具有抗菌效果的药物及其应用的制作方法

本发明涉及本发明属于医药领域，特别是涉及一种具有抗菌效果的药物及其应用。

背景技术：

当今社会，细菌感染仍是引起人类发病和死亡的主要原因之一。但由于抗生素的广泛大量使用，导致致病菌对大部分抗生素产生耐药性，已成为一个严重的公共卫生问题。目前临床治疗细菌感染的方法主要有使用长时间、高剂量的广谱抗生素或混合抗生素治疗，这种方法可有效控制病情发展，但也可能产生更强耐药性的细菌。因此，寻找具有高效抗菌活性的新型抗菌策略，是科研和医学工作者的迫切研究议题。

金属药物因其多靶点结合的独特作用模式在抗菌新策略中发挥着重要作用(nat.rev.microbiol.,2013,11,371-384)。金属药物单独使用或与抗生素联用表现出极大的抗多重耐药菌的潜力，并可显著提高耐药菌感染的治愈率。金属抗菌剂通过与细菌内多种蛋白质/酶的结合发挥药效，通过细菌内活性氧物质增多引起的氧化压力、蛋白/酶功能失调、细胞膜损伤等途径发挥抗菌作用。与传统抗生素相比，金属化合物具有多靶点和延缓细菌产生耐药性等优点。

铋化合物作为药物已经有200多年的历史，与同族的砷和锑相比，其毒性低，被认为是一种对人体几乎无毒性的重金属。近年来，随着含铋药物如胶体枸橼酸铋(colloidalbismuthsubcitrate,cbs)、雷尼替丁枸橼酸铋(ranitidinebismuthcitrate,rbc)、碱式水杨酸铋(bismuthsubsalicylate,bbs)和胶态果胶铋(colloidalbismuthpectin,cbp)相继用于治疗胃溃疡、溃疡性结肠炎和消化不良等消化系统疾病，使得铋化合物在医药领域潜在应用的研究得到重视。近期研究结果表明，用于临床治疗细菌感染的铋剂与抗生素联用，可协同抑制携带ndm-1抗药因子的超级细菌(nat.commun.,2018,9,439)。

具有金属螯合及运输能力的小分子在金属失衡相关的疾病治疗中有广泛应用。桧木醇是从台湾扁柏树干中提取的一种具有卓酚酮骨架的单萜类天然化合物，具有诱导分化、良好的抗菌性、抗炎和抗氧化等多种生物活性。最新一项发表在科学杂志的研究成果表明，桧木醇可利用铁浓度梯度，调节铁在细胞内外的转运，能有效缓解由于铁转运蛋白功能缺失引起的生理失衡(science,2017,356,608-616)。

尽管含铋药物已成功应用于临床治疗幽门螺杆菌感染，但是含铋药物在广谱抗菌方面存抗菌效果低的弊端。因此，亟待研发一种能够高效抗菌的含铋药物。

技术实现要素：

基于此，本发明的目的是提供一种具有抗菌效果的药物，该药物能够高效抗菌。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种具有抗菌效果的药物，所述的药物的活性成分包括桧木醇和铋盐，或者，所述的药物的活性成分包括桧木醇和铋盐制备而成的铋化合物；该铋化合物的结构式如下式ⅰ所示：

在其中一些实施例中，所述的药物的活性成分包括桧木醇和铋盐。

在其中一些实施例中，所述的药物包括摩尔比为(1～25)：1的桧木醇和铋盐。

在其中一些实施例中，所述的药物包括摩尔比为(1～6):1的桧木醇和铋盐。

在其中一些实施例中，所述的药物包括摩尔比为(1～3):1的桧木醇和铋盐。

在其中一些实施例中，所述的铋盐为硝酸铋。

本发明的另一目的是提供一种上述的药物在制备防治细菌感染药物中的应用。

在其中一些实施例中，所述的细菌为金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、洋葱伯克霍尔德菌。

在其中一些实施例中，所述的细菌为金黄色葡萄球菌。

本发明的再一目的是提供一种防治细菌感染的药物，该药物的活性成分包括桧木醇和铋盐，或者，该药物的活性成分包括桧木醇和铋盐制备而成的铋化合物；该铋化合物的结构式如下式ⅰ所示：

与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：

本发明的药物，将桧木醇和铋盐联合使用，或者以桧木醇和铋盐制备而成的铋化合物为活性成分，使得桧木醇对铋离子能够产生协同增效作用，显著增强铋离子的抗菌效果。

附图说明

图1为实施例2的生物膜杀菌药物浓度设置及细菌存活率测试结果图；

图2为实施例3扫描电镜技术观测细菌形态图；

图3为实施例4桧木醇促进铋离子吸收检测图；

图4为实施例5不同浓度桧木醇与硝酸铋联用抗菌效果图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明选取五种具有铁螯合能力的小分子配体，桧木醇(hinokitiol)、麦芽酚(maltol)、去铁酮(deferiprone)、去铁斯若(deferasirox，dfx)及去铁敏(deferoxamine，dfo)，测试其对铋剂抗菌效果的影响。

并且，合成三个铋化合物，桧木醇铋(bi(hino)3)、麦芽酚铋(bi(ma)3)和去铁酮铋(bi(defe)3)。三种铋化合物采用类似的合成方法：将桧木醇、麦芽酚、去铁酮分别与硝酸铋混合，溶于丙酮-水混合溶剂中，在65℃水浴加热3小时后冷却至室温，抽滤，用丙酮洗涤两次，干燥过夜得相应铋化合物。

小分子配体及其合成的铋化合物结构式如下：

实施例1

本实施例测试单独加硝酸铋、三种铋化合物(分别用bi-hino、bi-deferiprone、bi-maltol表示)、及硝酸铋分别与五种配体联用(分别用bi+hino、bi+deferiprone、bi+maltol、bi+dfo、bi+dfx表示)，这几种待测抗菌药物的最小抑菌浓度(minimalinhibitconcentration，mic)和最小杀菌浓度(minimumbactericidalconcentration，mbc)。

其中，测试细菌为实验室标准菌，包括：金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureusnewman)，绿脓杆菌(pseudomonasaeruginosapao1)，大肠杆菌(escherichiacolik12)及洋葱伯克霍尔德菌(burkholderiacenocepaciaj2315)。

采用培养基微量稀释法测试mic及mbc值(参考文献nat.protocols,2008,3,163-175)：

将50μl待测抗菌药物提前加至96孔板。采用倍半稀释法设置10个铋剂浓度，使铋离子终浓度为256μm～0.5μm；加入配体的终浓度为50μm。

测试细菌于lb或tsb(培养金黄色葡萄球菌使用)基础培养基中培养，细菌长至对数期后(od600＝0.6～0.8)，根据生长曲线对od值与菌量(以cfu/ml为单位)的对应关系进行换算，用新鲜培养基稀释至菌密度为10⁶cfu/ml，取50μl菌液加入96孔板。

将96孔板静置于37℃培养箱培养16～20小时后，用酶标仪读取各孔的od600吸光值。根据od值进行判断，使细菌不生长的最小浓度即为药物的mic值。同时于高于mic浓度(含mic浓度)的各孔取10μl菌液，均匀涂于lb琼脂板，置于37℃培养箱过夜培养，使细菌不能在lb板上生长的最小浓度即为药物的mbc值。测得的mic及mbc值如下表1所示。

表1

表2、各小分子配体的mic(μm)

根据以上表1和表2的测试结果，在所有测试的配体中，桧木醇可显著增强铋离子的抗菌效果，铋-桧木醇化合物、铋与桧木醇联用，与单独使用硝酸铋比较，均可显著降低铋剂的mbc值。mbc与mic比值小于等于4可视为药物具有杀菌效果。据此标准，铋-桧木醇化合物、铋与桧木醇联用，对所测试细菌包括金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌及大肠杆菌，可视为具有杀菌效果。

根据本实施例结果可发现，天然化合物桧木醇更容易可显著增强铋离子的抗菌效果，特别是对金黄色葡萄球菌，硝酸铋单独使用对金黄色葡萄球菌无抑制效果(mic>256μm)，当加入桧木醇后(加入的桧木醇浓度为50μm，单独加入对细菌生长无影响)，铋离子最小抑菌浓度可降至2μm，最小杀菌浓度降至8μm，抗菌效果显著提升，并可视为具有杀菌作用。

实施例2

本实施例测试桧木醇与硝酸铋联用对以生物膜模式生长的金黄色葡萄球菌的抑制作用。首先建立金黄色葡萄球菌生物膜生长模型。

pe20导管处理及灭菌：将导管剪成1cm左右的小段，于酒精中浸泡1小时，之后在uv下消毒过夜。使用tsb+1％(m/v)glucose(葡萄糖)培养基进行实验。

取细菌单克隆点于5ml培养基静置过夜培养后，再1:1000稀释到50ml培养基，并把处理好的pe20导管一同放入培养基。

37℃静置培养48小时后，取出小管，在pbs中涮洗三次后放入24孔板。将以培养基(tsb+1％glucose)稀释的不同浓度的药物加入24孔板，每孔1ml。孔中药物为50μm桧木醇分别和浓度梯度为512μm至0.5μm的硝酸铋(倍半稀释)。37℃培养24小时后，取出小管用pbs涮洗三次，再分别将小管放入含500μlpbs的1.5ml离心管中，超声处理5分钟。随后进行稀释涂板，菌落计数。

本实施例中，实验药物浓度设置及培养24小时后24孔板中细菌生长情况见图1中a。单独50μmhino、单独512μmbi、8μmbi与50μmhino联用、16μmbi与50μmhino联用、32μmbi与50μmhino联用，将金黄色葡萄球菌加入24孔板中设置的这些待测抗菌药物之后，以生物膜模式生长的金黄色葡萄球菌存活率变化参见图1中b。由8μm硝酸铋浓度起，可检测到桧木醇与铋联用显著降低以生物膜模式生长的金黄色葡萄球菌的存活率。高浓度铋与桧木醇混合产生沉淀，但随铋浓度增大，仍检测到铋剂抗菌效果的提高；沉淀不影响铋剂的抗菌活性。

实施例3

本实施例通过扫描电镜技术观测细菌形态，判断药物抗菌效果。

参照实施例1的操作方法，将培养好的金黄色葡萄球菌加入单独含有50μm硝酸铋(bi)、50μm桧木醇与50μm硝酸铋联用(bi+hino)的待测抗菌药物中，同时以不加任何抗菌药物处理为对照(ck)，于金黄色葡萄球菌加入后8小时对菌体进行电镜扫描。

对绿脓杆菌进行同样的测试。

结果参见图2。根据图2可知，桧木醇与铋离子联用处理细菌8小时后，细菌呈严重受损形态。

实施例4

本实施例探究桧木醇对硝酸铋起到抗菌增效作用的机制。

参照实施例1的操作方法，将培养好的金黄色葡萄球菌分别加入到单独20μm硝酸铋(图3中“20bi”)、20μm硝酸铋和5μm桧木醇(图3中“20bi+5hino”)联用、20μm硝酸铋和20μm桧木醇(图3中“20bi+20hino”)联用、20μm硝酸铋和50μm桧木醇(图3中“20bi+50hino”)联用这几种待测抗菌药物中；同时，将培养好的绿脓杆菌分别加入到单独20μm硝酸铋(图3中“20bi”)、20μm硝酸铋和5μm桧木醇(图3中“20bi+5hino”)联用、20μm硝酸铋和20μm桧木醇(图3中“20bi+20hino”)联用这几种待测抗菌药物中；然后将各处理静置于37℃培养16～20小时。

参照常规操作，利用电感耦合等离子体质谱检测细菌中铋摄入量，利用cm-h2dcfda探针检测药物处理后细菌内活性氧自由基水平。结果见图3。

根据图3可知，加入桧木醇后，金黄色葡萄球菌对铋离子的吸收显著增加，且随着桧木醇浓度上升，金黄色葡萄球菌对铋离子的吸收也持续上升。此外，通过测试金黄色葡萄球菌中的活性氧自由基水平，可观测到桧木醇与硝酸铋联用，使细菌内活性氧自由基水平大幅度上升。因此桧木醇通过促进细菌对铋离子的吸收，并导致细菌内的活性氧自由基水平升高，可在一定程度上解释铋离子抗菌效果增强的机理。

实施例5

本实施例主要是在确定桧木醇与硝酸铋联合使用抑菌效果显著的基础上，进一步探索桧木醇与硝酸铋的较优的联合用量。

本实施例首先采用棋盘微量稀释法测试桧木醇(2～128μm)与硝酸铋(0.5～128μm)联用的抗菌效果。细菌的初始浓度为5×10⁵cfu/ml，分别加入不同浓度桧木醇(2～128μm)与硝酸铋(0.5～128μm)，于37℃静置培养16～20小时后，读取od600吸光值。实验结果见图4。

此外，将桧木醇与硝酸铋以不同的摩尔比联合使用(二者总摩尔浓度为25μm)，分别加至浓度为5×10⁵cfu/ml的绿脓杆菌、金黄葡萄球菌中37℃静置培养24小时后，稀释涂板对存活细菌进行计数，确定细菌存活率。同时，以单独使用桧木醇、单独使用硝酸铋为对照。实验结果参照表3。

表3

根据图4结果可知，在桧木醇存在下，硝酸铋抑制绿脓杆菌的mic值可降至4μm，抑制金黄色葡萄球菌的mic值可降至0.5μm。桧木醇与硝酸铋联用抑制绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌的部分抑菌浓度指数fici(计算方法为联合用药时各药的最小抑菌浓度mic值分别除以各药单用时mic值所得商之和)分别为0.094和0.035，表明二者联用具有协同效果(fici≤0.5)。根据表3可知，当二者联合使用终浓度相同(25μm)的条件下，桧木醇与硝酸铋的摩尔比为1:1和25:1时，抗菌效果好，这说明两种药物联用效果显著。进一步地，当二者的摩尔比分别为3:1、1:1时，抗菌效果更加显著，这说明在两种药物联用时，存在优选的搭配用量。

综上所述，本发明的药物，将桧木醇和铋盐联合使用，或者以桧木醇和铋盐制备而成的铋化合物为活性成分，使得桧木醇和铋离子协同作用，显著增强铋离子的抗菌效果。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。