甘草及其水提取物在防治蜂房蜜蜂球菌中的应用的制作方法

本发明涉及甘草及其水提取物或者含甘草的组合物在防治蜂房蜜蜂球菌中的应用。

背景技术

欧洲幼虫腐臭病(europeanfourbrood简称：efb)是由蜂房蜜蜂球菌(melissococcuspluton)引起的蜜蜂恶性传染病，在世界各国均有发生。中国饲养的中华蜜蜂(apisceranacerana)发病比西方蜜蜂(apismellifera)严重。这种病害传染快，危害大，一旦发病会迅速传染到全场和附近的蜂场。目前对于欧洲幼虫病主要以预防为主，采取饲养强群和消毒等措施。尽管抗生素可有效防治欧洲幼虫腐臭病，由于蜂产品药物残留等原因，禁止蜂群中使用抗生素，目前面临无药可用的局面。

技术实现要素：

基于此，本发明的目的是提供甘草或甘草水提取物或含甘草的中药组合物或其提取物在抑制蜂房蜜蜂球菌中的应用。

更进一步，本发明提供一种抑制蜂房蜜蜂球菌的中药组合物，由包括甘草以及连翘和大青叶中的一种或两种组合的中药组分组成。

所述中药组合物由甘草、连翘和大青叶组成，所述甘草、连翘和大青叶的重量分数比为1-3：1-3：1-3。所述甘草、连翘和大青叶的重量份数比优选为1：1：1。

本发明还提供一种抑制蜂房蜜蜂球菌的中药组合物提取物，是上述的中药组合物以水为溶剂进行提取获得的提取物。

所述中药组合物提取物按照下述方法制备：

称取所述中药组合物，加水浸泡20-40min，煮沸1～2h，滤出煎液后，药渣再加水煮沸，合并两次煎液，再加热浓缩得到中药组合物的提取物。

其中，每次水的添加比例是10-150ml水/g中药组合物，优选的，每次水的添加比例是10-100ml水/g中药组合物。

本发明还保护上述中药组合物在抑制蜂房蜜蜂球菌中的应用。

上述的中药组合物提取物在抑制蜂房蜜蜂球菌中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的有益效果：利用中草药的防治蜂病，除防治蜂病效果好，对于蜂群的繁殖、清巢、壮蜂等方面都有利。利用中草药防治欧洲幼虫病的优点：(1)用法简单，价格便宜。(2)资源丰富。(3)多功能性，中草药结构复杂，成分多种多样是中草药具备多功能性的内在因素。(4)无毒副作用。

附图说明

图1为蜂房蜜蜂球菌菌落

图2为蜂房蜜蜂球菌菌体(相差显微镜×1000)

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例1、防治蜜蜂欧洲幼虫腐臭病的中草药筛选

本发明研究了中草药提取物对蜂房蜜蜂球菌(melissococuspluton)的体外抑制效果。具体方法如下所述：

一、蜂房蜜蜂球菌菌悬液的制备

蜂房蜜蜂球菌是一种披针行的球菌，其直径为0.5～1.1微米，为珍珠半透明、水滴样，无运动性，为革兰氏阳性但染色不稳定，有时显革兰氏阴性。该菌不形成芽孢，有时可形成荚膜。涂片检查时可见多呈单个存在，也有成双、链状或梅花网络状排列的。细菌最适培养温度为35℃，适合该菌生长的最适适合ph为6.7。按照常规方法采集蜂房蜜蜂球菌并鉴定。

蜂房蜜蜂球菌活化方法为：用抑菌针挑取单菌落在培养基边缘的一小区处，然后自此开始，向左右两侧划线，并逐渐向下移动直至边缘。划线时，接种环与培养基表面越呈45°的角为宜，角度大时容易划破培养基表面。划线时尽可能直、密、匀，以有效的利用培养基，并达到充分分离的目的。将划好的培养基放入细菌培养箱中培养18～24h后，挑取单菌落在相差显微镜下观察。若发现较多的单个菌落或成对呈链球状的球菌并具有梅花络状，即可确诊为蜂房蜜蜂球菌。

本发明对蜂房蜜蜂球菌的形态鉴定结果：欧幼病的菌落直径1mm左右，为珍珠白或半透明水滴样，边缘整齐、表面光滑、中心凸突的小菌落(图1)，相差显微镜观察显示，菌体呈长圆形，披针样；排列成链状或单个、成对散开(图2)。培养时间18～24小时，最适温度34～35℃。

蜂房蜜蜂球菌菌悬液的制备：

将纯培养的蜂房蜜蜂球菌挑取单菌落移入200ml的牛心液体培养基中，放入wdp细菌培养箱中摇18h,使用时用生理盐水作1：1000倍的稀释。

牛心液体培养基：酵母浸粉1g、葡萄糖1g、可溶性淀粉1g、牛心浸粉1g、kh2po41.36g、蒸馏水100ml、ph用naoh调至到6.5～7.5之间。

二、供试中药提取物的制备

供试中草药：丁香、连翘、甘草、丹参，夏枯草、大青叶、黄连、黄芩、菊花、蒲公英、板蓝根、马齿苋、金银花、火麻仁、柏子仁、白头翁、鱼腥草、通草、百部、当归、土茯苓和苍耳子，这些中草药的药用部分购自北京同仁堂。

中草药水提剂的制备：称取中草药10g，加400ml蒸馏水，浸泡30min，煮沸1～2h，滤出煎液后，药渣再加100ml的蒸馏水煮沸，合并两次煎液，再加热浓缩到10ml，灭菌，冰箱保存。

三、中草药抑菌效果筛选实验

本发明使用扩散法对中草药抑菌效果进行测试筛选。

细菌药敏实验的扩散法(diffusionmethod)是将抗可菌药物置于已接种的待测菌的固体培养基内(或上)抗菌药物通过向培养基内的扩散，抑制敏感菌的生长，从而出现抑菌环(带)。由于药物扩散的距离越远，达到该距离的药物浓度越低，故可根据抑菌环的大小，判断细菌对药物的敏感度。

1、中草药的初步筛选

欧洲幼虫病是细菌性病害，首先我们需筛选出抑制细菌生长的中草药。再从毒性、味、抑菌效果(efb)几个方面对中草药进行初步筛选。本发明表1所述的中草药采用管碟扩散法进行初筛。

管碟扩散法：用固体培养基(酵母浸粉1g，葡萄糖1g，可溶性淀粉1g，牛心浸粉1g，琼脂1g，kh2po41.36g，蒸馏水100mlph用koh缓冲溶液调至到6.5)倒平板，培养基凝固后，将培养18～24h的菌悬液稀释100倍，取100μl到平板，用涂摸棒或是玻璃珠均匀涂于平板，一个平板上等距离放置三个经过灭菌的牛津杯。每个牛津杯内加200μl的中药水提液，在30～35℃温度下培养24h，测量抑菌圈的直径(d)，每个抑菌圈呈米字型测量，求平均值。

运用管碟扩散法，中草药抑菌效果的判断标准为d<10为耐药，10≤d≤15mm为中度敏感，d>15mm为高度敏感。

表1.22种中草药的初步筛选结果

注：“+”表示抑制efb病原菌，“－”表示不抑制efb病原菌或有毒。

由表1可以得知，抑制蜂房蜜蜂球菌中草药有丁香、丹参、连翘、甘草、大青叶、夏枯草、黄连、黄芩、菊花、板蓝根、蒲公英、金银花、马齿苋13种药。从以上结果可看出，符合较好抑制欧洲幼虫病原菌及无毒的药物有丹参、连翘、甘草、大青叶、夏枯草。选用这几种药做抑菌实验。

2、五种候选中草药对efb病菌的药物敏感性测定

本实验通过将菌均匀涂抹于琼脂平板上和菌均匀混入培养基两种方法后，采用管碟扩散法进行试验，比较各种药物的抑菌效果。

1)菌均匀涂抹于平板(管碟扩散法)

用移液枪向直径9cm的平板(酵母浸粉1g、葡萄糖1g、可溶性淀粉1g、牛心浸粉1g、琼脂1g、kh2po41.36g、蒸馏水100ml、ph用naoh调至到6.5～7.5之间)中加入120ul的菌悬液，用灭菌的涂抹棒，均匀将菌悬液涂抹于平板上，将灭菌的牛津杯置于平板上，轻轻加压，使其与平板培养基接触面无孔隙，然后用灭菌的枪头吸取不同的药液，并标记好药物名称，缓缓滴入牛津杯中内至满，勿使外溢。平放于34与温箱中培养18～24h，观察牛津杯周围有无抑菌环及抑菌环的大小。可用滴管将牛津杯内的残余药液吸净，再移去牛津杯，然后用游标卡尺测量直径。结果如表2所示。

表2.五种中草药的抑菌效果(菌均匀涂抹于平板)

注：“+”表示抑菌效果

结果表明，根据中草药抑菌效果的判定标准，连翘、甘草、夏枯草、大青叶对蜂房蜜蜂球菌敏感，丹参对该菌产生中度敏感。

2)菌混入培养基(管碟扩散法)

将20ml培养基(酵母浸粉1g、葡萄糖1g、可溶性淀粉1g、牛心浸粉1g、琼脂1g、kh2po41.36g、蒸馏水100ml、ph用naoh调至到6.5～7.5之间。)冷却到50℃以下时，将稀释好的菌悬液加入80μl于培养基中混匀，迅速倒平板，待冷却，置牛津杯加入中草药水提剂至满。平放于34℃的恒温箱中培养18～24h,用游标卡尺测量直径。

表3.五种中草药的抑菌效果(菌混入培养基)

注：“+”判定范围

连翘、甘草、大青叶、夏枯草对蜂房蜜蜂球菌敏感，丹参对该菌产生中度敏感。

综合上两张表可看出运用不同的两种方法，据中草药抑菌效果的判定标准，连翘、甘草、大青叶、夏枯草对蜂房蜜蜂球菌敏感，丹参对该菌产生中度敏感。不同的方法对efb病原菌的敏感程度有些细微的差异。但得到的结果相符。连翘、甘草、大青叶、夏枯草是所有筛选中草药抑制欧洲幼虫病的最佳药物。

3、中草药组合物配方的优化筛选

1)中草药组合物水提药液的制备

按照表4或表5中的配比，取中药组合物，制备中草药组合物水提剂：称取烘干后的中草药组合物各100g，分别加入1l蒸馏水浸泡30min煮沸，然后温火煎熬60min后用纱布过滤药液，药渣再加入蒸馏水1l煮沸，温火煎熬60min过滤药液，两次药液合并进行煎熬，浓缩至100ml，高压灭菌后放入4℃冰箱保存，以备后用。

2)中草药组合物组分的优化筛选

按照步骤2的管碟扩散法对表4和表5所示比例的中草药组合物水提药液进行抑菌测试。结果如表4和表5所示。

表4.中草药组合物提取液对蜂房蜜蜂球菌的抑菌效果(菌均匀涂抹于平板)

表5.中草药组合物提取液对蜂房蜜蜂球菌的抑菌效果(菌混入培养基)

综合上两张表可看出运用不同的两种方法，据抑菌效果的判定标准，连翘、甘草和大青叶以1：1：1配比，对蜂房蜜蜂球菌具有很好的抑菌效果，具有协同增效的现象，对防治欧洲幼虫病有较好的应用前景。