一种评估CART细胞输注后免疫原性检测方法与流程

本发明涉及医药生物领域，具体涉及一种cart细胞免疫原性的检测方法。

背景技术：

嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor-tcell，car-t)t细胞是指经基因修饰后，能以mhc非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化扩增的t细胞。2012年国际细胞治疗协会年会中指出生物免疫细胞治疗已经成为手术、放疗、化疗外的第四种治疗肿瘤的手段，并将成为未来肿瘤治疗必选手段。car-t细胞回输治疗是当前肿瘤治疗中最明确有效的免疫治疗形式。大量研究表明，car-t细胞可以有效的识别肿瘤抗原，引起特异性的抗肿瘤免疫应答，显著改善患者的生存状况。

嵌合抗原受体(car)是car-t的核心部件，赋予t细胞hla非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过car改造的t细胞相较于天然t细胞表面受体tcr能够识别更广泛的目标。car的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen，taa)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scfv段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。目标抗原的选择对于car的特异性、有效性以及基因改造t细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素。

免疫原性指药物刺激机体形成特异性抗体或致敏淋巴细胞的性质。在临床前和临床试验中评价免疫原性是生物制品安全性评价的重要内容。影响car-t自体细胞免疫治疗效果的一个主要限制因素是经基因工程修饰的抗car-t细胞在人体内的存活期太短，而导致这一现象的原因很可能是整合到人体t细胞上的外源性scfv片段引起了免疫原性，进而诱导人体产生了免疫应答，缩短了car-t细胞在人体内的存续时间。

本发明阐述了评估cd19-cart细胞输注体内免疫原性的方法。

技术实现要素：

本发明的一个方面提供一种评估cd19-cart免疫原性的方法包括体内实验评估方法。

本发明的第二方面提供了体内实验评估方法，包括：

(ⅰ)体液免疫检测模型；

(ⅱ)细胞免疫检测模型；

优选的是，体液免疫检测即通过检测回输1d3car-t的小鼠血清中是否含有anti-1d3car抗体来评价在1d3car-t治疗后是否引起小鼠机体的体液免疫应答。

优选的是，细胞免疫检测即将回输了1d3car-t的小鼠的脾细胞用1d3car-t刺激后做为效应细胞，通过检测该效应细胞是否会对1d3car-t有免疫功能来评价是否引起细胞免疫应答。

本发明具有以下有益效果：本发明全面的评估cd19-cart细胞输注体内免疫原性的方法。

附图说明

图1重复给药模型图

具体实施方式

实施例

本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。实施例里介绍体内评估实验。

实施例1.体液免疫检测模型

1.c57bl小鼠，雌雄各半，6周龄。分为溶媒细胞对照组1、溶媒细胞对照组2、car-t组1、car-t组2、car-t组2，每组50只小鼠。

2.尾静脉注射相应溶剂或car-t注射液，每只小鼠给药体积200μl。第1、2组给予生理盐水作为溶媒对照；第3、4组给予抗鼠cd19t细胞首次给药1×10⁷个细胞/只；二次给药5×10⁶个细胞/只，第5组给予抗鼠cd19t细胞两次给药均为1×10⁶个细胞/只。第2、3、4组两次给药前1天均进行预处理，预处理方法为腹腔注射环磷酰胺200mg/kg。

4.分离鼠源car-t重复给药试验各处死组car-t血清，将血清与293t-1d3-gfp细胞共孵育，通过流式检测血清中结合1d3car的抗体来判断是否有anti-1d3car的体液免疫。

本实施例结果显示实验3个处死点。由标准曲线确定本实验检测anti-1d3car抗体浓度下限为1ug/ml左右。各时间点都未检测到抗1d3car的抗体。

实施例2.细胞免疫检测模型

1.c57bl小鼠，雌雄各半，6周龄。分为溶媒细胞对照组1、溶媒细胞对照组2、car-t组1、car-t组2、car-t组2，每组50只小鼠。

2.尾静脉注射相应溶剂或car-t注射液，每只小鼠给药体积200μl。第1、2组给予生理盐水作为溶媒对照；第3、4组给予抗鼠cd19t细胞首次给药1×10⁷个细胞/只；二次给药5×10⁶个细胞/只，第5组给予抗鼠cd19t细胞两次给药均为1×10⁶个细胞/只。第2、3、4组两次给药前1天均进行预处理，预处理方法为腹腔注射环磷酰胺200mg/kg。

3.在注射后car-t细胞的16天和43天处死组的小鼠脾脏t细胞，用1d3car-t细胞刺激5天，以刺激后小鼠脾细胞为效应细胞，以1d3car-t细胞及nt细胞为靶细胞通过流式检测胞内ifn-γ表达来反应car特异性t细胞免疫应答。

本实施例结果显示各组的阴性对照组效应细胞几乎测不到ifn-γ，说明重复给药中，未观察到抗1d3car-t的细胞免疫反应。