本发明是关于一种动物脑卒中模型的制备方法，具体而言，是关于一种新型小鼠血栓性脑卒中模型的制备方法，以及所制备的小鼠血栓性脑卒中模型在脑血栓的溶栓研究中的应用。
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：：脑卒中又称中风或脑血管意外，是严重威胁人类健康的常见病和多发病。最新数据显示，我国每年新发脑卒中约270万人，且以每年近9％的速度上升，是我国成年居民第一致死和致残病因。脑卒中分为缺血和出血性，其中缺血性脑卒中是临床上最常见的脑卒中类型(发病率占8成左右)，它主要是由血液中的各种栓子(如心脏内的附壁血栓、动脉粥样硬化的斑块等)随血流进入脑动脉而阻塞血管，引起该动脉供血区脑组织缺血性坏死，进而出现局灶性的神经功能缺损(hankeygj.stroke.lancet.2017；389(10069):641-654)。目前缺血性脑卒中的治疗方法主要是药物溶栓。重组组织型纤溶酶原激活物(recombinanttissue-typeplasminogenactivator,rtpa)是目前唯一被fda批准用于缺血性脑卒中的溶栓药物，但其有效治疗窗狭窄，仅有3.5-4.5h，超过这一时间使用溶栓药物极易引发脑出血从而危及生命。由于上述情况，导致我国仅有1.6％左右的患者入院后具备接受溶栓治疗的条件。因此，使用动物模型模拟脑卒中发病特征，进行治疗药物研发具有重要意义。为了阐明脑卒中的发病机制，研发脑卒中治疗药物，人们在近四十年里发明了一系列脑卒中动物模型。使用动物模型在脑卒中的治疗方法和药物研发中有着无法替代的重要地位，其原因在于：(1)人类脑卒中的病因和病理特征多样而且复杂，使用实验用动物模型可以控制发病的变量，使发病机制的研究变得有迹可循。(2)许多分子、基因、生化或病理检查都需要一定量的脑组织，这在临床操作中极难实现。(3)脑卒中发病极早期的病理变化往往无法通过临床影像技术观察，因而只能通过动物模型进行研究。(4)使用体外细胞模型难以模拟动物模型中的血管结构及再灌注的病理进程。尽管学者们已经在脑卒中的临床前研究中取得了许多重要的进展，但大量的临床前研究却并未产生出相应的脑卒中治疗药物，目前除去rtpa，极少有神经保护药物的治疗作用能够在国际范围内得到广泛应用。为解决上述问题，脑卒中治疗学术与企业圆桌会议(stroketherapyacademicindustryroundtable，stair)规定了临床前脑卒中研究的严格标准，以及对新型脑卒中模型的迫切需求。作为一个好的脑卒中模型，应尽可能模拟临床上血栓的形成与栓塞过程，带有脑卒中发病的并发症状(fisherm,feuersteing,howellsdw,hurnpd,kentta,savitzsi,loeh,groups.updateofthestroketherapyacademicindustryroundtablepreclinicalrecommendations.stroke.2009；40(6):2244-2250)。目前的啮齿类动物局灶性脑卒中动物模型可以分为五类：线栓法、开颅法、光照造栓法、局部凝血法和血栓栓塞法。线栓法是目前最常用的脑缺血模型。该模型通常使用适宜直径的尼龙线由颈外动脉经颈总动脉插入脑中动脉阻塞血流，形成栓塞模型。该方法对动物的侵入性较小，插入的栓线可以完全阻断中动脉供血，造成稳定的脑梗死体积，形成稳定的神经与运动功能障碍。然而该方法与临床脑卒中的形成与发展过程不一致，也不适用于溶栓药物的研发。开颅法是通过开颅手术直接暴露脑白质表面的中动脉，再通过电凝形成永久性缺血，或使用动脉夹等器械在一定时间内阻断血流。此类方法的优点在于能够形成稳定的梗死体积，动物死亡率较低，并由于可直接观察到是否堵塞中动脉，因而造模成功率较高。但是由于开颅手术的原因，容易对中动脉附近的脑白质造成物理性损伤。此外，手术过程会对颅内压和血脑屏障功能造成影响，从而增加行为学评分的差异性。光照造栓法是基于内注射光敏染料(rosebengal,erythrosinb)，然后无需开颅，使用特定波长的激光照射mca，通过在mca血管内发生过氧化损伤内皮细胞，激活血小板形成血栓。此方法侵入性较小，可形成稳定的梗死体积，死亡率较低。但是该方法会在脑血管内产生大量氧自由基，从而快速形成缺血性损伤及血管源水肿(胞外水肿)，半暗带较少。因此，该方法的脑卒中发病进程与临床情况有所区别，对药效评价造成一定的影响。局部凝血法采用类似于线栓法的手术操作，将含有致凝剂(内皮素-1或凝血酶)的微导管插入中动脉，注入特定量的致凝剂引发凝血。该方法模拟原发性脑栓塞，同样是一类低侵入性，低死亡率的造模方式。通过这种方法形成的血栓可以进行溶栓研究，但是注射致凝剂后会出现血流迅速下降并在数小时内逐渐回升至稳定的现象(可能与致凝剂的体内代谢有关)，因此其缺血时间难以确定。此外，由于内皮素受体在神经元与星形胶质细胞中也有表达，因此注射后会造成神经突起的生长和胶质发生，从而对实验结果产生影响。血栓栓塞法通过在体外制造新鲜或干燥血块，再通过导管注入中动脉导致脑血管堵塞。目前动物实验使用的栓子主要有两种，一是塑料栓子，大小均匀，可以形成比较稳定的脑缺血模型；二是使用大鼠自身血液在体外形成的血栓。该方法模拟非原发性卒中，堵塞在脑部的血栓可以进行溶栓药物的药效评价。病理进程接近临床实际情况，然而由于血栓在体外形成，无法模拟血栓在体内的形成与老化过程。血栓导入血管内不易黏附在血管壁上，易造成梗死体积与梗死区域的变化甚至发生血栓自溶现象，因此不适用于进行药物溶栓时间窗的研究。上述模型特点总结于表1。表1.常见啮齿类动物脑卒中模型优缺点比较现有的脑卒中造模方法的优缺点如前文所述。总结起来主要存在两个问题：不符合实际的临床病理进程以及无法进行溶栓时间窗研究。技术实现要素：本发明的一个目的在于克服现有技术脑卒中造模方法不符合实际的临床病理进程等缺点，提供一种能够模拟非原发性脑卒中的血栓形成与栓塞过程病理进程的小鼠脑卒中模型，并且该模型适用于脑卒中的溶栓药物时间窗研究。为实现上述目的，一方面，本发明提供了一种小鼠血栓性脑卒中模型的制备方法，该方法包括：将小鼠麻醉后，将颈总动脉使用缝合线在远心端打活结，分离并永久结扎颈外动脉近心端，分离颈内动脉起始部；将颈总动脉放入血栓生成仪血管电击夹的沟槽内进行两次电刺激，电流强度0.3～0.4ma，第一次持续电刺激50～80sec形成100％堵塞后松开电击夹，形成长度为2～3mm的黑色血栓。第一次电刺激结束后动脉失去搏动，取下电击夹，使用显微镊粉碎血栓，动脉恢复搏动并冲击碎栓，此时打开颈总动脉活结，使血栓进入颈内动脉；再次将颈总动脉远心端打活结，放入电击夹，使用同样电流强度第二次电刺激，第二次持续电刺激150～180sec，取下电击夹，形成长度为3～5mm的黑色血栓，第二次电刺激结束后使用上述同样方法用显微镊粉碎血栓，动脉恢复搏动并冲击碎栓，打开颈总动脉活结，使血栓进入颈内动脉。血栓进入颈内动脉后立即夹闭颈总动脉近心端5～10min，到时间后打开动脉夹，缝合颈部皮肤，形成目的栓塞模型。根据本发明的具体实施方案，本发明的小鼠血栓性脑卒中模型的制备方法中，所述小鼠为c57bl/6小鼠。根据本发明的具体实施方案，本发明的小鼠血栓性脑卒中模型的制备方法中，所述小鼠为6-8周龄体重20-30g的雄性小鼠。根据本发明的具体实施方案，本发明的小鼠血栓性脑卒中模型的制备方法中，麻醉小鼠时，使用气体麻醉机麻醉，并使用激光多普勒血流仪监测手术侧中动脉的血流量。根据本发明的具体实施方案，本发明的小鼠血栓性脑卒中模型的制备方法中，将颈总动脉使用缝合线打活结的操作如下：将麻醉后的小鼠仰卧位固定于鼠板上，纵向剪开颈部皮肤，剥离颈动脉鞘及迷走神经、降压神经，暴露颈总动脉，使用缝合线打活结。根据本发明的具体实施方案，本发明的小鼠血栓性脑卒中模型的制备方法中，夹闭颈总动脉近心端之后打开全部动脉夹后，血流值下降至基准值的30％以下，视为形成目的栓塞模型。另一方面，本发明还提供了所述的制备方法得到的小鼠血栓性脑卒中模型在脑卒中治疗药物的临床前研究、治疗方法和/或发病机理的研究中的应用。优选地，所述脑卒中治疗药物为溶栓药物。另一方面，本发明还提供了所述的制备方法得到的小鼠血栓性脑卒中模型在脑卒中治疗方法的研究中的应用。另一方面，本发明还提供了所述的制备方法得到的小鼠血栓性脑卒中模型在脑卒中发病机理的研究中的应用在本发明的一些具体实施方案中，本发明的小鼠血栓性脑卒中模型的制备方法包括：将小鼠麻醉后，将颈总动脉使用缝合线在远心端打活结，分离并永久结扎颈外动脉近心端，分离颈内动脉起始部；将颈总动脉放入血栓生成仪血管电击夹的沟槽内进行两次电刺激，电流强度0.3～0.4ma，第一次持续电刺激50～80sec，形成长度为2～3mm的黑色血栓。电刺激结束后动脉失去搏动，取下电击夹，使用显微镊粉碎血栓，动脉恢复搏动并冲击碎栓。此时打开颈总动脉活结，使血栓进入颈内动脉。第二次持续电刺激150～180sec，形成长度为3～5mm的黑色血栓，电刺激结束后使用上述同样方法使血栓进入颈内动脉。血栓进入颈内动脉后立即夹闭颈总动脉近心端5～10min，到时间后打开动脉夹，缝合颈部皮肤，形成目的栓塞模型。本发明的有益效果：本模型的造模成功率可达75％以上，如不进行后续溶栓操作，动物48h内死亡率低于10％，造模成功的小鼠能够表现出明显的神经功能与运动功能障碍，如一侧前肢内收，身体向一侧倾斜甚至翻滚等等。通过ttc染色可以观察到位置与大小稳定的梗死灶。与大鼠血栓性脑卒中模型相比具有更加稳定的造模成功率及病理症状，因而适用于进行脑卒中的病理机制及治疗药物研究。此外，由于c57bl/6小鼠已有大量的转基因动物品系，与本模型相结合使用，可以更好的进行相关研究，这是大鼠模型所不具备的特殊优势。本发明的小鼠脑卒中模型具有全部典型的脑卒中病理特征，这些病理特征可以通过及时溶栓治疗得到缓解，因而是目前最为接近临床病理特征的小鼠脑卒中模型。此外，本发明适合于脑卒中治疗药物，特别是溶栓药物的临床前研究。附图说明图1为小鼠血栓性脑卒中模型的制备流程示意图。图2a-图2c显示小鼠血栓性脑卒中模型的一般特征。图3a-图3c显示使用rtpa溶栓对小鼠血栓性脑卒中模型的脑血流影响。图4a-图4b显示使用rtpa溶栓对小鼠血栓性脑卒中模型的神经功能评分以及对前爪能力的影响。图5a-图5b显示使用rtpa溶栓对小鼠血栓性脑卒中模型的脑梗死体积的影响。具体实施方式以下通过具体实施例详细说明本发明的实施过程和产生的有益效果，旨在帮助阅读者更好地理解本发明的实质和特点，不作为对本案可实施范围的限定。下列实施例中未注明具体条件的方法，通常按照所属领域的常规操作进行。实施例1本实施例中，提供了小鼠血栓性脑卒中模型的构建方法及其能够用于相关的临床前研究。具体操作如下：1、小鼠血栓性脑卒中模型的制备流程小鼠血栓性脑卒中模型的制备流程如图1所示，主要包括步骤：使用体重20-30g雄性c57bl/6小鼠，使用气体麻醉机麻醉(2.5％诱导，1.5％维持)，使用激光多普勒血流仪监测手术侧中动脉的血流量。将小鼠仰卧位固定于鼠板上，纵向剪开1cm左右颈部皮肤，剥离颈动脉鞘及迷走神经，降压神经等，暴露5mm左右的颈总动脉，使用缝合线打活结；分离并永久结扎颈外动脉与翼腭动脉；分离颈内动脉起始部。将颈总动脉放入血管电击夹的沟槽内(小动物血栓生成仪，山东益延科技有限公司)进行两次电刺激，电流强度0.3～0.4ma，第一次持续电刺激50～80sec形成100％堵塞后松开电击夹，形成长度为2～3mm的黑色血栓。电刺激结束后动脉失去搏动，取下电击夹，使用显微镊粉碎血栓，动脉恢复搏动并冲击碎栓。此时打开颈总动脉活结，使血栓进入颈内动脉。第二次持续电刺激150～180sec至形成长度为3～5mm左右的黑色血栓。第二次电刺激结束后动脉失去搏动。取下电击夹，用动脉夹夹闭颈总动脉的远心端，使用显微镊(头部宽度0.1mm)粉碎血栓，此时血管变为均匀的灰色，同时可见动脉恢复搏动并冲击碎栓。放开动脉夹，用镊子驱赶血栓进入颈内动脉后立即夹闭颈总动脉近心端5～10min。到时间后打开动脉夹，若血流值下降至基准值的30％以下时，视为形成目的栓塞模型。本实施例的造模成功率为75％(15/20)，如不进行后续溶栓操作，动物48h内死亡率5％(1/20)，造模成功的小鼠能够表现出明显的神经功能与运动功能障碍，如一侧前肢内收，身体向一侧倾斜甚至翻滚等等。通过ttc染色可以观察到位置与大小稳定的梗死灶。2、小鼠血栓性脑卒中模型的病理特点(1)取6-8周龄体重20-30g的c57bl/6雄性小鼠，随机分成rtpa和溶剂对照组，使用0.4ma的电流强度按照前述方法进行两次电刺激制造颈总动脉血栓，第一次持续电刺激60sec，第二次持续电刺激150sec。形成血栓后，按10mg/kg的剂量，持续输注rtpa30min，溶剂对照组尾按同样方式输注生理盐水，完成后结扎颈总动脉上下端，剪下相同长度的血管(含血栓)并称重。血管称重后放入4％多聚甲醛中，制作组织切片并进行he染色，使用正置显微镜观察并拍照。(2)取6-8周龄体重20-30g的c57bl/6雄性小鼠，随机分成rtpa和溶剂对照组，按前述方法制备小鼠血栓性脑卒中模型，分别采用激光散斑和激光多普勒血流仪检测左右脑血流及中动脉血流在造模前后的百分比变化。造模后60min，按10mg/kg的剂量，持续输注rtpa30min，溶剂对照组按同样方式输注生理盐水，完成后检测溶栓前后脑血流及中动脉血流的百分比变化。图2a-图2c显示了本实施例中小鼠血栓性脑卒中模型的一般特征。其中，图2a：直流电击形成的颈动脉血栓及rtpa的溶栓作用。颈总动脉电击后可以观察到长度约3～5mm的黑色血栓。静脉输注rtpa后，颈总动脉血栓消失。提示本方法制造的血栓可被输注的rtpa溶解。图2b：通过he染色观察直流电击形成的颈动脉血栓与人脑血栓。人脑血栓与小鼠脑血栓具有相似的组织结构，但含有更多细胞核。需解释的一点为：人脑血栓由于长时间浸泡在4％多聚甲醛中，且组织样本不含血管，制片后血栓组织出现一定的空隙与裂缝。图2c：夹碎颈动脉血栓，使之堵塞脑部血管。图3a-图3c显示使用rtpa溶栓对小鼠血栓性脑卒中模型的脑血流影响。其中，图3a：激光散斑观察正常小鼠，血栓性脑卒中小鼠以及溶栓后小鼠的脑部血流情况。血栓粉碎后，可以观察到脑血流的显著降低，而溶栓后这一情况得到明显改善。说明了本模型可进行溶栓研究。图3b：使用激光多普勒血流仪观察小鼠手术前，完成栓塞以及溶栓后的中动脉血流变化。溶栓前，脑血流下降至造模前的30％，溶栓后则回升至60％左右，进一步说明本模型可用于溶栓相关研究。图3c：使用激光多普勒血流仪观察小鼠手术前，完成栓塞后3小时内中动脉血流的稳定性。3、小鼠血栓性脑卒中模型溶栓前后的行为学检测本实施例中，造模后24小时统计死亡率并进行两项行为学检测：(1)神经功能学评分参照bederson和belvyev等的观察方法：提起鼠尾，正常小鼠两前肢对称向前伸开。如果有肩部内旋、前肢内收现象发生，根据其严重程度进行评分。双侧前肢正常伸展评为0分；仅对侧前肢内收，无其他症状，评为1分；平拉鼠尾，对侧前肢抓握力量显著下降，评为2分；放置于平面上小鼠可自由活动，平拉鼠尾时肢体向对侧倾斜评为3分；放置于平面上时小鼠仅能向对侧旋转或翻滚评为4分；放置于平面上时无自主活动，且24小时内死亡评为5分。(2)采用悬挂实验观察大鼠前爪抓握能力：将大鼠前爪同时挂于抓握力检测仪上。1分：两爪均能挂住；2分：两爪均能挂住，但抓握力差距明显；3分：仅一爪能挂住。图4a-图4b显示使用rtpa溶栓对小鼠血栓性脑卒中模型的(图4a)神经功能评分以及对前爪能力(图4b)的影响。溶栓后，小鼠的神经与运动功能得到显著改善，溶栓成功。提示本模型适合于进行溶栓研究。4、脑梗死体积检测行为学检测后，小鼠麻醉后脱颈处死，取全脑迅速于-40℃冷冻并切片。第一刀在脑前极与视交叉连线中点处；第二刀在视交叉部位；第三刀在漏斗柄部位；第四刀在漏斗柄与后叶尾极之间，每片厚度2mm。脑组织切片使用0.5％ttc溶液于37℃孵育15min后，换以4％多聚甲醛孵育20min。最后按顺序摆放切片并分别拍摄切片正反两面的照片。数据处理时，应用图像分析软件imagej处理并计算每张脑片正反面的梗塞平均面积，乘以每片脑片的厚度2mm，每只动物所有脑片梗塞面积乘以厚度相加，即为脑梗塞体积。梗塞体积以所占大脑半球的百分率来表示，按下述公式计算以消除脑水肿的影响。图5a-图5b显示使用rtpa溶栓对小鼠血栓性脑卒中模型的脑梗死体积的影响。其中，图5a为脑切片正反两面的照片；图5b为应用图像分析软件imagej处理并计算脑梗塞体积的计算结果。结果显示，造模后小鼠脑组织出现位置和大小比较均一的脑梗死灶，说明建模的稳定性，而使用rtpa溶栓后，梗死灶明显减少，进一步说明了本模型适合于进行溶栓前后脑组织损伤的相关研究。当前第1页1 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