本发明涉及芦莉草(ruelliatuberosalinn)水提取物及其药理用途，尤其涉及芦莉草块根水提取物及其在降血糖中的用途，属于芦莉草水提取物及其药理用途领域。
背景技术
芦莉草(ruelliatuberosalinn)属于爵床科(学名：acanthaceae)双子叶植物纲，合瓣花亚纲，管花目。芦莉草是主要分布在热带、亚热带地区的多年生植物，在东南亚、中国的亚热带等地区广泛分布。在中药中，主要是将芦莉草的叶入药，主要具有利尿、治疗精神病、止痛、降血压、消渴、解毒等功效。
糖尿病是以高血糖为特征的代谢性疾病，高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。高血糖常导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍，常常带来以下危害：
一、肾脏的危害，由于高血糖、高血压及高血脂，肾小球微循环滤过压异常升高，促进糖尿病肾病发生和发展。早期表现为蛋白尿、浮肿，晚期发生肾功能衰竭，是糖尿病最主要的死亡原因。
二、心脑血管的危害，心脑血管并发症是糖尿病致命性并发症。主要表现于主动脉、冠状动脉、脑动脉粥样硬化，以及广泛小血管内皮增生及毛细血管基膜增厚的微血管糖尿病病变。血管收缩与扩张不协调，血小板粘聚，脂质在血管壁的沉积，形成高血糖、高血脂、高粘血症、高血压，致使糖尿病心脑血管病发病率和死亡率呈上升指数。
三、急性并发症，糖尿病危害还包括急性并发症，尿病合并感染：发病率高，两者互为因果，必须兼治。常见感染包括呼吸道感染和肺结核、泌尿系感染和皮肤感染。危害还在于糖尿病高渗综合症：多发生于中老年，半数无糖尿病史，临床表现包括脱水严重，有时可因偏瘫、昏迷等临床表现而被误诊为脑血管意外，死亡率高达百分之五十。
四、乳酸性酸中毒危害，患者多有心、肝、肾脏疾病史，或休克、有感染、缺氧、饮酒、大量服用降糖灵史，症状不特异，死亡率高。
中药提取物或中药组合物是治疗糖尿病的重要药物，但是，现有的中药提取物均不同程度的存在降血糖效果不显著等缺陷，有待改进。
技术实现要素：
本发明的目的之一是提供一种芦莉草块根水提取物以及块根芦莉草水提物降血糖有效部位；
本发明的目的之二是提供一种制备芦莉草块根水提取物以及块根芦莉草水提物降血糖有效部位的方法；
本发明的目的之三是将所述的芦莉草块根水提取物以及块根芦莉草水提物降血糖有效部位应用于降低血糖。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明首先提供了芦莉草块根水提取物，其提取方法包括：
将芦莉草的块根用水为提取溶剂进行提取；即得芦莉草的块根水提物。
作为一种优选的提取方法，包括：(1)将芦莉草的块根粉碎成粗粉；(2)向粗粉中加入3-12倍质量的水浸泡后回流提取，过滤；(3)将滤渣再用水回流提取；(4)合并滤液，减压回收至干膏，即得到芦莉草的块根水提物；其中，优选的，步骤(2)中所述的浸泡时间为浸泡1小时以上；所述的回流提取时间可以为20-80min，最优选为40min；步骤(3)中所述的回流提取的次数可以为1-4次，优选为2次，每次回流提取的时间优选为30-50min。
本发明进一步采用大孔树脂技术和分步醇沉方法，对块根芦莉草块根水提物进行分段实验，得到4个不同馏分；将不同浓度醇洗脱物合并得95％乙醇洗脱物得到馏分1(llc-1)，经检测，块根芦莉草块根95％乙醇提取物主要含有酚性成分、皂苷、强心苷及其内酯成分和蒽醌类这些有效成分。将流出液和水洗液合并，减压浓缩得水洗脱物，将水洗脱物溶解于水(约0.5g生药/ml)中，首先向水洗脱物溶液中逐渐加入95％乙醇，使乙醇浓度达到70％，搅拌10min使接触充分，5000rpm转速下离心30min，倾出上清液，得到70％乙醇沉淀物即为馏分2(llc-2)；继续在上清液中加入95％乙醇至84％乙醇浓度进行沉淀，离心，取84％乙醇沉淀物即为馏分3(llc-3)，继续将上清液浓缩得到馏分4(llc-4)。
经检测，块根芦莉草块根水提物主要含有多糖类成分、皂苷、有机酸以及环烯醚萜等活性成分。芦莉草块根95％乙醇提取物主要含有：酚性成分、皂苷、强心苷、内酯成分以及蒽醌类等活性成分。
为了观察芦莉草块根水提取物是否具有确切的降血糖效果，本发明以链脲佐菌素(stz)造成小鼠糖尿病模型，连续灌胃给予块根芦莉草水提物，观察对stz糖尿病小鼠血糖的影响，空腹血糖测定结果表明，块根芦莉草块根水提物具有明显的降血糖作用。
本发明进一步以链脲佐菌素(stz)造成糖尿病小鼠模型，连续3周ig.给予块根芦莉草块根水提物的四个不同馏分(即：llc-1、llc-2、llc-3和llc-4)，观察检测各馏分对stz糖尿病小鼠血糖及相关指标的影响，初步评估各馏分各自的降血糖效果。连续给药3周的空腹血糖测定结果表明，芦莉草块根水提物馏分3血糖降低38.3％(p＜0.01)，其它的3个馏分降血糖的效果均不显著，因此，本发明所提供的芦莉草块根水提物馏分3有显著的降血糖作用，确定馏分3是块根芦莉草水提物降血糖主要活性部分。
因此，本发明进一步提供了一种块根芦莉草水提物降血糖有效部位，其提取方法包括：
(1)将芦莉草的块根用水为提取溶剂进行提取，得到芦莉草的块根水提物；
(2)将芦莉草块根水提取液上样过大孔树脂柱，采用水为洗脱剂收集水洗脱物；
(3)将水洗脱物溶解于水中后加入95％乙醇，使乙醇浓度达到70％，搅拌，离心，收集上清液，
(4)在上清液中加入95％乙醇至84％乙醇浓度进行沉淀，离心，取84％乙醇沉淀物，即得块根芦莉草水提物降血糖有效部位。
优选的，步骤(2)中所述的搅拌时间优选是5-20min，更优选为10min；所述的离心优选为在2000-8000rpm转速下离心20-40min，更优先的，在5000rpm转速下离心30min。
本发明进一步公开了芦莉草块根水提取物或块根芦莉草水提物降血糖有效部位在制备降血糖的药物中的应用。所述药物按照中药常规制剂方法制备成适宜的临床制剂，优选为口服制剂；所述药物的剂型包括：片剂、颗粒剂、冻干粉、散剂、丸剂、胶囊剂或口服液。
本发明还公开了一种降血糖的药物组合物，包括：治疗上有效量的芦莉草块根水提取物和药学上可接受的辅料。
本发明还公开了一种降血糖的药物组合物，包括：治疗上有效量的芦莉草块根水提取物降血糖有效部位和药学上可接受的辅料。
所述药物组合物按照中药常规制剂方法制备成适宜的临床制剂，优选为口服制剂；所述药物的剂型包括：片剂、冻干粉、颗粒剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂或口服液。
本发明所述辅料或载体是指药学领域常规的辅料或载体，例如：稀释剂、崩裂剂、润滑剂、赋形剂、粘合剂、助流剂、填充剂、表面活性剂等；另外，还可以在组合物中加入其它辅助剂，如香味剂和甜味剂。所述稀释剂可以是一种或几种增加片剂重量和体积的成分，常用的稀释剂包括乳糖、淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、山梨醇、甘露醇以及无机钙盐等；其中最常用为乳糖、淀粉、微晶纤维素。所述崩解剂可以为交联聚乙烯吡咯烷酮(与总重量比为2-6％)，交联羧甲基纤维素钠(与总重量比为2-6％)、海藻酸(与总重量比为2-5％)、微晶纤维素(与总重量比为5-15％)中之一种或几种混合物。所述的润滑剂包括硬脂酸，硬脂酸钠，硬脂酸镁，硬脂酸钙，聚乙二醇，滑石粉，氢化植物油中之一种或几种混合物。润滑剂的用量范围(与总重量比)为0.10-1％，一般用量为0.25-0.75％。所述的粘合剂可以是一种或几种有利于制粒的成分；可以是淀粉浆(10-30％，与粘合剂总重量比)，羟丙基甲基纤维素(2-5％，与粘合剂总重量比)，聚乙烯吡咯烷酮(2-20％，与粘合剂总重量比)，以聚乙烯吡咯烷酮的乙醇水溶液为佳。所述助流剂可以为微粉硅胶、滑石粉、三硅酸镁中之一种或几种混合物。所述表面活性剂可以为一种或几种能够提高润湿性和增加药物溶出的成分，常用为十二烷基硫酸钠(常用范围为0.2-6％，与总重量比)。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1块根芦莉草块根水提取物的制备
将芦莉草的块根切成小段并粉碎成粗粉，称取一定量药材粗粉放入圆底烧瓶，加8倍量水浸泡2hr以上，回流提取40min，过滤，再以5倍量水回流提取2次，40min/次；合并滤液，减压回收至干膏，即得到芦莉草的块根水提物，块根芦莉草块根水提物的得膏率为68.43％。
经检测，块根芦莉草块根水提物主要含有：多糖类成分、皂苷、有机酸以及环烯醚萜。
实施例2块根芦莉草块根水提取物的制备
将芦莉草的块根切成小段并粉碎成粗粉，称取一定量药材粗粉放入圆底烧瓶，加5倍量水浸泡1hr以上，回流提取30min，过滤，再以5倍量水回流提取2次，50min/次；合并滤液，减压回收至干膏，即得到芦莉草的块根水提物，块根芦莉草块根水提物的得膏率为67.43％。
经检测，块根芦莉草块根水提物主要含有：多糖类成分、皂苷、有机酸以及环烯醚萜。
实施例3块根芦莉草块根水提取物的制备
将芦莉草的块根切成小段并粉碎成粗粉，称取一定量药材粗粉放入圆底烧瓶，加10倍量水浸泡1hr以上，回流提取50min，过滤，再以10倍量水回流提取2次，50min/次；合并滤液，减压回收至干膏，即得到芦莉草的块根水提物，块根芦莉草块根水提物的得膏率为66.43％。
经检测，块根芦莉草块根水提物主要含有：多糖类成分、皂苷、有机酸以及环烯醚萜。
实施例4芦莉草块根水提物不同馏分的制备以及鉴定
(一)水提取液d101大孔树脂分段试验
取实施例1制备的块根芦莉草块根水提取液(1g生药/ml，密度1.20g/ml)，上样过大孔树脂柱，采用水洗和不同浓度的乙醇进行梯度洗脱，分别收集流出液、水洗液和不同浓度乙醇洗脱液(即：依次用水、30％乙醇、60％乙醇和95％乙醇进行洗脱)，因为各浓度乙醇洗脱液所占比例均很低，决定将流出液和水洗液合并，减压浓缩得水洗脱物；将不同浓度醇洗脱物合并得95％乙醇洗脱物，经检测，块根芦莉草块根95％乙醇提取物主要含有：酚性成分、皂苷、强心苷及其内酯成分、蒽醌类。
块根芦莉草块根水提取液上大孔树脂分段各部分得率为：水洗脱物的得率为93.6％；95％乙醇洗脱物(llc-1)的得率为6.4％。
(二)水洗脱物的分步醇沉实验
将水洗脱物溶解于水(约0.5g生药/ml)中，不断加95％乙醇进行分步醇沉实验。首先向水洗脱物溶液中逐渐加入95％乙醇，使乙醇浓度达到70％，搅拌10min使接触充分，5000rpm转速下离心30min，倾出上清液，得到70％乙醇沉淀物(llc-2)；继续在上清液中加入95％乙醇至84％乙醇浓度再进行沉淀，离心，取84％乙醇沉淀物(llc-3)，将上清液浓缩得样品llc-4，分别计算得率，水洗脱物进行分步醇沉实验结果见表1所示(各部分即为馏分，供药理活性研究所用样品)。
表1水洗脱物进行分步醇沉实验结果
初步分析实验结果表明：芦莉草块根中含有多糖类成分、皂苷、有机酸、环烯醚萜、酚类、强心苷及其内酯成分、蒽醌类等多类成分；其中以中分子量和小分子量的多糖为主(占可提取成分的大约70-80％)。
实施例5片剂的制备
取实施例1制备的芦莉草块根水提取物稠膏100g，加入甘露醇25g，蔗糖25g，用5％聚维酮乙醇液湿法制粒，24目筛制粒，60℃条件下干燥4小时，20目筛整粒，加入硬脂酸镁0.5g，混和均匀，压片，制成1000片。每片含芦莉草块根水提取物提取物100mg。
实验例1块根芦莉草块根水提取物对链脲佐菌素致糖尿病小鼠血糖的影响实验
1、实验目的
以链脲佐菌素(stz)造成小鼠糖尿病模型，连续灌胃给予块根芦莉草水提物，观察对stz糖尿病小鼠血糖的影响。
2、实验材料
2.1动物：
icr小鼠，22～24g，雄性，4周龄，94只，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证编号：scxk京2009-0007。饲养于spf级动物房(设施许可证号：syxk(京)2003-0009)，温度22～26℃，湿度40～70％。
2.2试剂：
链脲佐菌素(streptozocin,stz)，sigmas0130，购于北京市博爱港商贸有限公司，1g/瓶，批号：110908
2.3试纸及试剂盒
血糖试纸：罗康全活力型，批号：23445234，有效期至2013/03，德国罗氏诊断有限公司。
葡萄糖测定试剂盒(葡萄糖氧化酶法)，购于中生北控生物科技股份有限公司，产品批号：122891，有效期至2013/05。
2.4受试药物
实施例1制备的块根芦莉草块根水提物：棕褐色液体，分装后冷冻保存，临用前取适量配成相应的浓度。
2.5阳性对照药
降糖灵(盐酸苯乙双胍片)，山东仁和堂药业有限公司，国药准字h37021531，产品批号：101104，有效期至2013.10。
3、实验方法
上述icr小鼠随机分为正常对照、模型对照、阳性药降糖灵(100mg/kg)、块根芦莉草水提物5g/kg、2.5g/kg、1.25g/kg、0.625g/kg组，正常对照10只/组，其余14只/组。适应性喂养3天，所有小鼠禁食不禁水12h后，模型及各给药组小鼠腹腔注射(ip)125mg/kgstz进行造模，正常组小鼠ip等剂量柠檬酸缓冲液。各组小鼠分别于造模7天后连续3天尾尖取血测定空腹血糖值。根据血糖测定结果进行分组调整。给药组按上述剂量灌胃给药，给药容积0.2ml/10g，正常及模型组小鼠灌胃等容量的蒸馏水，连续给药25天。给药第7天、14天、25天时尾尖取血测定空腹血糖值，评价块根芦莉草块根水提取物的降血糖疗效。
4、统计学方法
应用microsoftexcel统计学软件进行数据处理，用t检验方法进行组间差异比较。
5、实验结果
给药25天后，块根芦莉草块根水提取物四个剂量组均出现明显的降血糖作用，与模型组比较它们可使血糖分别降低45％、33％、44％、32％(p＜0.01)，见表2。
表2块根芦莉草块根水提取物对stz糖尿病小鼠空腹血糖的影响(x±s，mmol/l)
与正常对照组比较：*p<0.05；**p<0.01
与模型对照组比较：▲p<0.05；▲▲p<0.01
本实验采用腹腔注射stz造成小鼠糖尿病模型，造模后小鼠空腹血糖升高且体重明显下降，并出现多饮多尿的糖尿病症状，表明模型成功建立。模型形成后连续灌胃给药25天，空腹血糖测定结果表明，块根芦莉草块根水提物有明显的降血糖作用。
实验例2芦莉草块根水提物的不同馏分对链脲佐菌素致糖尿病小鼠的影响实验
1、实验目的
以链脲佐菌素(stz)造成糖尿病小鼠模型，连续3周ig.给予块根芦莉草块根水提物的不同馏分，观察检测各馏分对stz糖尿病小鼠血糖及相关指标的影响，初步确认降血糖活性的馏分。
2、实验材料
2.1实验动物
icr小鼠，22～24g，雄性，4周龄，150只，来源于北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证编号：scxk京2009-0007。饲养于spf级动物房(许可证号：syxk(京)2003-0009)，温度22～26℃，湿度40～70％。
2.2试剂
链脲佐菌素(streptozocin,stz)，sigmas0130，购于北京市博爱港商贸有限公司，1g/瓶，批号：110908
2.3试纸及试剂盒
血糖试纸：罗康全活力型，批号：23445234，有效期至2013/03，德国罗氏诊断有限公司，50条装。
葡萄糖测定试剂盒(葡萄糖氧化酶法)，购于中生北控生物科技股份有限公司，产品批号：120551，有效期至2013/08。
2.4受试药物
块根芦莉草水提物块根馏分1(llc馏分1)：棕褐色粉末，水提物馏分2(llc馏分2)：棕褐色块状固体，水提物馏分3(llc馏分3)：棕色液体，水提物馏分4(llc馏分4)：浅棕色液体。llc馏分1和llc馏分2冷藏密封保存，临用时取适量用蒸馏水溶解成相应的浓度；llc馏分3和llc馏分4冷冻保存，临用时用水稀释成相应的浓度。
2.5阳性对照药
降糖灵(盐酸苯乙双胍片)，山东仁和堂药业有限公司，国药准字h37021531，产品批号：101104，有效期至2013.10。
3、实验方法
上述icr小鼠随机分为正常对照、模型对照、阳性药降糖灵(100mg/kg)、llc馏分1(2.5g/kg)、llc馏分2(2.5g/kg)，llc馏分3(2.5g/kg)，llc馏分4(2.5g/kg)组，正常对照组10只/组，模型及各给药组14只/组。适应性喂养2天，所有小鼠禁食不禁水12h后，模型及各给药组小鼠腹腔注射125mg/kgstz进行造模，正常对照组小鼠ip.等容量柠檬酸缓冲液。各组小鼠分别于造模7天后连续3天尾尖取血用葡萄糖试剂盒测定空腹血糖值。根据血糖测定结果进行分组。给药组按上述剂量灌胃给药，给药容积0.2ml/10g，正常及模型组小鼠灌胃等容量的蒸馏水，连续给药21天。给药第7天、14天和21天后尾尖取血测定空腹血糖值，观察块根芦莉草块根水提物不同馏分对stz糖尿病小鼠空腹血糖的影响。
4、统计学方法
应用microsoftexcel统计学软件进行数据处理，用t检验方法进行组间差异比较。
5、实验结果
连续给药3周后，块根芦莉草块根水提取物llc馏分3表现出显著的降血糖作用，与模型组小鼠相比，使血糖降低38.3％(p＜0.01)，见表3。
表3块根芦莉草块根水提物不同馏分对stz糖尿病小鼠空腹血糖的影响(x±s，mmol/l)
与正常对照组比较：*p<0.05；**p<0.01
与模型对照组比较：▲p<0.05；▲▲p<0.01
6、实验结论
本实验应用stz造成小鼠糖尿病模型，造模后小鼠空腹血糖升高且体重有所下降，并出现多饮多尿的糖尿病症状，表明模型成功建立。模型形成后灌胃给以块根芦莉草块根水提物4种不同馏分，连续给药3周的空腹血糖测定结果表明，块根芦莉草块根水提物馏分3有显著的降血糖作用，其它的三个馏分将血糖效果不显著，因此，本发明初步确定馏分3是块根芦莉草水提物降血糖主要活性部分。