本发明涉及制药领域，尤其涉及一种集靶向、光热于一体的红细胞仿生型纳米粒的制备方法。
背景技术
癌症（恶性肿瘤）是严重危害人类健康的难治疾病之一，每年都具有较高的发病率和死亡率。因此，对于肿瘤形成及治疗方法的研究，目前己经成为研究人员的研究重点和热点。聚合物纳米粒子由于其具有优良的生物相容性和降解性、较高的载药量和药物递送效率、良好的循环稳定性等特点，因此，现如今聚合物纳米粒子被广泛应用于药物递送系统。
然而传统的纳米粒容易与蛋白质、脂质或其他生物分子粘附结合形成“蛋白质环”从而影响它在体内的行为，若与血清蛋白结合则会引起吞噬细胞的识别和吞噬，导致纳米粒在血液中被快速清除，不但减弱其抗肿瘤效果，有些纳米材料还具有潜在细胞或基因毒性。红细胞膜作为新型纳米递药载体具有独特的优势，具有安全，生物兼容性高，体内可降解等特点，最重要的是红细胞膜上含有cd47蛋白，此蛋白与信号调节蛋白-α（sirp-α）受体作用可避免巨噬细胞的吞噬，基于这一点我们可将其应用于抗肿瘤纳米递药系统的研究。用红细胞膜包裹抗肿瘤纳米粒制作成为红细胞仿生型纳米粒，因为红细胞膜的独特优势红细胞仿生型纳米粒在体内可逃脱免疫系统的监视，避免被肝脾网状内皮系统清除，达到体内长循环效果，进而可增加纳米粒在肿瘤组织部位的蓄积，增强纳米粒抗肿瘤效果。可以进一步保护机体正常组织免受抗肿瘤药物的损伤。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种集靶向、光热于一体的红细胞仿生型纳米粒的制备方法。本发明首先提取得到红细胞膜，然后将吲哚菁绿负载在聚乳酸-羟基乙酸溶液上，将阿霉素包埋于上述体系，通过二次乳化-溶剂挥发法制得包埋有阿霉素的吲哚菁绿-聚乳酸-羟基乙酸纳米溶液；之后通过将叶酸壳寡糖与阿霉素-吲哚菁绿-聚乳酸-羟基乙酸纳米溶液反应得到阿霉素-叶酸壳寡糖-吲哚菁绿-聚乳酸-羟基乙酸纳米溶液；最后将阿霉素-叶酸壳寡糖-吲哚菁绿-聚乳酸-羟基乙酸挤压进入红细胞膜，即可得到红细胞仿生型纳米粒。
本发明的具体技术方案为：一种集靶向、光热于一体的红细胞仿生型纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
1)取6~8周大小的icr小鼠数只，使用毛细管进行眼球取血并在血中加入肝素抗凝，得到的全血在1-5℃，1500-2500r/min下离心8-12min后去除上层的血清和其他血细胞层，得到的红细胞沉淀用冷处理后的1×pbs洗涤3~5次，备用。
在步骤1）中，加入肝素可以加强抗凝血酶灭活丝氨酸蛋白酶作用，阻止凝血酶的形成，并阻止血小板聚集等，从而阻止血液凝固；采用1×pbs洗涤红细胞沉淀作用在于调整适宜的ph缓冲，保证生物活性物质保持其最完整的特性。
2）向步骤1）得到的红细胞沉淀中加入相当于红细胞沉淀55-65倍体积的冷处理后的0.25×pbs低渗2~3h，接着在9000-11000r/min下离心15~20min，弃去上层液体，下层淡粉色的沉淀即为红细胞膜，再用0.25×pbs反复洗涤3~5次使得提取的红细胞膜更为纯净，备用。
在步骤2）中，采用0.25×pbs洗涤红细胞膜作用在于调整适宜的ph缓冲，保证生物活性物质保持其最完整的特性。
3）将阿霉素溶于水中，配制得到浓度为4-6wt%的阿霉素溶液；将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于二氯甲烷中，配制成浓度为1.5-2.5wt%的聚乳酸-羟基乙酸溶液；将聚多巴胺溶于水中，配制成浓度为2.5-3.5wt%的聚多巴胺溶液；将所有溶液置于1-5℃的环境中预冷，备用。
在步骤3）中，将所有溶液置于冰箱中预冷，作用在于减少在乳化过程中温度升高对制备过程的影响。
4)取2~2.5mg吲哚菁绿加入至3~5ml聚乳酸-羟基乙酸溶液中，充分混匀，得到吲哚菁绿-聚乳酸-羟基乙酸溶液，备用。
在步骤4）中，将吲哚菁绿包裹于聚乳酸-羟基乙酸中，使其在经近红外光照射下，能产生光热效应。
5）取600~700μl阿霉素溶液加入到3~5ml吲哚菁绿-聚乳酸-羟基乙酸溶液中，超声乳化30~40s，制得w/o初乳，备用。
在步骤5）中，成功将抗癌药物阿霉素负载到吲哚菁绿-聚乳酸-羟基乙酸上。
6）将w/o初乳立即转移到6~10ml聚多巴胺溶液中，超声30~40s，制得w/o/w复乳液，备用。
在步骤6）中，聚多巴胺溶液作为分散剂，聚多巴胺具有良好的亲水性、稳定性和生物相容性，可用于聚合物粒子在溶液中的分散。
7）将w/o/w复乳液逐滴加入到40~50ml水中，搅拌，陈化3~4h，待有机溶剂挥发完全后，将得到的纳米粒溶液以800-1200r/min离心去除大颗粒，再用0.45μm的微孔滤膜过滤，得阿霉素-吲哚菁绿-聚乳酸-羟基乙酸纳米粒溶液，备用。
8）称取叶酸220~225mg，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐192~197mg，加入至30~40ml的0.1mol/l氢氧化钠溶液中，搅拌完全溶解，称取525~530mg壳寡糖，搅拌下加入叶酸溶液，避光反应3~5h，备用。
在步骤8）中，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐作为一种交联剂，作用在于对叶酸表面的端羧基进行活化，使其与壳寡糖上的氨基连接。
9）向步骤8）得到的反应液中加入0.1mol/l的盐酸溶液，调节其ph值至6.8-7.2，滴加过程中可见溶液逐渐变浑浊，有沉淀析出；将反应液抽滤2-4次，去除沉淀，得到滤液，将其置于透析袋中，透析20-30h后将其冻干得到黄色海绵状固体，即叶酸壳寡糖，备用。
在步骤9）中，加入盐酸以调节溶液ph，使其呈现中性。
10）称取30~35mg叶酸壳寡糖和16~18mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，溶于10~15ml去离子水中，将其加入到步骤7）得到的阿霉素-吲哚菁绿-聚乳酸-羟基乙酸纳米粒溶液中，室温下反应3~5h后，用0.45μm的微孔滤膜过滤即得阿霉素-叶酸壳寡糖-吲哚菁绿-聚乳酸-羟基乙酸纳米混悬液，备用。
在步骤10）中，将叶酸壳寡糖连接在纳米粒子上，从而实现主动靶向，并介导纳米粒子靶向进胞。其中，加入带正电及生物相容性好的壳寡糖对带负电荷的肿瘤细胞有好的粘附性能。
11）将步骤10）得到的纳米混悬液在1-5℃下离心，去除上清液，沉淀用去离子水洗涤3~5次，即得到阿霉素-叶酸壳寡糖-吲哚菁绿-聚乳酸-羟基乙酸纳米溶液，备用。
12）将步骤2）得到的红细胞膜用1×pbs按照全血体积重悬后水浴超声2~3min，再利用挤出仪分别通过400nm和200nm的聚碳酸酯多孔膜挤出，得到的细胞膜悬液与步骤11）得到的阿霉素-叶酸壳寡糖-吲哚菁绿-聚乳酸-羟基乙酸纳米粒溶液以1.8-2.2:1的体积比混合均匀后，共同通过200nm的膜混匀反复挤出至少8次，得到红细胞仿生型纳米粒，通过离心去除上层未包裹的多余细胞膜，即可得到纯净的红细胞仿生型纳米粒。
在步骤12）中，采用挤压法使得纳米粒子溶液成功进入红细胞膜，得到纯净的红细胞仿生型纳米粒。
作为优选，步骤3）中，制备所得的溶液均置于4℃的冰箱中预冷。
作为优选，步骤5）、6）中，超声乳化功率为500~600w。
作为优选，步骤7）中，搅拌速度为300-500r/min。
作为优选，步骤11）中，离心处理转速为16000~18000r/min，离心时间为15~20min。
作为优选，步骤12）中，超声功率为64w，超声频率为50khz。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：
1.在步骤1）、2）中，成功提取了一种红细胞膜使其作为新型纳米递药载体，具有安全，生物兼容性高，体内可降解等特点，最重要的是红细胞膜上含有cd47蛋白，此蛋白与信号调节蛋白-α（sirp-α）受体作用可避免巨噬细胞的吞。
2.在步骤3）中，将所有溶液置于4℃的冰箱中预冷，以减少在乳化过程中温度升高对制备过程的影响。以聚乳酸-羟基乙酸作载体可延长药物的作用时间。
3.在步骤4）中，将吲哚菁绿包裹于聚乳酸-羟基乙酸，吲哚菁绿是一种近红外染料，可优先聚集在肿瘤细胞内。在近红外线的照射下，使其实现光能和热能的转化，从而杀伤肿瘤细胞，将其包裹于聚乳酸-羟基乙酸内，在经近红外光照射下，仍能产生ptt和pdt效应。
4.在步骤3）中，通过将抗癌药阿霉素溶解于去离子水中并充分搅拌使其分散均匀，增强其在后期的包封率以及稳定性。
5.在步骤6）中，聚多巴胺具有良好的亲水性、稳定性和生物相容性，可用于聚合物粒子在溶液中的分散。
6.在步骤8）中，壳寡糖是壳聚糖的降解产物，分子量较小，保持壳聚糖带正电及生物相容性好的特点，同时具有较好的水溶性，通过将壳寡糖和叶酸结合得到叶酸壳寡糖。
7.在步骤10）中，以叶酸壳寡糖为靶向配体，实现纳米粒子的主动靶向的同时修饰改变纳米载体的表面电性，增加载体对肿瘤细胞的粘附性。
8.在步骤12）中，通过使纳米粒子溶液成功进入红细胞膜，得到纯净的红细胞仿生型纳米粒。红细胞仿生型纳米粒在体内可逃脱免疫系统的监视，避免被肝脾网状内皮系统清除，达到体内长循环效果，进而可增加纳米粒在肿瘤组织部位的蓄积，增强纳米粒抗肿瘤效果。可以进一步保护机体正常组织免受抗肿瘤药物的损伤。
9.在发明中，通过制备一种集靶向、光热于一体的红细胞仿生型纳米粒，有望实现高效的肿瘤热疗和靶向为一体的治疗手段，增加药物的稳定性，实现主动靶向性，增加与受体的结合能力，从而大大提升对癌细胞的治疗效果。
10.在发明中，通过构建一种安全，无毒性，并且能够高效运输光敏剂的药物载体，能够提高药物的稳定性，便于贮存。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
1)取6周大小的icr小鼠数只，使用毛细管进行眼球取血并在血中加入肝素抗凝，得到的全血在4℃，2000r/min离心10min后去除上层的血清和其他血细胞层，得到的红细胞沉淀用冷的1×pbs洗涤3次，备用；
2）向步骤1）得到的红细胞沉淀中加入相当于红细胞沉淀60倍体积的冷的0.25×pbs低渗2h。接着在10000r/min下离心15min，弃去上层液体，下层淡粉色的沉淀即为红细胞膜，再用0.25×pbs反复洗涤3次使得提取的红细胞膜更为纯净，备用；
3）将阿霉素溶于水中，配制得到浓度为5%的阿霉素溶液；将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于二氯甲烷中，配制成浓度为2%的聚乳酸-羟基乙酸溶液；将作为分散剂的聚多巴胺溶于水中，配制成浓度为3%的聚多巴胺溶液；将所有溶液置于4℃的冰箱中预冷，备用；
4)取2mg吲哚菁绿加入步骤1）得到的3ml聚乳酸-羟基乙酸溶液中，使其充分混匀，得到吲哚菁绿-聚乳酸-羟基乙酸溶液，备用；
5）取600μl步骤3）得到的阿霉素溶液加入到步骤4）得到的3ml吲哚菁绿-聚乳酸-羟基乙酸溶液，使用超声乳化仪超声30s，制得w/o初乳，备用；
6）将步骤5）得到的初乳立即转移到6ml聚多巴胺溶液中，超声30s，制得w/o/w复乳液，备用；
7）将步骤6）得到的乳液逐滴加入到40ml水中，磁力搅拌，陈化3h，待有机溶剂挥发完全后，将得到的纳米粒溶液以1000r/min离心去除大颗粒，再用0.45μm的微孔滤膜过滤即得阿霉素-吲哚菁绿-聚乳酸-羟基乙酸纳米粒溶液，备用；
8）称取叶酸220mg，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐192mg，加入30ml0.1mol/l氢氧化钠溶液，搅拌使其完全溶解，称取525mg壳寡糖，搅拌下加入叶酸溶液，避光反应3h，备用；
9）向步骤8）得到的反应液中加入0.1mol/l的盐酸溶液，调节其ph值至7，滴加过程中可见溶液逐渐变浑浊，有沉淀析出。将反应液抽滤3次，去除沉淀，得到滤液，将其置于透析袋中，透析24h后将其冻干得到黄色海绵状固体，即叶酸壳寡糖，备用；
10）称取30mg步骤9）得到的叶酸壳寡糖和16mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，溶于10ml去离子水中，将其加入到步骤7）得到的阿霉素-吲哚菁绿-聚乳酸-羟基乙酸纳米粒溶液中，室温下反应3h后，用0.45μm的微孔滤膜过滤即得阿霉素-叶酸壳寡糖-吲哚菁绿-聚乳酸-羟基乙酸纳米混悬液，备用；
11）将步骤10）得到的纳米混悬液在4℃下16000r/min离心20min，去除上清液，沉淀用去离子水洗涤3次，即可得到阿霉素-叶酸壳寡糖-吲哚菁绿-聚乳酸-羟基乙酸纳米溶液，备用；
12）将步骤2）得到的红细胞膜用1×pbs按照全血体积重悬后水浴超声2min，再利用挤出仪分别通过400nm和200nm的聚碳酸酯多孔膜挤出，得到的细胞膜悬液与步骤11）得到的阿霉素-叶酸壳寡糖-吲哚菁绿-聚乳酸-羟基乙酸纳米粒溶液以2:1的体积比混合均匀后，共同通过200nm的膜混匀反复挤出至少8次，得到红细胞仿生型纳米粒，通过离心去除上层未包裹的多余细胞膜，即可得到纯净的红细胞仿生型纳米粒。
实施例2
1)取7周大小的icr小鼠数只，使用毛细管进行眼球取血并在血中加入肝素抗凝，得到的全血在4℃，2000r/min离心10min后去除上层的血清和其他血细胞层，得到的红细胞沉淀用冷的1×pbs洗涤4次，备用；
2）向步骤1）得到的红细胞沉淀中加入相当于红细胞沉淀60倍体积的冷的0.25×pbs低渗2.5h。接着在10000r/min下离心17min，弃去上层液体，下层淡粉色的沉淀即为红细胞膜，再用0.25×pbs反复洗涤4次使得提取的红细胞膜更为纯净，备用；
3）将阿霉素溶于水中，配制得到浓度为5%的阿霉素溶液；将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于二氯甲烷中，配制成浓度为2%的聚乳酸-羟基乙酸溶液；将作为分散剂的聚多巴胺溶于水中，配制成浓度为3%的聚多巴胺溶液；将所有溶液置于4℃的冰箱中预冷，备用；
4)取2.3mg吲哚菁绿加入步骤1）得到的4ml聚乳酸-羟基乙酸溶液中，使其充分混匀，得到吲哚菁绿-聚乳酸-羟基乙酸溶液，备用；
5）取650μl步骤3）得到的阿霉素溶液加入到步骤4）得到的4ml吲哚菁绿-聚乳酸-羟基乙酸溶液，使用超声乳化仪超声35s，制得w/o初乳，备用；
6）将步骤5）得到的初乳立即转移到8ml聚多巴胺溶液中，超声35s，制得w/o/w复乳液，备用；
7）将步骤6）得到的乳液逐滴加入到45ml水中，磁力搅拌，陈化3.5h，待有机溶剂挥发完全后，将得到的纳米粒溶液以1000r/min离心去除大颗粒，再用0.45μm的微孔滤膜过滤即得阿霉素-吲哚菁绿-聚乳酸-羟基乙酸纳米粒溶液，备用；
8）称取叶酸223mg，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐195mg，加入35ml0.1mol/l氢氧化钠溶液，搅拌使其完全溶解，称取527mg壳寡糖，搅拌下加入叶酸溶液，避光反应4h，备用；
9）向步骤8）得到的反应液中加入0.1mol/l的盐酸溶液，调节其ph值至7，滴加过程中可见溶液逐渐变浑浊，有沉淀析出。将反应液抽滤3次，去除沉淀，得到滤液，将其置于透析袋中，透析24h后将其冻干得到黄色海绵状固体，即叶酸壳寡糖，备用；
10）称取33mg步骤9）得到的叶酸壳寡糖和17mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，溶于13ml去离子水中，将其加入到步骤7）得到的阿霉素-吲哚菁绿-聚乳酸-羟基乙酸纳米粒溶液中，室温下反应4h后，用0.45μm的微孔滤膜过滤即得阿霉素-叶酸壳寡糖-吲哚菁绿-聚乳酸-羟基乙酸纳米混悬液，备用；
11）将步骤10）得到的纳米混悬液在4℃下16000r/min离心23min，去除上清液，沉淀用去离子水洗涤4次，即可得到阿霉素-叶酸壳寡糖-吲哚菁绿-聚乳酸-羟基乙酸纳米溶液，备用；
12）将步骤2）得到的红细胞膜用1×pbs按照全血体积重悬后水浴超声2min，再利用挤出仪分别通过400nm和200nm的聚碳酸酯多孔膜挤出，得到的细胞膜悬液与步骤11）得到的阿霉素-叶酸壳寡糖-吲哚菁绿-聚乳酸-羟基乙酸纳米粒溶液以2:1的体积比混合均匀后，共同通过200nm的膜混匀反复挤出至少8次，得到红细胞仿生型纳米粒，通过离心去除上层未包裹的多余细胞膜，即可得到纯净的红细胞仿生型纳米粒。
实施例3
1)取8周大小的icr小鼠数只，使用毛细管进行眼球取血并在血中加入肝素抗凝，得到的全血在4℃，2000r/min离心10min后去除上层的血清和其他血细胞层，得到的红细胞沉淀用冷的1×pbs洗涤5次，备用；
2）向步骤1）得到的红细胞沉淀中加入相当于红细胞沉淀60倍体积的冷的0.25×pbs低渗3h。接着在10000r/min下离心20min，弃去上层液体，下层淡粉色的沉淀即为红细胞膜，再用0.25×pbs反复洗涤5次使得提取的红细胞膜更为纯净，备用；
3）将阿霉素溶于水中，配制得到浓度为5%的阿霉素溶液；将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于二氯甲烷中，配制成浓度为2%的聚乳酸-羟基乙酸溶液；将作为分散剂的聚多巴胺溶于水中，配制成浓度为3%的聚多巴胺溶液；将所有溶液置于4℃的冰箱中预冷，备用；
4)取2.5mg吲哚菁绿加入步骤1）得到的5ml聚乳酸-羟基乙酸溶液中，使其充分混匀，得到吲哚菁绿-聚乳酸-羟基乙酸溶液，备用；
5）取700μl步骤3）得到的阿霉素溶液加入到步骤4）得到的5ml吲哚菁绿-聚乳酸-羟基乙酸溶液，使用超声乳化仪超声40s，制得w/o初乳，备用；
6）将步骤5）得到的初乳立即转移到10ml聚多巴胺溶液中，超声40s，制得w/o/w复乳液，备用；
7）将步骤6）得到的乳液逐滴加入到50ml水中，磁力搅拌，陈化4h，待有机溶剂挥发完全后，将得到的纳米粒溶液以1000r/min离心去除大颗粒，再用0.45μm的微孔滤膜过滤即得阿霉素-吲哚菁绿-聚乳酸-羟基乙酸纳米粒溶液，备用；
8）称取叶酸225mg，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐197mg，加入40ml0.1mol/l氢氧化钠溶液，搅拌使其完全溶解，称取530mg壳寡糖，搅拌下加入叶酸溶液，避光反应5h，备用；
9）向步骤8）得到的反应液中加入0.1mol/l的盐酸溶液，调节其ph值至7，滴加过程中可见溶液逐渐变浑浊，有沉淀析出。将反应液抽滤3次，去除沉淀，得到滤液，将其置于透析袋中，透析24h后将其冻干得到黄色海绵状固体，即叶酸壳寡糖，备用；
10）称取35mg步骤9）得到的叶酸壳寡糖和18mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，溶于15ml去离子水中，将其加入到步骤7）得到的阿霉素-吲哚菁绿-聚乳酸-羟基乙酸纳米粒溶液中，室温下反应5h后，用0.45μm的微孔滤膜过滤即得阿霉素-叶酸壳寡糖-吲哚菁绿-聚乳酸-羟基乙酸纳米混悬液，备用；
11）将步骤10）得到的纳米混悬液在4℃下16000r/min离心25min，去除上清液，沉淀用去离子水洗涤5次，即可得到阿霉素-叶酸壳寡糖-吲哚菁绿-聚乳酸-羟基乙酸纳米溶液，备用；
12）将步骤2）得到的红细胞膜用1×pbs按照全血体积重悬后水浴超声3min，再利用挤出仪分别通过400nm和200nm的聚碳酸酯多孔膜挤出，得到的细胞膜悬液与步骤11）得到的阿霉素-叶酸壳寡糖-吲哚菁绿-聚乳酸-羟基乙酸纳米粒溶液以2:1的体积比混合均匀后，共同通过200nm的膜混匀反复挤出至少8次，得到红细胞仿生型纳米粒，通过离心去除上层未包裹的多余细胞膜，即可得到纯净的红细胞仿生型纳米粒。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。