一种靶向介孔聚多巴胺多功能纳米诊疗剂及其制备方法与应用与流程

本发明属于生物医学材料领域，具体地说，涉及一种靶向介孔聚多巴胺多功能纳米诊疗剂及其制备方法。

背景技术：

癌症是目前危害人类健康的主要疾病之一。全世界每年新增癌症患者约1400万例，死亡约820万例。我国每年新发癌症约350万例，死亡约250万例。由于社会人口结构的老龄化、环境的污染以及吸烟等不健康生活行为的影响，我国癌症的形势越来越严峻，癌症的治疗面临着巨大的挑战。因此，发展生物相容性好且兼具诊断、监控、治疗等功能的诊疗剂具有重要的临床应用价值。

瑞戈非尼（regorafenib，rf）由拜耳公司发现并开发，化学名为n-（4-氯-3-（三氟甲基）苯基）-n-2-氟-（4-（2-（n-甲基氨甲酰基）-4-吡啶氧基）苯基）脲，是一种新型的多激酶抑制剂，能够阻断促进肿瘤生长的多种酶，是一种有效的抗癌和抗血管生成剂。瑞戈非尼可抑制多种蛋白激酶的活性，包括对vegfr、pdgfr、raf、p38和flt-3激酶信号分子的抑制活性，瑞戈非尼已获批用于治疗晚期结直肠癌、胃肠间质瘤和肝细胞癌。但是瑞戈非尼几乎不溶于水，一般难溶性药物的口服生物利用度较低，提高药物的溶出度是改善生物利用度的有效途径。

在临床治疗中，药物的低毒和高效一直是研究的难点，化疗是临床上治疗癌症的主要手段，但是目前传统的化疗药物缺乏靶向性，在杀伤肿瘤细胞的同时也会对正常细胞产生毒性，引起的毒副作用使患者不能耐受。因此，构建能靶向肿瘤组织的药物载体是解决肿瘤化疗问题的有效途径。近年来，叶酸受体作为抗肿瘤药物的靶点受到了极大的关注，成为新型抗肿瘤药物研究的热点之一。叶酸是小分子量维生素，相对于单分子抗体等蛋白质，具有结构稳定、价格低廉、无免疫原性等特点。研究发现，叶酸受体在绝大多数恶性肿瘤细胞膜内都过度表达，而正常细胞则很少表达甚至不表达，而且叶酸与叶酸受体结合力强，能被高效介导进入肿瘤细胞。基于这种特性，可以将叶酸偶联到药物载体上，如脂质体、胶束、纳米粒、乳剂、聚合物囊泡等，实现主动靶向运输。

聚多巴胺（pda）是天然生物色素-黑色素的主要成分，该粒子具有良好的稳定性、生物可降解性、生物相容性和光热转换特性，是一种比较理想的载体材料，但pda作为一种实心球形纳米粒子，对于疏水性药物的负载，其载药量及包封率并不高。作为pda材料中的一类新材料，介孔聚多巴胺（mesoporouspolydopamine,mpda）因其具有孔道结构、较高比表面积、高光热转换效率和优良生物相容性且制备工艺简单、成本低廉、等优势而引起人们的关注。此外，mpda具有固有的金属离子螯合属性及广谱光吸收特性成为一种新兴材料，目前尚无该材料在医学成像和诊疗剂中的应用报道。

为了提高化疗效果，需要在治疗前确认肿瘤在体内的大小和位置，并且对治疗过程进行监测。核磁共振成像（mri）是一种无创的成像方式，具有可同时获得解剖及生理信息等功能，且分辨率较高，广泛应用于诊疗领域中。目前在临床上，t1加权造影剂比t2加权造影剂具有更多的优势，例如一些黑点的产生很难区分是由于t2造影剂的作用还是由血液的钙化，金属的沉积，或者是其他的一些背底信号引起的。目前用于临床的t1造影剂是马根维显（gd-dtpa），但最近美国食品与药品监督管理局警示，使用钆造影剂会引起一些肾脏和肝脏等的疾病等，对人体存在一定的危害，所以发展新型低毒造影剂是非常必要的。锰作为t1造影剂受到了极大的关注，最新研究发现，它不仅能进行t1成像，在t2成像上也有一定的成像效果。但是锰造影剂在体内循环的过程中大多缺乏靶向性。所以寻找一种具有靶向性的高效锰造影剂，推动其临床化应用是非常有意义的。

本发明中制备的诊疗剂rf@mpda(mn)-peg-fa有望解决以上问题，通过表面修饰，本发明实现了诊疗剂对肿瘤细胞的靶向性，并通过mri动态监控诊疗剂的肿瘤聚集，从而对化疗药物瑞戈非尼高效靶向输运，利于癌症的治疗。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明的第一个目的在于提供一种靶向介孔聚多巴胺多功能纳米诊疗剂(rf@mpda(mn)-peg-fa)，该纳米诊疗剂对叶酸受体阳性细胞具有特异靶向性，并且具有生物相容性好及容易合成的特点。

本发明的第二个目的在于提供一种rf@mpda(mn)-peg-fa的制备方法：mpda诊疗剂由于它自身具有很强的吸附能力和丰富的纳米孔洞，还能产生π-π*电子跃迁，并与分子形成氢键，可以大幅度提高瑞戈非尼的负载效率，从而使药物生物利用度提高。

本发明的第三个目的在于提供的rf@mpda(mn)-peg-fa在肿瘤组织部位的磁共振成像以及治疗中的应用：该类纳米粒子能对叶酸受体成阳性的癌细胞进行识别，从而富集于癌细胞中，利用mn²⁺进行磁共振成像，监测治疗过程和效果。

本发明由水溶性的叶酸靶向介孔聚多巴胺药物载体，疏水性的瑞戈非尼药物及锰离子组成。通过迈克尔加成反应，制备了叶酸靶向的介孔聚多巴胺纳米载体（mpda-peg-fa），通过酚羟基对mn²⁺的螯合作用以及瑞戈非尼与mpda之间的π-π堆积力，实现了mn²⁺和瑞戈非尼的负载，mn²⁺是一种mri造影剂，可以进行mri成像引导下的叶酸靶向癌症治疗，有望提高肿瘤治疗效果。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种靶向介孔聚多巴胺多功能纳米诊疗剂，由水溶性的叶酸靶向介孔聚多巴胺药物载体、疏水性的瑞戈非尼及硫酸锰组成；瑞戈非尼与叶酸靶向介孔聚多巴胺药物载体的质量比为0.5~4:1；硫酸锰与叶酸靶向介孔聚多巴胺药物载体的质量比为1~6:1。

上述靶向介孔聚多巴胺多功能纳米诊疗剂的制备方法，包括如下步骤：

（1）将盐酸多巴胺、pluronicf127溶于混合溶剂中，在超声条件下加入1,3,5~三甲苯，持续超声一段时间，加入氨水，搅拌，离心洗涤，得mpda；

（2）将mpda分散于水中，然后逐滴加入叶酸-聚乙二醇的二甲基亚砜溶液，调节混合溶液ph为碱性，搅拌、离心洗涤，得mpda-peg-fa药物载体；

（3）取（2）中所得mpda-peg-fa分散于水中，然后加入硫酸锰水溶液，搅拌、离心洗涤，得mpda(mn)-peg-fa；

（4）将（3）中所得mpda(mn)-peg-fa和药物瑞戈非尼分散于有机溶剂中，静置于真空干燥箱，挥发部分有机溶剂，离心去除剩余有机溶剂，所得沉淀洗涤2~4遍，可重悬于溶液中，获得纳米诊疗剂rf@mpda(mn)-peg-fa溶液。

作为优选的，在上述的制备方法中，步骤（1）所述混合溶剂为超纯水和无水乙醇，体积比为1:1~4；所述超声时间为2~5min；加入的氨水体积与混合溶剂的体积比为为8~25：150。

作为优选的，在上述的制备方法中，步骤（1）所述的盐酸多巴胺、pluronicf127和1,3,5-三甲苯的质量比为0.2-1.3:0.4-1.3:1。

作为优选的，在上述的制备方法中，步骤（2）所述的叶酸-聚乙二醇与mpda的质量比为1~5:1；混合溶液碱性为8~12；二甲基亚砜与mpda水溶液的体积比为1:1~5。

作为优选的，在上述的制备方法中，步骤（3）所述的搅拌时间为12-36h；硫酸锰与mpda的质量比为1~6:1。

作为优选的，在上述的制备方法中，步骤（4）所述的mpda(mn)-peg-fa与瑞戈非尼的质量比为1:0.5~4。

作为优选的，在上述的制备方法中，步骤（2）、步骤（3）或步骤（4）所述离心的参数为4000~13000rpm，6~10min；步骤（1）、步骤（2）、步骤（3）或步骤（4）所述洗涤溶剂为水、ph5.0~7.4的pbs溶液、培养基或有机溶剂。

作为优选的，在上述的制备方法中，步骤（4）所述有机溶剂为三氯甲烷、二氯甲烷、四氢呋喃、二甲基亚砜、甲醇、乙醇中的一种或多种混合。

上述的叶酸-聚乙二醇的结构如下所示：

其中，n=1000~5000。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

（1）本发明的药物载体mpda-peg-fa既适用于疏水性药物的负载，又适用于亲水性药物的负载，且药物负载量高，可应用于治疗多种疾病。

（2）瑞戈非尼为疏水性很强的物质，无法直接注射。mpda具有较高的比表面积和纳米孔道结构，可以大幅度提高瑞戈非尼的载药量。制备方法易于操作、反应条件温和、成本低廉。

（3）本发明得到的靶向介孔聚多巴胺诊疗剂能够对叶酸受体成阳性的肿瘤细胞进行识别，从而在肿瘤治疗中具有靶向作用。该诊疗剂实现了mri成像引导下的化疗，有望提高肿瘤治疗效果且生物相容性良好，具有临床应用潜力。

附图说明

图1为实施例5中mpda的a）动态光散射粒径分布柱状图；b）透射电子显微镜图；

图2为实施例5中rf@mpda(mn)-peg-fa的热重分析图；

图3为实施例5中rf@mpda(mn)-peg-fa的a）动态光散射粒径分布柱状图；b）透射电子显微镜图；

图4为实施例6的体外mri弛豫率计算图；

图5为实施例7的体外细胞mri图；

图6为实施例8的肝癌细胞活性影响图；

图7为实施例9的小鼠体内磁共振成像图。

具体实施方式

实施例1靶向药物载体mpda-peg-fa的合成

具体步骤如下：

（1）mpda的制备：将0.15g多巴胺、0.1gpuronicf127溶于10ml水和乙醇的混合溶剂中，在水浴超声条件下加入0.16ml1,3,5-三甲苯，持续超声2min，加入0.760ml氨水，搅拌3h，离心洗涤，得到mpda，粒径为200±10nm。

（2）mpda-peg-fa的合成：称取2mgpeg-fa溶于1ml二甲基亚砜，1mgmpda溶于2ml超纯水，二甲基亚砜逐滴缓慢加入超纯水中，调节混合溶液ph为8.5，搅拌24h，离心5000rpm，10min，用超纯水洗涤3次，所得沉淀即为mpda-peg-fa，重悬于水中。

实施例2靶向药物载体mpda-peg-fa的合成

具体步骤如下：

（1）mpda的制备：将0.15g盐酸多巴胺、0.1gpluronicf127溶于10ml水和乙醇的混合溶剂中，在水浴超声条件下加入0.16ml1,3,5-三甲苯，持续超声2min，加入0.375ml氨水，搅拌2h，离心洗涤，得mpda，粒径为200±10nm。

（2）mpda-peg-fa的合成：称取5mgpeg-fa溶于1ml二甲基亚砜，1mgmpda溶于2ml超纯水，二甲基亚砜逐滴缓慢加入超纯水中，调节混合溶液ph为9，搅拌24h，离心5000rpm，10min，用超纯水洗涤2次，所得沉淀即为mpda-peg-fa，重悬于pbs（ph为7.4）溶液中。

实施例3靶向纳米诊疗剂rf@mpda(mn)-peg-fa的合成

具体步骤如下：

（1）mpda-peg-fa（mn）的合成：取1mg实施例1合成的mpda-peg-fa重悬于超纯水中，向其中加入2mgmnso4，搅拌12h，离心5000rpm，10min，用超纯水洗涤3次，所得沉淀即为mpda(mn)-peg-fa。

（2）rf@mpda(mn)-peg-fa的合成：取上述合成的1mgmpda(mn)-peg-fa溶于1ml四氢呋喃，2mg瑞戈非尼溶于1ml四氢呋喃，将两者混合，静置于真空干燥箱中，至溶剂体积挥发为500μl时取出离心4500rpm，8min，水洗2次，所得沉淀即为rf@mpda(mn)-peg-fa，重悬pbs（ph为7.4）溶液中。

实施例4靶向纳米诊疗剂rf@mpda(mn)-peg-fa的合成

具体步骤如下：

（1）mpda(mn)-peg-fa的合成：取1mg实施例1合成的mpda-peg-fa重悬于超纯水中，向其中加入5mgmnso4，搅拌12h，离心5000rpm，10min，用超纯水洗涤3次，所得沉淀即为mpda(mn)-peg-fa。

（2）rf@mpda(mn)-peg-fa的合成：取上述合成的1mgmpda(mn)-peg-fa溶于1ml四氢呋喃，3mg瑞戈非尼溶于1ml四氢呋喃，将两者混合，静置于真空干燥箱中，至溶剂体积挥发为500-600μl时取出离心4500rpm，8min，水洗3次，所得沉淀即为rf@mpda(mn)-peg-fa，可重悬于水或者pbs（ph为7.4）溶液中。

实施例5实施例3纳米诊疗剂rf@mpda(mn)-peg-fa的表征

具体步骤如下：

（1）马尔文纳米粒度仪测量mpda粒径：取1ml溶液，加入样品池中，测定纳米颗粒的粒径和分散情况。其粒径为200±10nm，并得到如图1a的动态光散射粒径分布柱状图，透射电镜图片如图1b所示。由图中可见，制得的mpda粒径分布范围较窄，粒径均一且表面有明显的孔道结构。

（2）为合成的mpda-peg-fa的热重分析图：取5-10mgmpda-peg-fa样品，进行热重测定，实验所用气体为氮气，温度范围为室温-800℃，升温速率为10℃/min。如图2所示，mpda的重量损失为55.71wt％。然而，在mpda表面修饰后，mpda-peg-fa的重量损失分别增加到62.04wt％，约6.33wt％的peg-fa引入的表面。该结果证明，靶向peg-fa成功修饰到了mpda的表面。

（3）马尔文纳米粒度仪测量rf@mpda(mn)-peg-fa粒径：取1ml溶液，加入样品池中，测定纳米颗粒的粒径和分散情况。测量其粒径为247.6±9.5nm，并得到如图3a的动态光散射粒径分布柱状图，由图中可见，制得的rf@mpda(mn)-peg-fa粒径分布范围较窄，表明粒径均一。

（4）透射电镜（tem）观察rf@mpda(mn)-peg-fa形貌：取10μl溶液，滴加在表面碳涂层铜网上，室温条件下自然风干。200kv电压条件下，透射电子显微镜观察纳米颗粒的形貌、粒径和分散情况。如图3b所示，从制备的纳米粒rf@mpda(mn)-peg-fa的透射电镜结果，可以看出纳米粒子粒径均一，形状为球形，由于表面叶酸的修饰，规则分布的孔道变得模糊，侧面表征成功修饰叶酸。

实施例6纳米诊疗剂rf@mpda(mn)-peg-fa磁共振成像性能表征

具体步骤如下：

将rf@mpda(mn)-peg-fa的水溶液进行梯度稀释，在核磁共振成像仪下进行扫描，检测其mri成像效果。如图4所示，以离子物质的量浓度为横坐标，以纵向弛豫率r1（1/t1）为纵坐标进行线性拟合，得到rf@mpda(mn)-peg-fa的纵向弛豫率为9.77mm^-1s^-1，是商用钆喷酸葡胺的纵向弛豫率（4.85mm^-1s^-1）的2.01倍。与商用造影剂相比，rf@mpda(mn)-peg-fa诊疗剂可使mri造影信号显著增强。

实施例7纳米诊疗剂rf@mpda(mn)-peg-fa体外细胞磁共振成像性能表征

具体实验步骤如下：

将rf@mpda(mn)-peg-fa溶液进行梯度稀释(浓度如图)后，与人肝癌细胞hep3b共培养12小时。pbs冲洗3次，收集细胞后计数，重悬，10⁷个/ml置于ep管中，在核磁共振成像仪下进行扫描，检测其mri成像效果。如图5a所示，在t2成像时，随着培养mn2+浓度升高，mri造影信号不断增强，亮度逐渐降低。如图5b所示，在t1成像时，随着培养mn²⁺浓度升高，mri造影信号不断增强，亮度逐渐升高。表明rf@mpda(mn)-peg-fa能被hep3b癌细胞摄取，并具有良好的mri成像效果。

实施例8纳米诊疗剂rf@mpda(mn)-peg-fa细胞毒性实验

具体实验步骤如下：

人肝癌细胞hep3b毒性实验：将人肝癌细胞hep3b以0.5×10⁴个/孔的数量分别接种在96孔细胞培养板中培养24h，在培养基中加入终浓度0.30mm浓度的靶向rf@mpda(mn)-peg-fa溶液和非靶向rf@mpda(mn)-peg溶液，与细胞共孵育24h，48h和72小时。以加入等容积pbs的培养条件作为对照组。mtt实验检测药物对细胞活性的影响。如图6所示，细胞毒性实验结果表明靶向组实现了良好的肿瘤细胞杀伤作用，而非靶向组的杀伤作用较靶向组弱。表明靶向化的rf@mpda(mn)-peg-fa能有效杀伤hep3b肝癌细胞，具有治疗肝癌的潜力。

实施例9纳米诊疗剂rf@mpda(mn)-peg-fa在小鼠体内的磁共振成像

具体实验步骤如下：

采用尾静脉注射法，分别将125μl靶向化的，或非靶向化的rf@mpda(mn)-peg-fa(6mg/ml)注入荷瘤鼠,分别在注射后2h对小鼠肿瘤部位进行t1，t2磁共振成像，比较不同用药组mri造影信号变化情况。如图7所示，将靶向化rf@mpda(mn)-peg-fa注入荷瘤鼠后，肿瘤部位磁共振t1信号逐渐增强，亮度逐渐升高；而t2扫描信号逐渐增强后，亮度逐渐降低。非靶向组的体内肿瘤信号强度与对照组相比没有明显变化。