长因子持续一周的缓释，延长了蛋白药物作用时间，可显著增强作用效力。

(3)本发明的用于软组织再生促血管化的溶致液晶注射剂，在室温下澄清透明、流动性好可注射，实现了微创治疗，大大提高患者顺应性，节约经济成本。

(4)本发明的用于软组织再生促血管化的溶致液晶注射剂具有良好的生物相容性，且立方液晶凝胶可被生物体内脂酶降解，降解产物人体可吸收，安全高效。

(5)本发明的用于软组织再生促血管化的溶致液晶注射剂制备方法简单，原材料廉价易得，可工业化大规模生产，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为实施例3前体溶液及凝胶外观图；

图2为实施例1～3及对比例1的小角散射图谱；

图3为实施例1～3及对比例1的流变学弹性模量；

图4为实施例3的自愈力图；

图5为实施例1～3及对比例1的血管内皮生长因子释放图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明如无特殊说明，原料均来源于市售。其中以下实施例中，使用的脂质基质为熔融脂质，优选使用单油酸甘油酯。

本发明以下实施例中各英文缩写表示的含义如下：

gmo：glycerinemonooleate，单油酸甘油酯。

dmac：dimethylacetamide，二甲基乙酰胺。

etoh：ethylalcohol，乙醇。

og：octylglucopyranoside，辛基葡萄糖苷。

peg400：polyethyleneglycol-400，聚乙二醇400。

实施例1～5、对比例1～4

本发明提供一种用于软组织再生促血管化的溶致液晶注射剂，实施例1～5、对比例1～4的组分如表1所示。

表1实施例1～5与对比例1～4处方组成

上述用于软组织再生促血管化的溶致液晶注射剂的制备方法如下：

实施例1～4

按照表1中实施例1～4的组成，将水化调节剂(其中实施例1～3为辛基葡萄糖苷og，实施例4为己基-β-d-吡喃葡萄糖苷)溶于n,n-二甲基乙酰胺(dmac)；将血管内皮生长因子溶于水溶液；将熔融脂质与辛基葡萄糖苷的n,n-二甲基乙酰胺溶液混合形成液晶载体；最后将液晶载体与血管内皮生长因子水溶液混合，摇匀至澄清透明，即得实施例1～4的溶致液晶前体溶液。

对比例1

对比例1为实施例1～4的对比例，其中不含有辛基葡萄糖苷(og)，直接将血管内皮生长因子溶于水溶液，将熔融脂质与n,n-二甲基乙酰胺溶液混合形成液晶载体；最后将液晶载体与血管内皮生长因子水溶液混合，摇匀至澄清透明，即得。

实施例5～6

按照表1中实施例5～6的组成，将辛基葡萄糖苷溶于乙醇(etoh)；将血管内皮生长因子溶于水溶液；将熔融脂质与辛基葡萄糖苷的乙醇溶液混合形成液晶载体；最后将液晶载体与血管内皮生长因子水溶液混合，摇匀至澄清透明，即得实施例5～6的溶致液晶前体溶液。

对比例2

对比例2为实施例5～6的对比例，其中不含有辛基葡萄糖苷(og)，直接将血管内皮生长因子溶于水溶液，将熔融脂质与乙醇溶液混合形成液晶载体；最后将液晶载体与血管内皮生长因子水溶液混合，摇匀至澄清透明，即得。

对比例3～4

按照表1中对比例3～4的组成，将熔融脂质与n,n-二甲基乙酰胺或乙醇混合，再加入peg400，形成液晶载体；将血管内皮生长因子溶于水溶液；最后将液晶载体与血管内皮生长因子水溶液混合，摇匀至澄清透明，即得对比例1～2的溶致液晶前体溶液。

实施例7

按照实施例3配制前体溶液，将前体溶液加入到玻璃瓶中，观察所得前体溶液在直立、倾斜、倒立状态下的形态特征。接着用移液枪向前体溶液里逐滴滴加pbs溶液，直至前体溶液恰好全部形成凝胶，在37℃放置24小时后观察所形成的凝胶在直立、倾斜、倒立状态下的形态特征。结果如图1所示，所制备的前体溶液在室温下呈现为澄清、透明、均一的溶液状态，具有较好的流动性。而形成凝胶之后，流动性较低，倾斜或者颠倒玻璃瓶，凝胶均难以流动。

实施例8

使用高通量小角x射线散射，确定实施例1～5及对比例1～4的溶致液晶所形成凝胶的晶格结构。测量前用铝箔包裹凝胶并固定在样品架上。pw3830型x射线发射器产生的cukα射线波长为0.1542nm(运行条件为50ma，40kv)，测试温度为37℃，样品曝光时间为10min。记录bragg峰与对应的q值。

saxs可以通过晶格结构的散射空间比例确定晶相。如下表2所示，不同的晶相对应不同的空间散射比例。

表2溶致液晶相对应的空间散射比

由下表3可知，saxs图谱可知晶格结构的散射空间比例，9个处方均符合菱形立方液晶pn3m的散射空间比例均为菱形立方液晶。其中，初始出峰位置与立方液晶孔径大小成正比，可知实施例1～6中，初始出峰位置较小，孔径增大，而对比例中peg400的加入则没有对孔径造成影响，图2为实施例1～3和对比例1的小角散射图谱。

表3实施例1～5与对比例1～4小角散射空间比例与对应晶相

实施例9

通过kinexuslab+旋转流变仪对实施例1～3及对比例1进行粘弹性测试(振荡测试)。测定温度为37±0.5℃，选用夹具型号为pu/25，间距0.75mm，施加应变值为0.5％，记录所成凝胶的动态弹性模量(g’)和损耗模量(g”)在不同频率(0.1～100hz)下的变化情况。

图3为实施例1～3及对比例1的弹性模量，可知对于不同的处方，随着处方中og含量的增高，处方的g’呈下降趋势。og含量从0％增加到15％，g’反应了材料的硬度，说明随着og含量的增高，所形成的凝胶的硬度在下降。说明og含量的增多，同样质量的前体溶液中，由于gmo含量减少，形成的立方液晶内部交联作用减弱，og含量的增高同时也会带来凝胶吸水性能的提升，共同导致凝胶结构更为松散。这也与前文中随着og含量的升高，所形成的立方液晶的孔径增大相对应。由文献可知，当凝胶模量约为1200pa时，更适宜血管的生长，实施例3处方的模量能基本满足此要求。

实施例10

通过kinexuslab+旋转流变仪对实施例3进行自愈力测试。测定温度为37±0.5℃，选用夹具型号为pu/25，间距0.75mm。施加应变值在0.5％→100％之间来回变换，每个应变值持续100s，总共循环3次。记录所成凝胶的动态弹性模量(g’)和损耗模量(g”)在不同频率(0.1～100hz)下的变化情况。

如图4所示，当施加应变在0.5％-100％之间变换时，实施例3所形成凝胶的弹性模量和粘性模量也在随之变化。当应变较小为0.5％时，弹性模量大于粘性模量，弹性行为占主导，表现为类固体状态；当应变较大为100％时，粘性行为占主导，表现为类液体状态。且当较大应变撤销后，凝胶在较小应变下，依然可以恢复类固体状态。这种在经受较大外力应变破坏后可自行恢复的能力，我们称之为自愈力。这种自愈力可以保证立方液晶在体内形成后，在未受到较大外力作用时，可以保持正常的凝胶状态维持形态；在收到较大外力作用时，会适应外力改变，成为类液体状态，减少对皮肤肌肉的刚性冲击；当外力撤销后，又可以自行恢复至正常凝胶维持形态。

实施例11

vegf溶致液晶的体外释放度测定方法如下。采用摇床法，恒温于37±0.5℃，振摇频率为100rpm，以1ml含0.1％bsa(w/w)的pbs溶液为释放介质，用枪头吸取约0.1g的vegf溶致液晶前体，滴入已置于24孔板的transwell小室之中(凝胶置于上室，释放介质置于下室)。在此释放装置中，凝胶浮于释放介质之上，单面与释放介质接触，并未直接接触大量释放介质，由于皮下组织并无大量水分，这种释放方式与前体溶液注射入皮下之后，体液缓慢渗入凝胶相类似。根据差重法，称量装有前体溶液的ep管和枪头在吸取vegf前体溶液前后的重量，相减即得滴入的溶致液晶前体质量，通过含药量可计算得总投药量。

从将vegf溶致液晶前体滴入释放介质中起计时，分别在释放6、12、24、48、72、120、168h取出全部释放介质，并补回等量1ml空白释放介质。取出的释放样品置于-20℃储存。待释放点取样完全后，将储存的样品解冻，恢复至室温，稀释后采用elisa法测定含量得浓度ct，根据以下公式计算，得到该点的累积释药量mt：

图5为实施例1～3及对比例1的vegf累积释放图。可见随着og含量的增加，vegf的体外累积释放量呈明显的上升趋势，由对比例1的9.18±0.18％，增加到实施例3的64.52±5.22％，约增大了7倍。原因是由于从对比例1到实施例3，处方中og含量在不断增加，相对于gmo，og的亲水性更强，能为留住更多的水分子，带来水通道的扩大，有利于vegf的扩散释放，同时，随着og的增加，gmo的相对含量也在降低，使整个体系更为松散，有利于vegf的释放，二者共同带来了vegf释放度的提升。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。