一种蓝桉叶提取物及其提取方法和化妆品中的应用与流程

本发明涉及一种蓝桉叶提取物，以及该提取物的提取方法和其在化妆品领域的应用，具体为一种使用乙醇水溶液作为提取剂在一定条件下进行溶剂热提取，而后进行大孔树脂纯化的方法。该提取物具有美白和抗氧化功效，且没有强烈的不愉快气味，在化妆品领域有广阔的应用前景。

背景技术：

蓝桉(eucalyptusglobuluslabill.)是桃金娘科桉属大乔木，在我国种植广泛。其用途广泛，木材抗腐蚀性强，可用于造船；花可作为蜜源植物；叶含油量高，可制作白树油，具有杀菌作用。但是，其利用尚不完全，仍然有大量的蓝桉叶被废弃没有使用。

在目前的化妆品领域，蓝桉叶精油因其较强的杀菌作用而被广泛用作化妆品添加剂，但是由于精油的提取率低，且具有强烈的气味而限制了应用领域。此外，还曾有报道指出桉叶油会引起中毒症状，严重的还可能导致死亡。对某些敏感的人群，接触常用量也可引起皮炎。因此，寻找一种新的提取方法来得到新的蓝桉叶提取物来代替蓝桉叶精油有较高的经济价值。

蓝桉叶中除了有精油之外，还有黄酮等活性物质，这些物质具有水溶性或醇溶性，因此用一定浓度的乙醇水溶液可以将这些活性物质提取出来，之后再用大孔树脂进行活性物质的富集，去除杂质，提高提取物的有益功效。蓝桉叶在提取之前先进行水蒸气蒸馏除去精油成分，这样得到的提取物不含蓝桉叶精油，既有很好的有益活性，又能克服精油的毒副作用和不愉快气味等缺陷，将具有很好的应用前景。

更重要的是，蓝桉叶产量大、价格低，提取方法不使用有毒有害和贵重试剂，工艺容易实现，对设备仪器要求不高，能够实现大规模生产，带来较大的经济价值。此外，这方面的研究还未有报道，有较大的研究空间。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种蓝桉叶提取物及其提取方法和化妆品中的应用。

本发明解决其技术问题所采用的方案如下：

一种蓝桉叶提取物，其黄酮含量大于20％。

一种蓝桉叶提取物的提取方法，具体包括如下步骤：

步骤1、对蓝桉叶进行水蒸气蒸馏的预处理，除去蓝桉叶中的精油成分。

步骤2、将去除精油的蓝桉叶粉末中按照料液比1:10～1:30(g/ml)加入浓度为20％～80％的乙醇水溶液，在40～80℃条件下提取1～3次，每次提取30～120min。将提取液抽滤、浓缩即得褐色浓缩液。

步骤3、将大孔树脂填充于层析柱内，长度为层析柱总长的2/3。而后用大量水冲洗层析柱，直至流出液为无色透明。将步骤2提取的褐色浓缩液从层析柱上部滴入，下部流出液速度控制在3s/滴，直至下部流出液中出现淡黄色。静置吸附1h后，用大量去离子水冲洗层析柱，直至流出液为无色透明。

步骤4、用70％的乙醇水溶液冲洗层析柱，收集流出液，直至流出液为无色。将醇洗流出液合并、浓缩、干燥后即得褐色粉末。

作为优选，步骤2所述的料液比为1：20(g/ml)；

作为优选，步骤2所述的乙醇水溶液的浓度为40％；

作为优选，步骤2所述的在50℃条件下提取1次，每次提取30min；

作为优选，步骤2所述的将提取液抽滤、浓缩，具体实现如下：使用减压抽滤装置对提取液进行抽滤，收集滤液。滤液在55℃条件下进行减压蒸馏，直至滤液无醇味。

作为优选，步骤3所述的大孔树脂的型号为ab-8或lx-38；

本发明提取的蓝桉叶提取物具有美白功效和抗氧化功效，能够作为抗氧化剂剂和酪氨酸酶抑制剂应用在美白、抗氧化化妆品中，且所述化妆品剂型包括膏霜、乳液和水剂。

本发明提供的实验数据表明，本发明提供的蓝桉叶提取物对b16黑色素瘤细胞的酪氨酸酶有着良好的抑制作用，作用48h时抑制酪氨酸酶活性的ic50值仅为47.85ug/ml，显著优于阳性对照品熊果苷；体外抗氧化数据表明，蓝桉叶提取物的dpph和abts自由基清除能力的ic50值分别为16.59μg/ml和60.91μg/ml。与阳性对照物trolox相当。

本发明的有益效果是：

1、本发明提供一种蓝桉叶提取物。

2、本提取物没有强烈的不愉快气味。

3、本提取物具有美白和抗氧化功效，能够在化妆品领域有广泛应用。

4、本提取物原料蓝桉叶产量大、价格低，成本低廉。

5、本提取物的提取步骤少，提取条件温和，不使用有毒有害试剂，得到后可直接用于化妆品添加，适用于大规模生产，有广阔的应用前景。

附图说明

图1为蓝桉叶提取物对小鼠黑色素瘤b16细胞增殖活性的影响，阳性对照物熊果苷的浓度为320μg/ml。

图2为蓝桉叶提取物对小鼠黑色素瘤b16细胞酪氨酸酶活性的影响，阳性对照物熊果苷的浓度为320μg/ml。

图3为蓝桉叶提取物对abts自由基清除能力的影响，阳性对照物trolox的浓度为100μg/ml。

图4为蓝桉叶提取物对dpph自由基清除能力的影响，阳性对照物trolox的浓度为15μg/ml。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实例1：蓝桉叶提取物1

取10g去除精油后的蓝桉叶粉末，加入20％乙醇水溶液200ml(料液比1:20)，在60℃条件下提取60min。后经大孔树脂纯化后，浓缩、干燥，得褐色粉末1.053g，提取率10.53％，黄酮含量为22.40％。

实例2：蓝桉叶提取物2

取10g去除精油后的蓝桉叶粉末，加入80％乙醇水溶液200ml(料液比1:20)，在60℃条件下提取60min。后经大孔树脂纯化后，浓缩、干燥，得褐色粉末1.132g，提取率11.32％，黄酮含量为26.64％。

实例3：蓝桉叶提取物3

取10g去除精油后的蓝桉叶粉末，加入60％乙醇水溶液200ml(料液比1:20)，在40℃条件下提取60min。后经大孔树脂纯化后，浓缩、干燥，得褐色粉末1.031g，提取率11.32％，黄酮含量为23.90％。

实例4：蓝桉叶提取物4

取10g去除精油后的蓝桉叶粉末，加入60％乙醇水溶液200ml(料液比1:20)，在80℃条件下提取60min。后经大孔树脂纯化后，浓缩、干燥，得褐色粉末1.052g，提取率10.52％，黄酮含量为21.74％。

实例5：蓝桉叶提取物5

取10g去除精油后的蓝桉叶粉末，加入40％乙醇水溶液100ml(料液比1:10)，在60℃条件下提取60min。后经大孔树脂纯化后，浓缩、干燥，得褐色粉末1.104g，提取率11.04％，黄酮含量为23.77％。

实例6：蓝桉叶提取物6

取10g去除精油后的蓝桉叶粉末，加入40％乙醇水溶液300ml(料液比1:30)，在60℃条件下提取30min。后经大孔树脂纯化后，浓缩、干燥，得褐色粉末1.153g，提取率11.53％，黄酮含量为23.82％。

实例7：蓝桉叶提取物7

取10g去除精油后的蓝桉叶粉末，加入40％乙醇水溶液200ml(料液比1:20)，在60℃条件下提取30min。后经大孔树脂纯化后，浓缩、干燥，得褐色粉末0.951g，提取率9.51％，黄酮含量为22.79％。

实例8：蓝桉叶提取物8

取10g去除精油后的蓝桉叶粉末，加入40％乙醇水溶液200ml(料液比1:20)，在60℃条件下提取120min。后经大孔树脂纯化后，浓缩、干燥，得褐色粉末1.203g，提取率12.03％，黄酮含量为24.71％。

实例9：蓝桉叶提取物9

取10g去除精油后的蓝桉叶粉末，加入40％乙醇水溶液200ml(料液比1:20)，在60℃条件下提取120min，提取3次。后经大孔树脂纯化后，浓缩、干燥，得褐色粉末1.325g，提取率13.25％，黄酮含量为24.58％。

实例10：蓝桉叶提取物10

取10g去除精油后的蓝桉叶粉末，加入40％乙醇水溶液200ml(料液比1:20)，在50℃条件下提取30min。后经大孔树脂纯化后，浓缩、干燥，得褐色粉末1.254g，提取率12.54％，黄酮含量为25.00％。

实例11：蓝桉叶提取物对小鼠b16黑素瘤细胞存活率的影响

蓝桉叶提取物对小鼠b16黑素瘤细胞存活率的影响具体实验方法如下：

采用噻唑蓝(mtt)法检测蓝桉叶提取物对小鼠b16细胞增殖的影响，其目的在于找出一个合适的安全剂量范围。

(1)将蓝桉叶提取物用培养基配制成1000μg/ml的母液冻存备用。

(2)取对数生长期的细胞，用培养基调节成细胞密度至3.5×10⁴个/ml，将细胞接种于96孔板中，每孔100μl，37℃，5％co2饱和湿度环境下孵育24h。

(3)向检测组的培养孔中加入不同终浓度的蓝桉叶提取物，使每孔中蓝桉叶提取物的终浓度分别为：：12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、200μg/ml，并设立对照组：单纯培养基组、阳性药对照组(熊果苷，浓度：320μg/ml)，和空白对照组(培养基)，置于孵箱中作用48h。

(4)向每孔加20μl浓度为5mg/mlmtt溶液，在孵箱中作用4h后.小心吸除培养孔内的上清，再向每孔加入100μldmso，震荡10min，使结晶完全溶解后，放置于酶标仪上，选取检测波长为492nm，测定吸光度值，并计算细胞存活率，细胞存活率的计算公式如下：

蓝桉叶提取物在浓度12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、200μg/ml时使b16黑素瘤细胞的存活率分别为73.93％、59.75％、58.33％、50.96％、39.22％、46.89％、50.94％、39.33％。用graphpadprism5.0计算蓝桉叶提取物导致细胞存活率下降50％的抑制浓度(ic50)为68.96μg/ml。其中化妆品中常用美白剂熊果苷在浓度为320μg/ml时，细胞存活率为75.81％。说明蓝桉叶提取物可以添加到化妆品中使用。蓝桉叶提取物对小鼠b16黑素瘤细胞存活率的影响如图1所示。

实例12：蓝桉叶提取物对小鼠b16细胞酪氨酸酶活性的影响

蓝桉叶提取物对小鼠b16黑素瘤细胞酪氨酸酶活性的影响具体实验方法如下：

(1)蓝桉叶提取物溶液配制：用培养基配制成1000μg/ml的母液冻存备用。

(2)取对数生长期的细胞，用培养基调节成细胞密度至3.5×10⁴个/ml，将细胞接种于96孔板中，每孔100μl，37℃，5％co2饱和湿度环境下孵育24h。向检测组的培养孔中加入不同终浓度的蓝桉叶提取物，使每孔中蓝桉叶提取物的终浓度分别为：12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、200μg/ml，并设立对照组：单纯培养基组、阳性药对照组(熊果苷，浓度：320μg/ml)，和空白对照组(培养基)，置于孵箱中作用48h。

(3)吸去药液，用pbs洗2次后，每孔加1％tritonx-100溶液100μl，迅速放入-80℃冰箱冻存1h，随后移至室温下融化使细胞完全破裂、分解，在37℃预温后每孔加入0.1％l-dopa100μl，于37℃水浴2h，后置酶标仪下测a492，测定吸光度值，并计算细胞存活率，细胞存活率的计算公式如下：实验重复三次。

蓝桉叶提取物浓度在12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、200μg/ml时使b16黑素瘤细胞中酪氨酸酶的活性分别降低为70.99％、74.01％、43.84％、43.34％、42.62％、38.01％、37.08％、19.22％，用graphpadprism5.0计算蓝桉叶提取物浓度导致酪氨酸酶活性下降50％的抑制浓度(ic50)为47.85μg/ml。而具有较高美白活性的熊果苷在浓度为320μg/ml时，b16黑素瘤细胞中酪氨酸酶活性降低为41.68％。蓝桉叶提取物对小鼠b16黑素瘤细胞酪氨酸酶活性的影响结果如图2所示。

实例13：蓝桉叶提取物对abts自由基清除实验

abts自由基清除率具体实验方法如下：准确吸取0.2ml样品溶液，加入7.8mlabts自由基工作液，混匀后在室温下(25℃)避光静置10min，测定734nm处的吸光值，计算清除率，以清除率为y、trolox溶液浓度(μg/ml)为x制作标准曲线。

y＝(a0-a1-a2)/a0*100％

y—清除率，％

a0—0.2ml蒸馏水+7.8mlabts自由基工作液的吸光度

a1—0.2ml样品/trolox标准液+abts自由基工作液的吸光度

a2—0.2ml样品/trolox标准液+乙醇溶液的吸光度(消除不同样品之间颜色的误差)

以trolox标准工作液为阳性对照，以无水乙醇为空白对照。

当蓝桉叶提取物浓度为20μg/ml时，其对abts自由基的清除率为4.54％，当浓度为100μg/ml，清除率为73.26％，因此，在20～100μg/ml范围内，蓝桉叶提取物对dpph自由基的清除率随着浓度的增加而增加。用origin作拟合曲线，可得ic50值分别为60.91μg/ml，与阳性对照物trolox相当。蓝桉叶提取物的abts自由基清除能力随浓度的变化如图3所示。

实例14：蓝桉叶提取物对dpph自由基清除实验

dpph自由基清除率具体实验方法如下：准确吸取1ml样品溶液，加入5mldpph溶液，混匀后在室温下(25℃)避光静置30min，测定517nm处的吸光值，计算清除率，以清除率为y、trolox溶液浓度(μg/ml)为x制作标准曲线。

y＝(a0-a1-a2)/a0*100％

y—清除率，％

a0—1ml蒸馏水+5mldpph溶液的吸光度

a1—1ml样品/trolox标准液+5mldpph溶液的吸光度

a2—1ml样品/trolox标准液+乙醇溶液的吸光度(消除不同样品之间颜色的误差)

以trolox标准工作液为阳性对照，以无水乙醇为空白对照。

当蓝桉叶提取物浓度为10μg/ml时，其对dpph自由基的清除率为22.9％，当浓度为25μg/ml，清除率为72.76％，因此，在10～25μg/ml范围内，蓝桉叶提取物对dpph自由基的清除率随着浓度的增加而增加。用origin作拟合曲线，可得ic50值分别为16.59μg/ml，与阳性对照物trolox相当。蓝桉叶提取物对dpph自由基清除能力随浓度的变化如图4所示。