嵌合的治疗性抗-CD37抗体HH1的制作方法

本发明涉及具有意外高细胞毒性的嵌合抗体或人源化抗体对血液癌症的免疫疗法和放射免疫疗法以及所述抗体的不同应用。

背景技术：

本发明涉及嵌合的和人源化的抗-cd37抗体及其生产和应用。

此外，本发明涉及基于b-细胞耗尽的免疫疗法和放射免疫疗法。

具体地，本发明涉及用在这样的疗法中的抗-cd37抗体分子，例如用于治疗b细胞恶性肿瘤和自身免疫病况。

使用单克隆抗体(mab)的免疫疗法已经作为用于治疗癌症和其它疾病的安全且选择性的方法而出现。

具体地，由于利妥昔单抗(rituximab，一种针对b-细胞表面上的cd20抗原的抗体)的引入，已经扩大了单克隆抗体在基于b-细胞耗尽的疗法中(例如在b-细胞恶性肿瘤的治疗中)的作用。

cd37抗原是一种尚未以与b-细胞抗原cd20相同的程度被视作b细胞恶性肿瘤的靶标的细胞表面抗原。

cd37(四次穿膜蛋白超家族的一个成员)是一种具有4个跨膜结构域和2个胞外环的、高度糖基化的细胞表面分子。

在正常的b-细胞、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、包括套细胞淋巴瘤(mcl)、伯基特淋巴瘤(bl)、小淋巴细胞性淋巴瘤(sll)和滤泡淋巴瘤(fl)、边缘带淋巴瘤(mzl)、弥漫性大b细胞性淋巴瘤(dlbcl)、成淋巴细胞性淋巴瘤(ll)和慢性淋巴样白血病(cll)中观察到cd37表达。

该表达模式使得cd37成为抗体介导的癌症治疗的有吸引力的靶标。

cd37在1986年被首次描述，并通过鼠单克隆抗体mb-1进行了表征(link等人,1986)。

cd37的生理学作用是未知的。

cd37特异性的mab与癌细胞的结合可能触发多种作用机制：首先，在所述抗体结合cd37抗原的细胞外结构域以后，它可以激活补体级联和裂解靶细胞。

其次，抗-cd37抗体可以介导对靶细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)，这发生在免疫系统的细胞毒性细胞上的适当受体识别结合的抗体的fc部分以后。

第三，所述抗体可以改变b-细胞的对抗原或其它刺激做出应答的能力。

最后，抗-cd37抗体可以引发程序性细胞死亡(细胞凋亡)。

在2个放射免疫疗法试验中在b-nhl患者中评价了抗-cd37mabmb-1(b-细胞非霍奇金淋巴瘤；press等人,1989；kaminski等人,1992)。

其他人也已经公开了表现出潜力的抗-cd37mab(例如heider等人的wo2009/019312和本发明的发明人的wo2011/092295)，但是在证实cd37就治疗b-细胞恶性肿瘤而言是cd20的理想替代物之前，仍然有很长的路。

综上所述，已经证实，cd37抗原经常在几种人b-细胞恶性肿瘤的肿瘤细胞上和在成熟的正常b-淋巴细胞上表达，并且基于抗-cd37的疗法可以成为一种有前途的治疗b细胞恶性肿瘤的方案。

尽管上述的抗-cd37抗体或抗体样分子(例如mb-1)已经表现出在b-细胞恶性肿瘤中的抗肿瘤效力和靶向cd37的潜力，但是需要替代性的抗-cd37抗体来改善基于b-细胞耗尽的疗法。

因此，在寻求针对b-细胞恶性肿瘤的新治疗方法中，改进的抗-cd37抗体是有利的。

技术实现要素：

本发明的一个目的涉及从小鼠单克隆抗体hh1衍生出的嵌合抗体或人源化抗体。

具体地，本发明的一个目的是，提供一种嵌合抗体或人源化抗体。

本发明的一个方面涉及一种抗体分子，其结合人cd37，且其衍生自a)鼠单克隆抗体或b)非人抗体，所述鼠单克隆抗体由i)包含seqidno:1所示的氨基酸序列的可变重链和ii)包含seqidno:3所示的氨基酸序列的可变轻链定义，所述非人抗体识别与在a)中定义的抗体相同的人cd37表位或识别与所述表位接近或重叠的表位；其中所述抗体分子是嵌合抗体或人源化抗体。

本发明的另一个方面涉及编码本发明的抗体的dna分子。

本发明的另一个方面涉及携带一种或多种编码本发明的抗体的dna分子的宿主细胞。

本发明的另一个方面涉及生产本发明的抗体的方法，所述方法包括：用一种或多种编码本发明的抗体的载体转染哺乳动物宿主细胞，培养所述宿主细胞，和回收并纯化所述抗体分子。

本发明的另一个方面涉及一种药物组合物，其包含作为活性成分的一种或多种本发明的抗体和药学上可接受的载体。

本发明的另一个方面涉及一种用于治疗b-细胞恶性肿瘤的药物组合物。

本发明的另一个方面涉及治疗患有b-细胞恶性肿瘤的患者的方法，所述b-细胞恶性肿瘤选自由b-细胞非霍奇金淋巴瘤、b-细胞慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤和多发性骨髓瘤组成的组，所述方法包括：给所述患者施用有效量的本发明的药物组合物。

本发明的另一个方面涉及一种结合人cd37的放射免疫缀合物，其包含a)本发明的抗体、b)接头和c)选自由以下组成的组的放射性核素：²¹¹at、²¹³bi、²¹²bi、²¹²pb、²²⁵ac、²²⁷th、⁹⁰y、¹⁸⁶re、¹⁸⁸re、¹⁹⁹au、¹⁹⁴ir、¹⁶⁶ho、¹⁵⁹gd、¹⁵³sm、¹⁴⁹pm、¹⁴²pr、¹¹¹ag、¹⁰⁹pd、⁷⁷as、⁶⁷cu、⁴⁷sc和¹⁷⁷lu。

本发明的另一个方面涉及一种药物组合物，其包含如上所述的放射免疫缀合物。

本发明的另一个方面涉及用于治疗b-细胞恶性肿瘤的如上所述的药物，所述b-细胞恶性肿瘤选自由b-细胞非霍奇金淋巴瘤、b-细胞慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤和多发性骨髓瘤组成的组。

本发明的另一个方面涉及用于治疗b-细胞恶性肿瘤的方法，所述b-细胞恶性肿瘤选自由b-细胞非霍奇金淋巴瘤、b-细胞慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤和多发性骨髓瘤组成的组，所述方法包括：施用有效量的本发明的药物组合物。

本发明的另一个方面涉及一种用于生产本发明的放射免疫缀合物的试剂盒，其包含2个或更多个瓶，其中一个瓶含有缀合物，所述缀合物包含与本发明的抗体连接的螯合剂；且第二个瓶含有放射性核素。

另一个方面是，在使用放射性标记的鼠或嵌合hh1进行治疗之前，使用嵌合抗体封闭正常组织中的cd37抗原。

附图说明

图1显示了用于选通daudi细胞的流式细胞术点图以及关于抗-cd37chhh1.1(igg1同种型)结合和抗-nip抗体没有结合(阴性对照)的直方图。图1显示了chhh1的显著抗原结合。

图2显示了chhh1.1针对daudi淋巴瘤细胞的细胞结合。它显示了与靶标的快速且有效的结合。

图3表明，chhh1具有与利妥昔单抗类似的adcc，尽管在daudi淋巴瘤靶细胞中存在更少的抗原和显著的cd37内化。

图4显示了用il-2刺激的pbmc作为效应细胞和用rec-1细胞作为靶细胞以3种不同的效应细胞/靶细胞比率的adcc。3个个体的平均值和sd。

图5显示了针对用鼠hh1、利妥昔单抗、chhh1.1或利妥昔单抗和chhh1.1的组合标记的rec-1细胞，得自3个个体的10％血清的cdc。

图6显示了¹²⁵i-chhh1.3在注射后24和48小时在雌性裸鼠中的生物分布(％i.d./g)。

图7显示了用nk细胞作为效应细胞，adcc在daudi细胞中实现的特异性裂解百分比。从2个个体采取血液，并用10个nk细胞/1个daudi细胞的比率进行一个实验，其它实验使用15:1比率。

现在将在下面更详细地描述本发明。

具体实施方式

本发明涉及从小鼠单克隆抗体hh1衍生出的人源化抗体或嵌合抗体。

人源化抗体或嵌合抗体是得自非人物种的抗体，其蛋白序列已经被修饰以增加它们与在人类中天然产生的抗体变体的相似性。

经常将“人源化”方法应用于为施用给人类而开发的单克隆抗体。

当开发特异性抗体的过程涉及在非人免疫系统中产生(诸如在小鼠中产生)时，人源化可能是必要的。

以此方式产生的抗体的蛋白序列与在人类中天然存在的同源抗体具有部分不同，且因此当施用给人患者时可能具有免疫原性。

并非为人类施用设计的所有单克隆抗体都需要人源化，因为许多疗法是短期干预。

人源化经常被视作不同于小鼠-人抗体嵌合体的产生。

所以，尽管通常进行抗体嵌合体的产生来获得更人-样抗体(通过用得自人的fc区替换抗体的小鼠fc区)，这类简单的嵌合体经常不会被称作人源化的。

相反，人源化抗体的蛋白序列与人变体的蛋白序列基本上相同，尽管它的一些互补性决定区(cdr)区段的非人起源负责该抗体的结合它的靶抗原的能力。

但是，在本发明的上下文中，术语嵌合抗体和人源化抗体互换使用，用于表示已经经过遗传工程改造且从小鼠单克隆抗体hh1衍生出的抗体。

从单克隆抗体hh1衍生出的嵌合抗体或人源化抗体

免疫球蛋白重链(igh)是抗体(免疫球蛋白)的大多肽亚基。

典型的抗体由2个免疫球蛋白(ig)重链和2个ig轻链组成。

存在几种不同类型的重链，所述重链定义抗体的类别或同种型。

这些重链类型在不同动物之间存在差异。

免疫球蛋白轻链是抗体(免疫球蛋白)的小多肽亚基。

在人类中存在2类轻链(如在其它哺乳动物中一样)：由2号染色体上的免疫球蛋白κ基因座编码的kappa(κ)链，和由22号染色体上的免疫球蛋白λ基因座编码的lambda(λ)链。

b淋巴细胞会产生抗体，每个b淋巴细胞仅表达一类轻链。

一旦确定后，轻链类别在b淋巴细胞的寿命中保持固定。

在健康的个体中，总κ/λ比率在血清中为大致2:1(测量完整的整个抗体)或1:1.5(如果测量游离轻链)，高趋异比指示肿瘤。

κ与λ的确切正常比率范围为0.26-1.65。

κ链和λ链可以成比例地增加，从而维持正常比率。

从小鼠单克隆抗体hh1衍生出的嵌合抗体或人源化抗体中的可变链和恒定链可以不同于已知序列。

这样的变异的例子从本公开内容显而易见，且包括恒定链的选择、可变链的遗传变异和fc结构域的变异，以便调节效应子功能。

本发明的发明人已经遗传工程改造了从小鼠单克隆抗体hh1衍生出的嵌合人源化抗体。

这些抗体在b-细胞有关的恶性肿瘤的最佳治疗的搜寻中表现出有前途的作用。

在本公开内容的实验中证实了这些作用。

因而，本发明的一个方面涉及一种抗体分子，其结合人cd37，且其衍生自a)鼠单克隆抗体或b)非人抗体，所述鼠单克隆抗体由i)包含seqidno:1所示的氨基酸序列的可变重链和ii)包含seqidno:3所示的氨基酸序列的可变轻链定义，所述非人抗体识别与在a)中定义的抗体相同的人cd37表位或识别与所述表位接近或重叠的表位；其中所述抗体分子是嵌合抗体或人源化抗体。

在本发明的一个实施方案中，所述嵌合抗体由以下链定义：

i)包含seqidno:1所示的氨基酸序列的可变重链，ii)包含seqidno:3所示的氨基酸序列的可变轻链，iii)人起源的恒定重链和轻链。

在本发明的另一个实施方案中，所述嵌合抗体由以下链定义：i)选自由igg1、igg2、igg3和igg4链组成的组的恒定重链，和ii)作为κ或λ链的恒定轻链。

在本发明的另一个实施方案中，是如下定义的恒定重链：i)包含seqidno:5、seqidno:6和/或seqidno:7所示的氨基酸序列，且其中所述恒定轻链ii)包含seqidno:9所示的氨基酸序列。

在本发明的另一个实施方案中，是如下定义的恒定重链：i)包含seqidno:11和/或seqidno:14所示的氨基酸序列，且其中所述恒定轻链ii)包含seqidno:13所示的氨基酸序列。

具有突变全长重链的dnachhh1.3fc序列可以被视作seqidno:10。

具有突变全长轻链的氨基酸chhh1.3fc序列可以被视作seqidno:11。

具有突变全长重链的dnachhh1.3fc序列可以被视作seqidno:12。

具有突变全长轻链的氨基酸chhh1.3fc序列可以被视作seqidno:13。

没有突变(恒定区)的chhh1.3fc序列可以被视作seqidno:14。

编码本发明的抗体的核酸分子

人源化过程利用以下事实：使用重组dna来建立能够在哺乳动物细胞培养物中表达的构建体，可以完成单克隆抗体的生产。

也就是说，将能够生产抗体的基因区段分离，并克隆进可以在罐(tank)中生长的细胞中，使得从克隆的基因的dna产生的抗体蛋白可以被一起收获。

涉及重组dna的步骤会提供可以被容易地利用来改变表达的抗体的蛋白序列的干预点。

因此，在人源化过程中实现的对抗体结构的改变都通过在dna水平的技术来实现。

因而，本发明的一个方面涉及编码本发明的人源化抗体或嵌合抗体的dna分子。

在本发明的一个实施方案中，所述dna分子编码可编码本发明的人源化抗体或嵌合抗体的可变重链的区域。

在本发明的另一个实施方案中，该可变重链编码区与编码人起源的恒定重链的区域融合。

这样的人恒定重链可以选自由igg1、igg2、igg3和igg4组成的组。

在本发明的一个实施方案中，所述igg1是由seqidno:5、seqidno:6和/或seqidno:7所示的序列编码。

在本发明的一个实施方案中，所述igg3重链是由seqidno:10所示的序列编码。

在本发明的一个实施方案中，所述igg3轻链是由seqidno:12所示的序列编码。

在本发明的一个实施方案中，具有h435置换突变的igg3是由seqidno:12所示的序列编码。

在本发明的另一个实施方案中，人恒定重链包含fc区中的一个或多个置换。

本发明的另一个实施方案涉及一种dna分子，其包含编码本发明的嵌合抗体或人源化抗体的可变轻链的区域。

这样的可变轻链编码区域可以与编码人起源的恒定轻链的区域融合。

所述恒定轻链可以是κ或λ链。

在本发明的一个实施方案中，所述κ轻链是由seqidno:9所示的序列编码。

可以为在靶细胞中表达而构建和优化所述dna分子。

表达载体(或者被称作表达构建体)通常是用于将特定基因(在本发明的上下文中，本发明的dna分子)引入靶细胞中的质粒。

一旦表达载体处于细胞中，通过细胞的转录和翻译机器核糖体复合物来生产由该基因编码的蛋白。

经常将质粒工程改造成含有调节序列，所述调节序列充当增强子和启动子区域并导致在表达载体上携带的基因的有效转录。

精心设计的表达载体的目的是，生产大量稳定的信使rna，并因此生产蛋白。

表达载体是生物技术和对于特定疾病(如糖尿病)的医学治疗而言重要的蛋白(诸如胰岛素)的生产的基础工具。

在表达基因产物以后，需要纯化蛋白；但是由于将载体引入宿主细胞中，应当从宿主细胞的蛋白中纯化出目标蛋白。

因此，为了使纯化过程容易，克隆的基因应当具有标签。该标签可以是组氨酸(his)标签或任意其它标志物肽。

因而，本发明的一个方面因此涉及包含如上所述的dna分子的表达载体。

包含并表达本发明的抗体的细胞

可以将上述的dna分子或表达载体引入宿主细胞中。

这样的细胞可以通过杂交瘤技术变成生产嵌合抗体或人源化抗体的永生化细胞。

杂交瘤技术是如下形成杂交细胞系(被称作杂交瘤)的技术：将生产特异性抗体的b细胞与骨髓瘤(b细胞癌)细胞融合，选择能在组织培养物中生长和不存在抗体链合成的骨髓瘤(b细胞癌)细胞。

由杂交瘤产生的抗体都具有单一特异性，且因此是单克隆抗体(与多克隆抗体形成对照)。

因而，本发明的一个方面涉及一种宿主细胞，其携带本发明的一种或多种载体或dna分子。

本发明的一个实施方案涉及一种宿主细胞，其携带：包含编码hh1的可变重链的dna分子的表达载体，和包含编码本发明的可变轻链的dna分子的第二表达载体。

在本发明的一个实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。

在本发明的另一个实施方案中，所述细胞是杂交瘤细胞。

用于生产本发明的抗体的方法

本发明的嵌合抗体或人源化抗体可以通过几种方法来生产。

一种用于生产这样的抗体的方法包括：用本发明的一种或多种载体转染哺乳动物宿主细胞，培养所述宿主细胞，和回收并纯化所述抗体分子。

另一种用于生产这样的抗体的方法包括：构建产生本发明的嵌合抗体或人源化抗体的杂交瘤细胞。

序列同一性

如通常定义的，“同一性”在本文中被定义为分别在核苷酸或氨基酸水平的基因或蛋白之间的序列同一性。

因而，在本发明的上下文中，“序列同一性”是蛋白之间在氨基酸水平的同一性量度和核酸之间在核苷酸水平的同一性量度。

通过在比对多个序列时对比每个序列中的给定位置的氨基酸序列，可以确定蛋白序列同一性。

类似地，通过在比对多个序列时对比每个序列中的给定位置的核苷酸序列，可以确定核酸序列同一性。

为了确定两个核酸序列或两个氨基酸的同一性百分比，出于最佳对比目的对所述序列进行比对(例如，可以在第一个氨基酸序列或核酸序列中引入缺口，以便与第二个氨基酸或核酸序列最佳比对)。接着对比相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。

当占据第一个序列中的某一位置的氨基酸残基或核苷酸与第二个序列中相应位置的氨基酸残基或核苷酸相同时，则所述分子在该位置是相同的。两个序列之间的同一性百分比是所述序列所共有的相同位置的数目的函数(即，同一性百分比＝相同位置的数目/位置(例如重叠的位置)的总数×100)。在一个实施方案中，所述两个序列是相同长度。

可以手工比对所述序列，并且计数相同核酸或氨基酸的数目。可替换地，使用数学算法可以比对两个序列，以确定同一性百分比。这样的算法被并入nblast和xblast程序中。blast核苷酸检索可以用nblast程序(总分＝100，字长＝12)进行，以得到与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。blast蛋白检索可以用xblast程序(总分＝50，字长＝3)进行，以得到与本发明的蛋白分子同源的氨基酸序列。

为了进行带缺口的比对以达到对比目的，可以利用gappedblast。可替换地，可以使用psi-blast来进行迭代检索，其检测多个分子之间的远缘关系。当利用nblast、xblast和gappedblast程序时，可以使用各种程序的默认参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。可替换地，在已经比对多个序列之后，例如通过embl数据库中的blast程序(www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/blast)，可以计算序列同一性。

通常，可以使用关于例如“评分矩阵”和“缺口罚分”的默认设置来进行比对。在本发明的上下文中，blastn和psiblast默认设置可为有益的。

在允许缺口或不允许缺口的情况下，使用与上文所述类似的技术可以确定两个序列之间的同一性百分比。在计算同一性百分比时，只对精确匹配计数。

本发明的一个实施方案涉及一种分离的核酸，其包含与hh1抗体vh序列(seqidno:2)和/或vl序列(seqidno:4)具有80％序列同一性的核酸序列。

本发明的一个实施方案涉及一种分离的核酸，包含具有hh1抗体vh序列(seqidno:2)和/或vl序列(seqidno:4)的核酸序列。

在本发明的另一个实施方案中，所述分离的核酸包含与hh1抗体vh序列(seqidno:2)和/或vl序列(seqidno:4)具有至少90％序列同一性(诸如90％同一性、91％同一性、92％同一性、93％同一性、94％同一性、95％同一性、96％同一性、97％同一性、98％同一性或99％同一性)的核酸序列。

本发明的另一个实施方案涉及一种抗体，其包含与hh1抗体vh序列(seqidno:1)和/或vl序列(seqidno:3)具有80％序列同一性的多肽序列。

本发明的另一个实施方案涉及一种抗体，其包含具有hh1抗体vh序列(seqidno:1)和/或vl序列(seqidno:3)的多肽序列。

在本发明的另一个实施方案中，所述抗体包含与hh1抗体vh序列(seqidno:1)和/或vl序列(seqidno:3)具有至少90％序列同一性(诸如90％同一性、91％同一性、92％同一性、93％同一性、94％同一性、95％同一性、96％同一性、97％同一性、98％同一性或99％同一性)的多肽序列。

在本发明的一个优选实施方案中，这些抗体是从单克隆抗体hh1衍生出的嵌合抗体或人源化抗体。

遗传变异

遗传变异是由基因中核苷酸的碱基次序的变异造成。该变异造成所述基因的突变，随后造成所述基因所编码的蛋白的突变。

这些突变可以是有义突变或错义突变，或者是置换。

本发明的一个实施方案涉及hh1单克隆抗体vh链(seqidno:2)和/或vl链(seqidno:4)的分离的核酸序列，其包含至少50个(诸如20个，诸如10个，诸如5个，诸如4个，诸如3个，诸如2个，诸如1个)有义突变。

本发明的另一个实施方案涉及hh1单克隆抗体vh链(seqidno:2)和/或vl链(seqidno:4)的分离的核酸序列，其包含0-50个(诸如1-50个，诸如0-20个，诸如1-20个，诸如0-10个，诸如1-10个，诸如0-5个，诸如1-5个，诸如3个，诸如1个)有义突变。

错义突变(一类非同义突变)是一种点突变，其中单个核苷酸发生改变，从而产生编码不同氨基酸的密码子(将一种氨基酸变为一个终止密码子的突变被认为是无义突变，而不是错义突变)。错义突变可以使所得到的蛋白没有功能。

但是，并非所有的错义突变都会导致可观的蛋白变化。一个氨基酸可以用具有非常类似的化学特性的氨基酸替代，在这种情况下，蛋白仍可以正常起作用；这被称为中性、“安静(quiet)”或保守突变。

可替换地，可以在蛋白的不会显著影响蛋白二级结构或功能的区域中进行氨基酸置换。当一个氨基酸可以由超过一个密码子编码(所谓的“简并编码”)时，密码子中的突变可能不会在翻译中产生任何变化；这种突变可以是同义突变(一种沉默突变形式)，而不是错义突变。

本发明的一个实施方案涉及一种抗体，其包含hh1单克隆抗体vh链(seqidno:2)和/或vl链(seqidno:4)的多肽序列，该多肽序列包含至少50个(诸如20个，诸如10个，诸如5个，诸如4个，诸如3个，诸如2个，诸如1个)错义突变。

本发明的一个实施方案涉及一种抗体，其包含hh1单克隆抗体vh链(seqidno:2)和/或vl链(seqidno:4)的多肽序列，该多肽序列包含0-50个(诸如1-50个，诸如0-20个，诸如1-20个，诸如0-10个，诸如1-10个，诸如0-5个，诸如1-5个，诸如3个，诸如1个)错义突变。

保守置换是用另一个具有通常类似特性的氨基酸置换一个氨基酸，使得整体功能性可能不受明显影响。

在本发明的另一个实施方案中，所述错义突变是保守突变或置换。

本发明的另一个实施方案涉及分离的核酸序列或多肽序列，其与hh1的可变重链(seqidno:1)和/或可变轻链(seqidno:3)序列具有80％序列同一性，其中所述序列变异是保守置换。

在本发明的另一个实施方案中，所述序列同一性是80％同一性，诸如90％同一性、91％同一性、92％同一性、93％同一性、94％同一性、95％同一性、96％同一性、97％同一性、98％同一性或99％同一性，且所述序列变异是保守置换。

为了改善放射性标记步骤，可能有益的是，将额外的赖氨酸引入例如本发明的嵌合抗体或人源化抗体的fc部分中。

这可以减小将结合赖氨酸的螯合剂连接到该抗体的抗原结合位点中的概率，由此降低在放射性标记过程中损害免疫反应性的风险。

用于将赖氨酸引入例如hh1的fc部分中的方法是本领域已知的，例如从hemminki等人,1995已知。

本发明的一个实施方案涉及本发明的放射免疫缀合物，该放射免疫缀合物已在hh1的fc部分中用10个lys(诸如8个lys，诸如6个lys，诸如5个lys，诸如4个lys，诸如3个lys，诸如2个lys，诸如1个lys)修饰。

可以选择本发明的抗体的fc部分的其它变异，以便优化或调节一种或多种效应子功能。

例如做出这些效应子功能的调节，以增加抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)。

fc部分的这样的变异是本领域已知的。

因而，本发明的一个方面涉及这样的本发明的抗体：其在fc结构域中具有调节一种或多种效应子功能的一种或多种突变。

免疫缀合物

免疫缀合物是与第二分子(经常是毒素、放射性同位素或标记)缀合(结合)的抗体。

这样的嵌合的和人源化的hh1的免疫缀合物是本发明的所有方面。

一种类型是与螯合接头连接或结合的本发明的嵌合的和人源化的hh1。

在下面的关于放射免疫缀合物的部分中讨论了螯合接头，因此其中描述的螯合接头都被认为可用于免疫缀合物，所述免疫缀合物包含与螯合接头连接或结合的本发明的嵌合的和人源化的hh1。

放射免疫缀合物

本发明的一个方面涉及一种结合人cd37的放射免疫缀合物，其包含根据本发明从单克隆抗体hh1衍生出的嵌合抗体或人源化抗体、接头和选自由²¹¹at、²¹³bi、²¹²bi、²¹²pb、²²⁵ac、²²⁷th、⁹⁰y、¹⁸⁶re、¹⁸⁸re、¹⁹⁹au、¹⁹⁴ir、¹⁶⁶ho、¹⁵⁹gd、¹⁵³sm、¹⁴⁹pm、¹⁴²pr、¹¹¹ag、¹⁰⁹pd、⁷⁷as、⁶⁷cu、⁴⁷sc和¹⁷⁷lu组成的组的放射性核素。

在本发明的一个实施方案中，所述接头是螯合接头。

在本发明的另一个实施方案中，所述放射性核素选自由¹⁷⁷lu、²²⁵ac、²²⁷th和⁹⁰y组成的组。

在本发明的另一个实施方案中，所述放射性核素是¹⁷⁷lu。

在本发明的另一个实施方案中，所述放射性核素是²¹²pb。

在另一个实施方案中，所述放射性核素是另一种β-发射体或α-发射体。

可以如下将放射性核素连接至抗体：首先使双功能螯合剂例如p-scn-bn-dota(macrocyclics,tx,usa)与抗体反应，随后纯化以除去未缀合的螯合剂，然后使螯合剂抗体缀合物与放射性核素反应，随后纯化以除去任何未缀合的放射性核素。

可替换地，可以首先组合螯合剂和放射性核素，随后与抗体缀合。

螯合接头(如，例如，p-scn-bn-dota)可以用于将其它金属放射性核素以与对于¹⁷⁷lu所述类似的方式缀合至hh1衍生的抗体。

可以使用具有足够的复合能力以及允许与蛋白或肽直接或间接缀合的官能团的任何类型的接头。

这样的接头的例子描述于文献中(例如brechbiel,2008；liu,2008)。一些有用的例子是双官能的环状螯合剂，如p-scn-bn-dota、dota-nhs-酯、p-scn-bn-tcmc；双官能的直链螯合剂，如p-scn-bn-dtpa和chx-a”-dtpa。

优选通过使用双官能螯合剂将本发明中的放射性核素与靶向分子缀合。

这些可以是环状、线性或支链螯合剂。特别应提到的是聚氨基聚酸螯合剂，其包含线性、环状或分支的聚氮杂烷烃主链，其中多个酸性(例如，羧基烷基)基团连接在主链氮上。

合适的螯合剂的例子包括：dota衍生物诸如对异硫氰酰基苄基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(p-scn-bz-dota)或s-2-(4-异硫氰酰基苄基)-1,4,7,10-四(2-氨甲酰基甲基)环十二烷，和dtpa衍生物诸如对异硫氰酰基苄基-二亚乙基三胺五乙酸(p-scn-bz-dtpa)，前者是环状螯合剂，后者是线性螯合剂。

可以在复合部分与靶向部分缀合之前或之后进行复合部分的金属化。

如果在进行放射性标记之前将螯合剂与抗体缀合，则放射性标记程序将一般在所用时间等方面更方便。

使用与抗体连接的螯合剂来制备放射性标记的缀合物的原理更宽泛地描述在例如liu,2008中。

因此，可以使用hh1衍生出的嵌合抗体或人源化抗体来制备具有不同辐射性能和有效半衰期的放射免疫缀合物。

例如，可以制备抗-cd37放射免疫缀合物并将其用于制备药物制剂和用在治疗用途中，所述抗-cd37放射免疫缀合物由根据本发明从单克隆抗体hh1衍生出的嵌合抗体或人源化抗体、螯合接头和发射β或α的放射性核素组成，所述放射性核素包括、但不限于¹⁷⁷lu、²¹¹at、²¹³bi、²¹²bi、²¹²pb、²²⁵ac、²²⁷th、⁹⁰y、¹⁸⁶re、¹⁸⁸re、¹⁹⁹au、¹⁹⁴ir、¹⁶⁶ho、¹⁵⁹gd、¹⁵³sm、¹⁴⁹pm、¹⁴²pr、¹¹¹ag、¹⁰⁹pd、⁷⁷as、⁶⁷cu、⁴⁷sc。

免疫毒素

免疫毒素是由与毒素连接的靶向部分组成的人造蛋白。当蛋白结合细胞时，它通过胞吞作用被摄入，毒素杀死所述细胞。

它们经常被用于治疗某些种类的癌症和少数病毒感染。

这些蛋白经常由与毒素片段连接的经修饰的抗体或抗体片段制成。

靶向部分由抗体的靶向特定细胞类型的fv部分组成。

所述毒素经常是从细菌或植物蛋白衍生出的细胞毒性蛋白，从所述细菌或植物蛋白已经除去天然结合结构域，使得fv将毒素导向靶细胞上的抗原。

在本发明的另一个实施方案中，所述毒素是化疗分子，包括、但不限于烷化剂(顺铂、卡铂、奥沙利铂、氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺)、抗代谢药(硫唑嘌呤、巯嘌呤、嘧啶)、生物碱(长春新碱、长春碱、长春瑞滨(cinorelbine)、长春地辛、紫杉醇、多西他赛、依托泊苷、替尼泊苷)、拓扑异构酶抑制剂(伊立替康、托泊替康、偶氮丝氨酸(amascrine)、依托泊苷、替尼泊苷)和细胞毒性的抗生素(放线菌素、多柔比星、柔红霉素、calrubicin、伊达比星、表柔比星、博来霉素、普卡霉素、丝裂霉素)。

在本发明的一个实施方案中，经由交联剂smcc-酰肼(4-[n-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1羧基酰肼)将多柔比星缀合至抗体。

免疫毒素如下起作用：抗体(或其它靶向部分)结合靶细胞上的抗原，随后毒素进入细胞并杀死细胞。

因而，本发明的一个方面涉及包含本发明的抗体或其片段的免疫毒素。

药物组合物

经常应用配制在药物组合物中的抗体来治疗疾病。

这样的组合物针对诸如生理耐受性和贮存期限等参数进行了优化。

因而，本发明一个方面涉及药物组合物，其包含作为活性成分的本发明的一种或多种抗-cd37抗体分子(即从hh1衍生出的嵌合抗体或人源化抗体或其片段)和药学上可接受的载体。

本发明的一个实施方案涉及如上所述的药物组合物，其还包含一种或多种额外治疗剂。

在本发明的一个实施方案中，所述一种或多种额外治疗剂选自靶向b-细胞抗原而不是cd37的药剂。

这样的抗原可以是b-细胞抗原cd20。

在本发明的另一个实施方案中，所述一种或多种额外治疗剂选自诱导细胞凋亡的药剂。

通常将基于嵌合的或人源化的hh1的放射免疫治疗产品提供为药物组合物，其由根据以上描述经由螯合剂与溶解在缓冲溶液中的嵌合抗体或人源化抗体hh1连接的放射性核素组成，这在很大程度上保持放射免疫缀合物的化学完整性，并且就输注进患者中而言是生理上可接受的。

因而，本发明的一个方面涉及一种药物组合物，其包含本发明的放射免疫缀合物和药学上可接受的载体和/或赋形剂。

可接受的药用载体包括、但不限于：无毒的缓冲剂、填充剂、等渗溶液等。更具体地，所述药用载体可以是、但不限于：生理盐水(0.9％)、半生理盐水、林格氏乳酸盐、5％右旋糖、3.3％右旋糖/0.3％盐水。生理上可接受的载体可以含有放射分解的稳定剂(例如，抗坏血酸)，其在贮存和运输期间保护放射性药物的完整性。

本发明的一个实施方案包含本发明的药物组合物和一种或多种额外的抗体或放射免疫缀合物。抗体包括、但不限于：利妥昔单抗、依帕珠单抗(epratuzumab)、l19、f8、f16、加利昔单抗(galiximab)、托利珠单抗(toralizumab)、阿仑珠单抗(alemtuzumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、阿托珠单抗(afutuzumab)、托西莫单抗(tositumomab)、reditux、替伊莫单抗(ibritumomab)、k7153a、37.1和hh1。

放射免疫缀合物包括、但不限于：泽娃灵(zevalin)、bexxar和betalutin。

在本发明的另一个实施方案中，一种或多种额外的抗体或放射免疫缀合物靶向cd20。抗体包括、但不限于：利妥昔单抗、维妥珠单抗、奥法木单抗、阿托珠单抗、托西莫单抗、reditux和替伊莫单抗。放射免疫缀合物包括、但不限于：泽娃灵和bexxar。

本发明的另一个实施方案涉及本发明的药物组合物，其用于治疗表达cd37抗原的b-细胞恶性肿瘤细胞。

在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物被用于治疗选自由b-细胞非霍奇金淋巴瘤、b-细胞慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病、小成淋巴细胞性淋巴瘤和多发性骨髓瘤组成的组的b-细胞恶性肿瘤。

治疗

根据本发明的药物溶液的治疗用途可以是用于治疗表达cd37抗原的恶性肿瘤细胞，包括、但不限于选自由b-细胞非霍奇金淋巴瘤、b-细胞慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤和多发性骨髓瘤组成的组的b-细胞恶性肿瘤。

其它用途可以是治疗自身免疫疾病和治疗移植相关的效应。

所述疗法可以基于、但不限于：β-颗粒-辐射或α-颗粒-辐射或这些的组合。

所述疗法可以作为单一疗法施用，或者与其它疗法、优选标准治疗方法联合施用。这样的其它疗法可以是预处理、外科手术、化学疗法(包括多柔比星、长春碱和吉西他滨(gemcitabine))、免疫疗法、光动力学疗法、蛋白酶体抑制剂(包括硼替佐米(bortezomib))、组蛋白脱乙酰酶抑制剂(包括伏林司他(vorinostat)和辛二酰苯胺异羟肟酸)、维生素d3和维生素d3类似物、细胞周期检验点抑制剂(包括ucn-01和2-(4-(4-氯苯氧基)苯基)-1h-苯并咪唑-5-甲酰胺)、低氧细胞放射敏化剂(包括甲硝唑(metronidazole)和米索硝唑(misonidazole))、细胞凋亡诱导物(包括醉茄素a(withaferina))放射敏化剂、放射免疫疗法或这些中2种或更多种的组合。

施用是指静脉内输注或静脉内注射。更具体地，本发明的放射免疫缀合物可以通过连接到滴注器的周围插管直接施用进静脉中，所述滴注器防止空气栓塞并且允许估测进入患者体内的流速。

在一个实施方案中，可以以重复方式施用所述放射免疫缀合物。

在本发明的另一个实施方案中，可以以重复方式，但是用不同的放射性核素施用放射免疫缀合物，例如，可以在β-放射免疫疗法之后进行α-放射免疫疗法，或反之亦然。

本发明的一个方面涉及本发明的放射免疫缀合物用于治疗b细胞恶性肿瘤的用途。

本发明的一个实施方案涉及与其它疗法联合施用或在其它疗法基础上额外施用的本发明的放射免疫缀合物的用途。

在本发明的一个实施方案中，所述其它疗法选自预处理、化学疗法、单克隆抗体疗法、外科手术、放射疗法和/或光动力学疗法。

在本发明的另一个实施方案中，所述其它疗法是骨髓移植或干细胞移植和/或疗法。

本发明的另一个实施方案包含，使用抗-cd20和/或抗-cd37单克隆抗体进行治疗预处理，然后用本发明的放射免疫缀合物治疗。

在本发明的一个实施方案中，如下进行预处理：施用本发明的嵌合抗体，随后用hh1的嵌合抗体的放射免疫缀合物或抗体hh1的放射免疫缀合物进行治疗。

本发明的一个方面涉及用于治疗选自由b-细胞非霍奇金淋巴瘤、b-细胞慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤和多发性骨髓瘤组成的组的b-细胞恶性肿瘤的方法，所述方法包括：施用有效量的本发明的药物组合物。

在本发明的一个实施方案中，在体外或离体执行本发明的应用和治疗方法。

在本发明的一个实施方案中，抗体剂量是1-1000mg/患者，更优选5-50mg/患者，且¹⁷⁷lu量为1-200mbq/kg，更优选10-100mbq/kg体重。

包含本发明的嵌合抗体或人源化抗体的本发明的药物组合物可以用于耗尽在它们的表面上表达cd37的b细胞。

这样的药物组合物可以用于治疗b-细胞恶性肿瘤。

这些b-细胞恶性肿瘤可以选自：b-细胞非霍奇金淋巴瘤、b-细胞慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤和多发性骨髓瘤。

本发明的一个实施方案涉及包含本发明的嵌合抗体或人源化抗体的药物组合物，其用于治疗在它们的病理学中涉及b-细胞的自身免疫疾病或炎性疾病。

本发明的另一个实施方案涉及从细胞群体中耗尽表达cd37的b-细胞的方法，所述方法包括：给所述细胞群体施用本发明的抗体分子或含有这样的抗体分子的药物组合物。

本发明的另一个实施方案涉及用于治疗患者的方法，所述患者患有选自由b-细胞非霍奇金淋巴瘤、b-细胞慢性淋巴细胞白血病和多发性骨髓瘤组成的组的b-细胞恶性肿瘤，所述方法包括：给所述患者施用有效量的包含本发明的嵌合抗体或人源化抗体的药物组合物。

在一个特定实施方案中，在用放射性标记形式或免疫毒素形式的鼠嵌合的或人源化的hh1治疗之前，将嵌合的或人源化的hh1施用给患者，以封闭正常组织细胞和改善肿瘤摄取。

所述剂量应当足以阻断正常组织摄取，但是没有过量，因为这会减少肿瘤摄取。例如，应当以0.5mg-1g/患者的剂量施用嵌合的或人源化的hh1。

例如，可以在施用放射免疫缀合物之前1周和/或1-5小时施用它。

试剂盒

本发明的一个方面涉及一种用于制备本发明的放射免疫缀合物的试剂盒，其包含两个或更多个瓶，其中一个瓶含有缀合物，该缀合物包含与鼠单克隆抗体hh1连接的螯合剂；并且第二个瓶含有放射性核素。

试剂盒可能需要进行一些程序，例如在输注之前进行放射性标记和/或纯化。

本发明的一个实施方案涉及本发明的试剂盒，其中一个或几个瓶的内容物是冻干的或呈溶液形式。

通过将两个瓶的内容物混合以产生放射免疫缀合物，将得到最终产物。因而，在本发明的另一个实施方案中，通过将两个瓶的内容物混合来产生放射免疫缀合物。

该产物可能需要在使用前进行纯化。

应当指出，在本发明的一个方面的背景下描述的实施方案和特征也适用于本发明的其它方面。

在本申请中引用的所有专利和非专利参考文献特此通过引用整体并入。

现在将在下述非限制性实施例中更详细地描述本发明。

实施例

实施例1嵌合抗体的制备

使用v-区域基因的表达载体，制备嵌合形式的hh1抗体。

该载体接受通过rt-pcr得到的vh和vl链基因。

然后将v-基因测序，并设计新的特异性引物来扩增v-基因，然后将它们克隆进含有人igg抗体恒定区基因(cγ3、cγ1和ch1γ3)的plnoh2载体中。

在seqidno.8中显示了包括恒定区igg1ch1(seqidno.5)、igg1ch2(seqidno.6)、igg1ch3(seqidno.7)的plnoh2载体。

将载体plnoh2(seqidno.5)和plnoκ的重链和轻链组合，以制备组合载体plnoh2γ1/καcd37。将整个轻链基因(seqidno:9)、cmv启动子和plnoκαcd37的聚腺苷酸信号亚克隆到plnoh2higg1αcd37上。

在组合载体中，从它们自己的cmv启动子表达重链和轻链。

恒定结构域的鉴别

从imgt数据库中的人igg1的序列(登录号:z17370)，鉴别出plnoh2序列中的恒定结构域。

chhh1抗-cd37抗体的可变区的基因和蛋白序列如下：

vhαcd37(氨基酸序列:seqidno:1和核酸序列:seqidno:2)

核酸序列(seqidno:2)：

gagatccagctgcagcagtctggacctgagctggtgaagcctggggcttcagtgaaggtatcctgcaaggcttctggttactcattcactgactacaacatgtactgggtgaagcagagccatggaaagagccttgagtggattggatatattgatccttacaatggtgatactacctacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactgttgacaagtcctccagcacagccttcatccatctcaacagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagatccccttatggtcactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca

氨基酸序列(seqidno:1)：

eiqlqqsgpelvkpgasvkvsckasgysftdynmywvkqshgkslewigyidpyngdttynqkfkgkatltvdkssstafihlnsltsedsavyycarspyghyamdywgqgtsvtvss

vlαcd37(氨基酸序列:seqidno:3和核酸序列:seqidno:4)

核酸序列(seqidno:4)：

gacattgtgatgacccagtctcacaaactcttgtccacatcagtaggagacagggtcagcatcacctgcaaggccagtcaggatgtgagtactgctgtagactggtatcaacagaaaccaggacaatctcctaaactactgattaactgggcatccacccggcacactggagtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagattatactctcaccatcagcagtatgcaggctgaagacctggcactttattactgtcgacaacattatagcactccattcacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaa

氨基酸序列(seqidno:3)：

divmtqshkllstsvgdrvsitckasqdvstavdwyqqkpgqspkllinwastrhtgvpdrftgsgsgtdytltissmqaedlalyycrqhystpftfgsgtkleik

实施例2用于评价抗原结合的流式细胞术

hchigg1ααcd37b(chhh1)与表达cd37的daudi细胞的结合分析

将细胞染色并固定。

通过流式细胞术，分析构建的chhh1的靶标结合。daudi细胞表达cd37，用chhh1或higg1αnip对细胞进行染色。在左图中，选择完整的daudi细胞，在右图中显示了这些染色的细胞的荧光直方图。chhh1结合表达cd37的daudi细胞(实线)，而嵌合的αnipigg1没有结合(虚线)。

实施例3嵌合hh1的放射性标记

碘化：根据生产商的描述，使用iodogen预包被的碘化试管(pierce,rockford,il)，通过间接碘化法用¹²⁵i对抗体进行标记。

用¹¹¹in和¹⁷⁷lu进行标记：首先使抗体与螯合剂(p-scn-bn-dtpa或p-scn-bn-dota)反应。

将dtpa或dota螯合剂溶解于0.05mhcl中，随后加到抗体中，通过用碳酸盐缓冲液按5:1的比率洗涤，将ph调到大约8.5。然后再次检查ph，并且在必要时进行调节。将该溶液在室温下振荡60分钟，然后通过加入50μl200mm甘氨酸溶液(每mg抗体)来终止反应。

为了除去游离的螯合剂，用pbs(paa)将经过缀合的抗体洗涤4-5次，然后通过用乙酸铵洗涤调至ph5。然后将¹¹¹in或¹⁷⁷lu(perkinelmer,boston,ma,usa)加到0.5mgdota-ab中，并在42℃振荡1小时。

最后，通过在凝胶过滤柱(例如，sephadexg-25pd10(gehealth)或类似柱)上洗脱来纯化产物。总标记产率在17％到63％之间变动。

使用淋巴瘤细胞和经改进的lindmo法来测量放射免疫缀合物的质量(实施例4)。

实施例4免疫反应性

背景：使用免疫反应性分析来测量抗体的结合抗原阳性的靶细胞的能力。

方法：使用2组平行的在大约0.3ml中的500万、1000万、4000万、1亿或3亿个细胞/ml。

给一半试管加入未标记的抗体至0.5mg/ml的浓度，并孵育15min以封闭抗原。

此后，将5-20ng/ml放射免疫缀合物加入到所有试管中，并使用振荡器将混悬液在4℃孵育大约2小时。

此后将试管离心，并取出上清液和储存用于计数。将细胞沉淀物(pellet)再悬浮于1mlpbs中并离心。将该洗涤程序重复2次，并合并上清液。在γ计数器上计数含有细胞沉淀物或合并的上清液的试管。

使用以下指标计算特异性结合活性：未封闭的细胞沉淀物计数(pcn)、合并的上清液计数(csc)和每个样品的总应用量(ta)。如下计算特异性结合(sb)：(pcn/ta)-封闭的(pcn/ta)＝sb。

为每种细胞浓度计算sb值，并绘制在双倒数图中，并根据lindmo等人(jimmunolmethods.1984年8月3日；72(1):77-89)确定在无穷抗原接近时的免疫反应级分。

结果：两批¹⁷⁷lu-标记的嵌合hh1的测量结果分别给出48.1％和84.5％的免疫反应性。一批¹²⁵i-标记的嵌合hh1给出67.6％的免疫反应性。总之，这些数据与关于鼠hh1常见的那些数据非常一致，并且表明，嵌合hh1具有有关的抗原靶向能力。

实施例5在体外结合肿瘤细胞

前言：进行结合测定，以便确定chhh1的平衡结合常数(kd)、daudi细胞上的抗原的平均数目(bmax)和chhh1的结合速率常数(ka)(dahle等人,2007)。

材料和方法：用¹²⁵i标记chhh1(实施例3)。将在0.4ml培养基中的500万细胞/ml悬浮于试管中。在加入¹²⁵i-标记的chhh1之前，将一组平行细胞用0.5mg/ml未标记的chhh1封闭15分钟。一组平行细胞没有封闭。将两组平行细胞与100、1000、5000和10000ng/ml¹²⁵i-hh1一起孵育。将细胞孵育5、10、20、30分钟和1、1.5和2小时。孵育以后，将细胞用含有5％胎牛血清的pbs洗涤。在γ计数器中计数细胞和上清液和洗液。将实验重复3次。

结果：典型结合曲线显示在图2中。chhh1的kd为3.0±0.3，daudi细胞的的bmax为330000±4000个cd37抗原/细胞，且chhh1的ka为0.36±0.03nm/h。数据类似于鼠hh1(kd＝2.7±0.3，bmax＝340000±5000个cd37抗原/细胞，ka0.72±0.03nm/h)。

实施例6小鼠中的生物分布和肿瘤靶向

在雄性balb/c裸小鼠中研究了¹⁷⁷lu-标记的嵌合hh1的生物分布。

材料和方法：使用p-scn-bn-dota作为双官能螯合剂进行放射性标记，以将放射性核素连接到抗体(参见实施例3)。通过对每只动物的尾静脉注射100μl溶液来施用所述制剂。

使用体重为21-25g的雄性balb/c裸小鼠。

在每只动物中注射120kbq的活性物。每个时间点使用五只动物。在注射后的不同时间点，在颈椎脱位后进行尸体解剖。确定每个组织样品的重量，并借助经校准的γ检测器(cobraii自动γ检测器，packardinstrumentcompany,meriden,ct,usa)来测量¹¹¹in。在测量规程中，使用注射物的样品作为参照物。

结果：在注射后1小时、20小时和6天的¹⁷⁷lu-嵌合hh1的生物分布显示在表1中。数据表明，所述抗体具有与用放射性标记的利妥昔单抗所观察到的结果类似的相关生物分布(dahle等人,2006nuclmedbiol,33,271-279)。综上所述，放射性标记的嵌合hh1的生物分布指示，所述抗体具有用于体内应用的相关性能。

表1¹⁷⁷lu-标记的嵌合hh1在雄性balb/c裸小鼠中的生物分布，以每克的注射剂量的百分比±sd

实施例7使用流式细胞术生存力测量的体外adcc测定

背景：使用天然杀伤(nk)细胞和daudi淋巴瘤细胞，评价嵌合hh1抗体的adcc性能。

方法：从志愿者收获人血液，并用lymphoprep和dynabeads处理，以得到分离的nk细胞。将daudi细胞用dioc18处理以对细胞染色。

通过在37℃孵育30分钟，用10μldioc18(每10⁶个靶细胞/ml)标记daudi靶细胞。将细胞用pbs洗涤2次，并在细胞培养基中重新悬浮至1ml。

如下用抗体标记dioc18处理过的daudi细胞：加入嵌合hh1或作为对比的利妥昔单抗至10μg/ml的浓度，并在冰上孵育15分钟，然后离心和再悬浮，以除去未结合的抗体。

将不同量的nk细胞在细胞培养基中稀释，以产生4×10⁵/ml(40:1)、2×10⁵/ml(20:1)、1×10⁵/ml(10:1)和5×10⁴/ml(5:1)的浓度。通过加入40μlpi/ml培养基来制备复染剂溶液，制备碘化丙啶复染剂。

将标记的daudi细胞在培养基中稀释至10⁴/ml。通过将50μl效应细胞和50μldaudi细胞混合进反应试管中，开始测定。

向反应试管中加入50μlpi溶液。在37℃孵育2小时以后，使用流式细胞术评价存活的daudi细胞的百分比。

对于chhh1，11％的daudi细胞死于adcc，而对于利妥昔单抗，15％的细胞死于adcc。对于两种抗体，adcc的诱导百分比没有显著不同(参见图3)。

实施例8使用白介素刺激的pbmc的体外adcc细胞测定

背景：通过cr51释放测定，评价了鼠和嵌合形式的mabhh1的adcc活性。

材料和方法：使用daudi细胞作为靶细胞，并使用il2刺激的人pbmc作为效应细胞，评估鼠hh1和嵌合hh1的介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)的能力。

使用补充了10％热灭活的胎牛血清、1mm丙酮酸钠、2mml-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的rpmi-1640，在组织培养瓶(175cm2)中培养daudi细胞(人伯基特氏(burkitt’s)淋巴瘤细胞系)。

通过每周用新鲜培养基继代培养2-3次，将培养物维持在3×10⁵至1.5×10⁶/ml的细胞浓度。将细胞密度在0.5×10⁶/ml至1.0×10⁶/ml之间的细胞培养物的等分试样离心(1200rpm)5min。

将细胞用洗涤缓冲液(含有2％fcs的dpbs)洗涤1次，并沉淀(1200rpm；5min)。将细胞沉淀物再悬浮于测定培养基[含有hepes、10％fcs的rpmi]中，并确定细胞计数。将细胞浓度调至1×10⁶/ml用于进行铬-51标记。

将大约30-50ml得自健康供体的吸附在edta玻璃上的全血用于分离pbmc。在50ml试管中用dpbs(不含钙和镁的汉克平衡盐溶液)对全血进行1:1稀释。

在50ml试管中以2:1比率将稀释的全血铺层在lymphoprep(medinor)的上面，并在缓慢制动下在1000×g离心20min。从界面抽吸单核细胞，并用dpbs洗涤2次(300×g,10min)。

使用移液器将沉淀的细胞轻轻再悬浮于培养基(含有10％热灭活的胎牛血清、1％青霉素/链霉素的rpmi-1640)中，并在细胞计数器中确定细胞计数。

将pbmc浓度调至5×10⁵/ml，并维持在补充了25ng/mlil-2(ebiosciences)的培养基中，并在co2培养箱在37℃在6孔培养皿中培养3天。收集il-2刺激的pbmc，计数，并以1.5×10⁶/ml的浓度再悬浮于测定培养基[含有hepes、10％fcs的rpmi]中。

在1ml的体积，在37℃用3，7mbq铬-51(cr51)标记1×10⁶个daudi细胞1小时。

通过离心(2000rpm，5min)，将经标记的细胞在含有2％fcs的dpbs中洗涤3次。

将经标记的细胞等分成等体积，用于鼠和嵌合hh1的结合，包括不含有抗体的对照。将所有样品在37℃孵育10min，然后用含有2％fcs的dpbs洗涤2次，离心(2000rpm，5min)3次。

以200μl的终体积，在96-孔圆底微量滴定板中一式三份地进行效应细胞与靶细胞的共培养。

首先，将在100μl体积的测定培养基中的10.000个靶细胞铺平板，随后将不同浓度的100μl体积中的效应细胞铺平板，以达到测定的效应细胞:靶细胞比率。

作为对照，在单独的测定培养基中(自发裂解)或在补充了1％tritonx-100的测定培养基中(最大裂解)培养靶细胞。

将共培养物在潮湿的co2培养箱中在37℃孵育4小时。通过向上清液中的cr51释放，测量细胞毒性效应。在孵育结束时，通过在室温离心(1500rpm；5min)，从培养基除去细胞。将不含细胞的上清液(100μl/孔)转移进96个对应的0.2ml微试管中。通过在packardcobraiigamma计数器中计数，测量释放的cr51的量。

结果：实验结果呈现在表2中。如所示的，对于所有3个血液供体，用嵌合hh1预处理的daudi细胞的细胞裂解是显著的。

与没有用抗体预处理的daudi细胞相比，鼠hh1预处理似乎不会造成任何显著的裂解。

表2.与用抗-cd37抗体预处理的daudi淋巴瘤靶细胞相比，用白介素刺激的pbmc效应细胞处理以后的体外细胞裂解

效应细胞得自3个个体。将数据标准化为没有抗体时测得的细胞裂解(将其选择为100％)。

结论：当使用人pbmc体外测定时，嵌合hh1以对体外淋巴瘤细胞的细胞裂解的方式造成显著的adcc，而鼠hh1与没有处理相比没有影响任何显著的细胞裂解效应。

实施例9嵌合hh1和鼠hh1之间的结合对比

为了评价嵌合hh1是否保留抗原和表位结合能力，将细胞用嵌合hh1和鼠hh1饱和，然后评估封闭放射性标记的hh1的结合的能力。

材料和方法：将daudi细胞的细胞混悬液分布在6个试管中，在每个试管中在0.2mlpbs中含有170万个细胞。将试管1和2保持未封闭，将试管3和4通过加入3μghh1(在5μl中)进行封闭，并向试管5和6加入3μg嵌合hh1(在5μl中)。

将试管孵育10分钟，此后加入2ng125i标记的hh1，并使用细胞振荡器在室温进一步孵育40分钟。

使用lkbγ计数器测量每个试管中的总活性，此后将细胞用1ml含有0.5％bsa和1mmdtpa的pbs洗涤3次。对最终的沉淀物计数放射性，以确定细胞结合的活性。

结果：发现未封闭的细胞保留42.7％的活性(范围42.7％-42.7％)。用hh1封闭的细胞保留1.6％的活性(范围1.4％-1.8％)。用嵌合hh1封闭的细胞保留1.3％的活性(范围1.1％-1.5％)。

综上所述，放射性标记的鼠hh1的结合被嵌合hh1非常有效地封闭，且象用鼠hh1封闭一样有效，从而指示，嵌合形式的hh1维持抗原和表位结合能力。

这也指示，嵌合hh1可以用作在用放射免疫缀合物或免疫毒素形式的hh1治疗之前用于封闭正常组织中的cd37抗原的预处理。

实施例10：用rec-1细胞作为靶细胞的chhh1.1的adcc

材料和方法：

从3个健康个体抽取血液到edta玻璃瓶中，并用于外周血单核细胞(pbmc)分离。将全血在50ml试管中用dpbs(dpbs,hyclone,thermoscientific,usa)进行1:1稀释。在50ml试管中将经稀释的全血以2:1比率铺层在lymphoprep(medinor,挪威)的上面，并在缓慢制动下在1000×g离心20min。

从界面抽吸单核细胞，并用dpbs(300×g,10min)洗涤2次。使用移液器将沉淀的细胞轻轻再悬浮于培养基(含有10％热灭活的胎牛血清的rpmi-1640)中，并在细胞计数器中确定细胞计数。

将pbmc用25ng/ml人重组il-2(ebiosciences)刺激3天。

在细胞毒性测定中使用rec-1套细胞淋巴瘤细胞(lgstandards,boras,瑞典)作为靶细胞。

使用补充了10％热灭活的胎牛血清(paa,thermoscientific,usa)的rpmi-1640(hyclone,thermoscientific,usa)，在组织培养瓶(175cm²)中培养它们。

将细胞沉淀物再悬浮于测定培养基(rpmi,10％fcs)中，并确定细胞计数。将细胞浓度调至5×10⁶/ml用于进行铬-51标记。

将5×10⁶个细胞以1ml的体积用3，7mbq铬-51(⁵¹cr)(perkinelmer,荷兰)在37℃标记1小时。将经标记的细胞在含有2％fcs的dpbs中洗涤3次，离心(2000rpm，5min)三次。

将经标记的细胞等分成等体积，用于20μg/ml鼠hh1、20μg/ml利妥昔单抗、20μg/mlchhh1.1(igg1同种型)或20μg/ml利妥昔单抗和20μg/mlchhh1.1的组合的结合，包括不含有抗体的对照。将所有样品在37℃孵育10min，然后用含有2％fcs的dpbs洗涤2次，离心(2000rpm，5min)3次。

以200μl的终体积，在96-孔圆底微量滴定板中以40:1、20:1或10:1的比率进行效应细胞与靶细胞的共培养。

首先，将在100μl体积的测定培养基中的10.000个靶细胞铺平板，随后将100μl体积中的人pbmc铺平板。作为对照，在单独的测定培养基中(自发裂解)和在补充了1％tritonx-100的测定培养基中(最大裂解；总释放)培养靶细胞。

一式三份地运行所有样品。将共培养物在潮湿的co2培养箱中在37℃孵育4小时。通过向上清液中的⁵¹cr释放，测量细胞毒性效应。在孵育结束时，通过在室温离心(1500rpm；5min)，从培养基除去细胞。将不含细胞的上清液(150μl/孔)转移进96个对应的0.2ml微试管中。通过γ计数器(cobraii,packard,land)测量释放的⁵¹cr的量。

用下述方程式计算％特异性裂解：100×(实验释放-自发释放)/(总释放-自发释放)。实验释放是一式两份样品处理的平均值。对于每个抗体处理组运行自发释放和总释放的一式三份样品，并将平均值用于各种抗体处理的实验样品。

结果：

图4表明，在通过adcc诱导rec-1细胞的特异性裂解方面，chhh1.1象利妥昔单抗一样好，且稍微优于鼠hh1。chhh1和利妥昔单抗的组合产生了比用2种抗体单独处理稍微更高的特异性裂解。

结论：

adcc是chhh1.1在rec-1细胞中的活性作用机理。使用利妥昔单抗和chhh1.1的联合治疗产生了比任一种单独抗体稍微更高的adcc。

实施例11：用rec-1细胞作为靶细胞时chhh1.1的cdc

材料和方法：

从3个健康个体抽取血液，并通过离心分离血清。

在细胞毒性测定中使用rec-1套细胞淋巴瘤细胞(lgstandards,boras,瑞典)作为靶细胞。使用补充了10％热灭活的胎牛血清(paa,thermoscientific,usa)的rpmi-1640(hyclone,thermoscientific,usa)，在组织培养瓶(175cm²)中培养它们。

将细胞沉淀物再悬浮于测定培养基(rpmi,10％fcs)中，并确定细胞计数。将细胞浓度调至5×10⁶/ml用于进行铬-51标记。

将5×10⁶个细胞在1ml的体积中用3，7mbq铬-51(⁵¹cr)(perkinelmer,荷兰)在37℃标记1小时。将经标记的细胞在含有2％fcs的dpbs中洗涤3次，离心(2000rpm，5min)三次。将经标记的细胞等分成等体积，用于20μg/ml鼠hh1、20μg/ml利妥昔单抗、20μg/mlchhh1.1(igg1同种型)或20μg/ml利妥昔单抗和20μg/mlchhh1.1的组合的结合，包括不含有抗体的对照。将所有样品在37℃孵育10min，然后用含有2％fcs的dpbs洗涤2次，离心(2000rpm，5min)3次。

以200μl的终体积，在96-孔圆底微量滴定板中用10％血清培养靶细胞。作为对照，在单独的测定培养基中(自发裂解)和在补充了1％tritonx-100的测定培养基中(最大裂解；总释放)培养靶细胞。

一式三份地运行所有样品。将共培养物在潮湿的co2培养箱中在37℃孵育2小时。通过向上清液中的⁵¹cr释放，测量细胞毒性效应。在孵育结束时，通过在室温离心(1500rpm；5min)，从培养基除去细胞。将不含细胞的上清液(150μl/孔)转移进96个对应的0.2ml微试管中。通过γ计数器(cobraii,packard,land)测量释放的⁵¹cr的量。

用下述方程式计算％特异性裂解：100×(实验释放-自发释放)/(总释放-自发释放)。实验释放是一式两份样品处理的平均值。对于每个抗体处理组运行自发释放和总释放的一式三份样品，并将平均值用于各种抗体处理的实验样品。

结果：

图5表明，chhh1.1不会通过单独的cdc机制起作用，但是与单独的利妥昔单抗和chhh1.1的累加作用相比，chhh1.1和利妥昔单抗一起对特异性裂解具有更大的作用。

结论：

cdc不是单独chhh1.1的活性作用机理。但是，chhh1.1和利妥昔单抗的共处理存在协同效应。

实施例12:¹²⁵i-chhh1.3与ramos细胞的结合

材料和方法：

根据碘化试管的生产商(pierce,uk)提供的方法，使用间接碘化方法，用¹²⁵i放射性标记具有同种型igg3的嵌合hh1(chhh1.3)和鼠hh1(mhh1)。在一个实验中，ramos细胞用20mgchhh1.3或mhh1进行封闭，并用¹²⁵i-chhh1.3进行放射性标记，以便测量非特异性结合。

在另一个实验中，将ramos细胞用20mgchhh1.3、mhh1或chhh1.1封闭，随后用¹²⁵i-mhh1进行放射性标记，以测量非特异性结合。在2个实验中使用与未封闭的细胞的结合来测量总结合。

具有突变全长重链的dnachhh1.3fc序列可以被视作seqidno:10。

具有突变全长轻链的氨基酸chhh1.3fc序列可以被视作seqidno:11。

具有突变全长重链的dnachhh1.3fc序列可以被视作seqidno:12。

具有突变全长轻链的氨基酸chhh1.3fc序列可以被视作seqidno:13。

没有突变(恒定区)的chhh1.3fc序列可以被视作seqidno:14。

结果：

当用¹²⁵i-chhh1.3放射性标记未封闭的ramos细胞时，总结合为81％，当用¹²⁵i-mhh1放射性标记ramos细胞时，总结合为77％。但是，当用¹²⁵i-chhh1.3放射性标记用chhh1.3或mhh1封闭的细胞时，非特异性结合分别为0.8％和44％，从而指示chhh1.3比mhh1具有更高的对cd37抗原的亲和力。此外，当用¹²⁵i-mhh1放射性标记用chhh1.3、mhh1或chhh1.1封闭的细胞时，非特异性结合分别为0.3％、0.5％和0.7％，从而指示所述3种抗体结合cd37抗原上的相同表位。

表3.¹²⁵i-chhh1.3和125i-mhh1与ramos细胞的结合

结论：

结果指示，mhh1、chhh1.1和chhh1.3结合cd37的相同表位。意外地，chhh1.3的亲和力高于mhh1。

实施例13:¹²⁵i-chhh1.3在裸鼠中的生物分布

材料和方法：

根据碘化试管的生产商(pierce,uk)提供的方法，使用间接碘化方法，用¹²⁵i放射性标记具有同种型igg3的嵌合hh1(chhh1.3)。

通过尾静脉注射100μl溶液，将制剂施用给每只动物。每只小鼠注射600kbq的活性物。每个时间点使用2只动物。在注射后24小时和48小时，在颈椎脱位后进行尸体解剖。确定每个组织样品的重量，并借助经校准的γ检测器(cobraii自动γ检测器，packardinstrumentcompany,meriden,ct,usa)来测量每个器官样品中的¹²⁵i活性。在测量程序中，使用注射物的样品作为参照物。对于每个时间点，计算每克组织的注射剂量的衰变校正的百分比(％id/g)。

结果和结论：

chhh1.3抗体在裸鼠中表现出相关的分布(图6)。

图6.在注射后24和48小时，¹²⁵i-chhh1.3在雌性裸鼠中的生物分布(％i.d./g)。

实施例14：chhh1.3对daudi细胞的adcc和cdc活性

材料和方法：

除了以下方面以外，使用与在实施例10和11中所述相同的程序，进行adcc和cdc实验：使用商购可得的血清进行cdc测定，并且用25ng/ml人重组il-2(ebiosciences)刺激pbmc过夜，然后使用与在实施例7中所述相同的测定来分离天然杀伤细胞。对于pbmc的分离，从2个个体将血液抽入edta试管中。

在细胞毒性测定中使用daudi淋巴瘤细胞(lg标准品,boras,瑞典)(靶细胞)作为靶细胞。使用补充了10％热灭活的胎牛血清(paa,thermoscientific,usa)的rpmi-1640(hyclone,thermoscientific,usa)，在组织培养瓶(175cm²)中培养它们。

将细胞沉淀物再悬浮于测定培养基(rpmi,10％fcs)中，并确定细胞计数。将细胞浓度调至5×10⁶/ml用于进行铬-51标记。

将5×10⁶个daudi细胞以1ml的体积用4mbq铬-51(⁵¹cr)(perkinelmer,荷兰)在37℃标记1小时。将经标记的细胞在含有2％fcs的dpbs中洗涤3次，离心(2000rpm，5min)三次。将经标记的细胞等分成等体积，用于20mg/mlchhh1.3抗体或各自为20mg/ml的chhh1.3和利妥昔单抗的组合的结合，包括不含有抗体的对照。将所有样品在37℃孵育10min，然后用含有2％fcs的dpbs洗涤2次，离心(2000rpm，5min)3次。

对于cdc测定，以200μl的终体积在96-孔圆底微量滴定板中用10％和30％血清培养daudi靶细胞。对于adcc，以200μl的终体积在96-孔圆底微量滴定板中以10:1(个体1)或15:1(个体2)的比率将nk效应细胞与daudi靶细胞一起培养。

作为对照，在单独的测定培养基中(自发裂解)和在补充了1％tritonx-100的测定培养基中(最大裂解；总释放)培养靶细胞。

一式三份地运行所有样品。将共培养物在潮湿的co2培养箱中在37℃孵育2小时。通过向上清液中的⁵¹cr释放，测量细胞毒性效应。在孵育结束时，通过在室温离心(1500rpm；5min)，从培养基除去细胞。将不含细胞的上清液(150μl/孔)转移进96个对应的0.2ml微试管中。通过γ计数器(cobraii,packard,land)测量释放的⁵¹cr的量。

用下述方程式计算％特异性裂解：100×(实验释放-自发释放)/(总释放-自发释放)。

实验释放是一式两份样品处理的平均值。对于每个抗体处理组运行自发释放和总释放的一式三份样品，并将平均值用于各种抗体处理的实验样品。

结果：

chhh1.3抗体没有通过cdc机制在daudib-淋巴瘤细胞中诱导特异性裂解。但是，chhh1.3抗体对通过adcc机制在daudi细胞中发生的特异性裂解具有明显影响(图7)。

结论：

cdc不是活性机制，而adcc是使用daudi细胞作为靶细胞时chhh1.3的活性机制。

序列表

<110>诺帝克纳诺维科特股份公司

nordicnanovectorasa

罗伊·h·拉森

larsen,royh

约斯泰因·达勒

dahle,jostein

<120>嵌合的治疗性抗-cd37抗体hh1

chimerictherapeuticantibodies

<130>49202pc01

<150>us61/569,981

<151>2011-12-13

<160>14

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>119

<212>prt

<213>小鼠

<400>1

gluileglnleuglnglnserglyprogluleuvallysproglyala

151015

servallysvalsercyslysalaserglytyrserphethrasptyr

202530

asnmettyrtrpvallysglnserhisglylysserleuglutrpile

354045

glytyrileaspprotyrasnglyaspthrthrtyrasnglnlysphe

505560

lysglylysalathrleuthrvalasplysserserserthralaphe

65707580

ilehisleuasnserleuthrsergluaspseralavaltyrtyrcys

859095

alaargserprotyrglyhistyralametasptyrtrpglyglngly

100105110

thrservalthrvalserser

115

<210>2

<211>357

<212>dna

<213>小鼠

<400>2

gagatccagctgcagcagtctggacctgagctggtgaagcctggggcttcagtgaaggta60

tcctgcaaggcttctggttactcattcactgactacaacatgtactgggtgaagcagagc120

catggaaagagccttgagtggattggatatattgatccttacaatggtgatactacctac180

aaccagaagttcaagggcaaggccacattgactgttgacaagtcctccagcacagccttc240

atccatctcaacagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagatcccct300

tatggtcactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca357

<210>3

<211>107

<212>prt

<213>小鼠

<400>3

aspilevalmetthrglnserhislysleuleuserthrservalgly

151015

aspargvalserilethrcyslysalaserglnaspvalserthrala

202530

valasptrptyrglnglnlysproglyglnserprolysleuleuile

354045

asntrpalaserthrarghisthrglyvalproaspargphethrgly

505560

serglyserglythrasptyrthrleuthrilesersermetglnala

65707580

gluaspleualaleutyrtyrcysargglnhistyrserthrprophe

859095

thrpheglyserglythrlysleugluilelys

100105

<210>4

<211>321

<212>dna

<213>小鼠

<400>4

gacattgtgatgacccagtctcacaaactcttgtccacatcagtaggagacagggtcagc60

atcacctgcaaggccagtcaggatgtgagtactgctgtagactggtatcaacagaaacca120

ggacaatctcctaaactactgattaactgggcatccacccggcacactggagtccctgat180

cgcttcacaggcagtggatctgggacagattatactctcaccatcagcagtatgcaggct240

gaagacctggcactttattactgtcgacaacattatagcactccattcacgttcggctcg300

gggacaaagttggaaataaaa321

<210>5

<211>294

<212>dna

<213>人类

<400>5

cctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggg60

gcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgt120

ggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcag180

gactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacct240

acatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttg294

<210>6

<211>330

<212>dna

<213>人类

<400>6

cacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccc60

tcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagacc120

ctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagc180

cgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcacc240

aggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagccc300

ccatcgagaaaaccatctccaaagccaaag330

<210>7

<211>320

<212>dna

<213>人类

<400>7

ggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaaga60

accaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagt120

gggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccg180

acggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcagggga240

acgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcc300

tctccctgtctccgggtaaa320

<210>8

<211>8778

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>质粒

<400>8

gacggatcgggagatctcccgatcccctatggtcgactctcagtacaatctgctctgatg60

ccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcg120

cgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattaattgcatgaagaat180

ctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttga240

cattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagccca300

tatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaac360

gacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggact420

ttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaa480

gtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctgg540

cattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtatta600

gtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcgg660

tttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttgg720

caccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatg780

ggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaa840

cccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagctagc900

ttggtaccgggacctcaccatgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagc960

tacaggtaaggggctcacagtagcaggcttgaggtctggacatatatatgggtgacaatg1020

acatccactttgcctttctctccacaggtgtgcattcccaggtccaattgcagcagcctg1080

gggctgagcttgtgaagcctggggcttcagtgaagctgtcctgcaaggcttctggctaca1140

ccttcaccagctactggatgcactgggtgaagcagaggcctggacgaggccttgagtgga1200

ttggaaggattgatcctaatagtggtggtactaagtacaatgagaagttcaagagcaagg1260

ccacactgactgtagacaaaccctccagcacagcctacatgcagctcagcagcctgacat1320

ctgaggactctgcggtctattattgtgcaagatacgattactacggtagtagctactttg1380

actactggggccaaggcaccactctcacagtctcctcaggtgagttaacgtacgctagca1440

agctttctggggcaggccaggcctgaccttggctttggggcagggagggggctaaggtga1500

ggcaggtggcgccagccaggtgcacacccaatgcccatgagcccagacactggacgctga1560

acctcgcggacagttaagaacccaggggcctctgcgccctgggcccagctctgtcccaca1620

ccgcggtcacatggcaccacctctcttgcagcctccaccaagggcccatcggtcttcccc1680

ctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaag1740

gactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtg1800

cacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgacc1860

gtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagc1920

aacaccaaggtggacaagaaagttggtgagaggccagcacagggagggagggtgtctgct1980

ggaagccaggctcagcgctcctgcctggacgcatcccggctatgcagccccagtccaggg2040

cagcaaggcaggccccgtctgcctcttcacccggaggcctctgcccgccccactcatgct2100

cagggagagggtcttctggctttttccccaggctctgggcaggcacaggctaggtgcccc2160

taacccaggccctgcacacaaaggggcaggtgctgggctcagacctgccaagagccatat2220

ccgggaggaccctgcccctgacctaagcccaccccaaaggccaaactctccactccctca2280

gctcggacaccttctctcctcccagattccagtaactcccaatcttctctctgcagagcc2340

caaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccaggtaagccagcccaggcctc2400

gccctccagctcaaggcgggacaggtgccctagagtagcctgcatccagggacaggcccc2460

agccgggtgctgacacgtccacctccatctcttcctcagcacctgaactcctggggggac2520

cgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctg2580

aggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggt2640

acgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaaca2700

gcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaagg2760

agtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctcca2820

aagccaaaggtgggacccgtggggtgcgagggccacatggacagaggccggctcggccca2880

ccctctgccctgagagtgaccgctgtaccaacctctgtccctacagggcagccccgagaa2940

ccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctg3000

acctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatggg3060

cagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttc3120

ctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgc3180

tccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccg3240

ggtaaatgagtgcgacggccggcaagcccccgctccccgggctctcgcggtcgcacgagg3300

atgcttggcacgtaccccctgtacatacttcccgggcgcccagcatggaaataaagcacc3360

cagcgctgccctgggcccctgcgagactgtgatggttctttccacgggtcaggccgagtc3420

tgaggcctgagtggcatgagggaggcagagcgggtcccactgtccccacactggcccagg3480

ctgtgcaggtgtgcctgggccccctagggtggggctcagccaggggctgccctcggcagg3540

gtgggggatttgccagcgtggccctccctccagcagcacctgccctgggctgggccacgg3600

gaagccctaggagcccctggggacagacacacagcccctgcctctgtaggagactgtcct3660

gttctgtgagcgcccctgtcctcccgacctccatgcccactcgggggcatgcctagtcca3720

tgtgcgtagggacaggccctccctcacccatctacccccacggcactaacccctggctgc3780

cctgcccagcctcgcacccgcatggggacacaaccgactccggggacatgcactctcggg3840

ccctgtggagggactggtgcagatgcccacacacacactcagcccagacccgttcaacaa3900

accccgcactgaggttggccggccacacggccaccacacacacacgtgcacgcctcacac3960

acggagcctcacccgggcgaactgcacagcacccagaccagagcaaggtcctcgcacacg4020

tgaacactcctcggacacaggcccccacgagccccacgcggcacctcaaggcccacgagc4080

ctctcggcagcttctccacatgctgacctgctcagacaaacccagccctcctctcacaag4140

ggtgcccctgcagccgccacacacacacaggggatcacacaccacgtcacgtccctggcc4200

ctggcccacttcccagtgccgcccttccctgcagacggatccactagtaacggccgccag4260

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