赤芝孢子油和/或含有赤芝孢子油的药物组合物的新用途的制作方法

本发明属于灵芝孢子油技术领域，具体涉及赤芝孢子油和/或含有赤芝孢子油的药物组合物在制备具有预防主动脉瓣膜病致心肌纤维化功效的功能性食品和药品中的应用。

背景技术：

心肌纤维化由高血压、动脉粥样硬化、瓣膜病、高血脂、房颤等疾病诱发，疾病机制涉及肌成纤维细胞活化、胶原浓度升高、胞外基质过量沉积、糖脂代谢异常等。心肌纤维化最终转归为心脏重构、收缩舒张功能障碍和心衰。作为一种进展性的疾病，早期预防具有重要意义，但是目前心肌纤维化无可靠的预防方法。在心肌纤维化预防药物的创新研发上，基于其诱因多样、机制复杂，需要我们首先针对特定诱因，精准评价药物作用的机制。本发明的药物是针对预防“主动脉瓣膜病致心肌纤维化”，并从多重机制上证明了药物的预防效果。

主动脉瓣膜病变发生后，心脏因滞留过量血液而过负荷，最终发展为心肌纤维化。主动脉瓣膜病变是仅次于高血压和冠心病的第三常见的心血管疾病。美国统计的主动脉瓣膜病在老年人中的发病率高达2.5％，我国根据部分地区推测的发病率则高于美国。由于我国将进入老龄化社会，预计各类心血管疾病发病率将持续增加，成为我国的重大公共卫生问题，因此早期预防策略的创新发展具有重大意义。

灵芝有效成分的获取可通过水提法、醇提法、超临界二氧化碳萃取法等，获取的有效成分包括灵芝多糖、灵芝三萜/甾醇、脂肪酸。有研究表明灵芝提取物可治疗心肌纤维化，但是未见灵芝提取物(特别是油性成分)在预防心肌纤维化上，尤其是“主动脉瓣膜病致心肌纤维化”的应用。

目前录入药典的灵芝品种为赤芝和紫芝，对两种品系的差异性分析中，有研究表明赤芝比紫芝在降低甘油三酯方面更有优势，由于我国高血脂的患病率不断增加，因此使用赤芝更具有有临床应用价值。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供赤芝孢子油和/或含有赤芝孢子油的药物组合物在制备具有预防主动脉瓣膜病致心肌纤维化功效的功能性食品和药品中的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：赤芝孢子油和/或含有赤芝孢子油的药物组合物在制备具有预防主动脉瓣膜病致心肌纤维化功效的功能性食品和药品中的应用。

作为本发明的一种优选的技术方案，本发明所述的赤芝孢子油通过以下方法制备获得：

(1)选取赤芝孢子粉，进行超声，将超声后的灵芝孢子粉采用液氮冷冻多次后复温，然后加入中性蛋白酶酶解，酶解后再经包括灭酶、中和、过滤和烘干处理，得预处理赤芝孢子粉；

(2)将预处理赤芝孢子粉采用二氧化碳进行超临界萃取，得赤芝孢子油。

在该赤芝孢子油的制备方法中：

优选的，步骤(1)中将超声后的灵芝孢子粉采用液氮冷冻2～4次后，在28～32℃复温。

更佳的，步骤(1)中将超声后的灵芝孢子粉采用液氮冷冻3次后，在30℃复温。

优选的，步骤(1)中中性蛋白酶的加入量为1800～2200u/g，酶解时温度为48～52℃，酶解时间为50～70min，ph值为7.2～7.6。

更佳的，步骤(1)中中性蛋白酶的加入量为2000u/g，酶解时温度为50℃，酶解时间为60min，ph值为7.4.

步骤(1)中中和采用氢氧化钾，烘干温度为45～55℃，烘干时间为8～12h。

更佳的，步骤(1)中中和采用氢氧化钾，烘干温度为50℃，烘干时间为10h。

优选的，步骤(2)采用二氧化碳进行超临界萃取时，萃取压力为14～16mpa，温度为38～42℃，时间为1.5～2.5h；分离压力为5～7mpa，温度为28～32℃。

更佳的，步骤(2)采用二氧化碳进行超临界萃取时，萃取压力为15mpa、温度为40℃、时间2h；分离压力为6mpa，温度30℃。

优选的，通过采用二氧化碳进行超临界萃取，获得的是含有赤芝孢子油的提取物，在该提取物中，赤芝孢子油的质量百分含量为24～30％。

本发明获得的赤芝孢子油中包括灵芝总三萜和脂肪酸，所述灵芝总三萜占赤芝孢子油总质量的17～19％，所述脂肪酸占赤芝孢子油总质量的73～75％，所述脂肪酸包括油酸、棕榈酸和亚油酸，其中油酸、棕榈酸和亚油酸占脂肪酸总质量的60～63％、15～16％和12～14％。

更佳的，步骤(2)中所述赤芝孢子油占提取物总质量的27％，所述赤芝孢子油中包括灵芝总三萜和脂肪酸，所述灵芝总三萜占赤芝孢子油总质量的18.7％，所述脂肪酸占赤芝孢子油总质量的73～75％，所述的脂肪酸包括油酸、棕榈酸和亚油酸，其中油酸、棕榈酸和亚油酸占脂肪酸总质量分别为61.5％、15.6％和13.3％。

本发明中的含有赤芝孢子油的药物组合物，是具有预防主动脉瓣膜病致心肌纤维化功效的药物组合物，优选的，本发明所述含有赤芝孢子油的药物组合物包括赤芝孢子油和辅料。优选的，所述辅料为药学领域所采用的常规辅料。

优选的，本发明所述含有赤芝孢子油的药物组合物的剂型为乳剂或软胶囊剂。

本发明具有如下优点：本发明首次公开了赤芝孢子油和/或含有赤芝孢子油的药物组合物在预防“主动脉瓣膜病致心肌纤维化”方面的新用途，为预防“主动脉瓣膜病致心肌纤维化”提供了一种新的方法，采用本发明中的优选方法制备的赤芝孢子油及由该赤芝孢子油制成的药物，可以有效预防“主动脉瓣膜病致心肌纤维化”、具有抗心室重构、抗心衰的效果。

附图说明

图1是实施例2中抗纤维化药物和赤芝孢子油给药时间表；

图2是实施例2中小鼠左心室横切面masson三色染色结果；

图3是实施例2中各组小鼠超声检测结果；

图4是实施例2中赤芝孢子油预防显著降低血清中胞外基质的含量；

图5是实施例2中各组小鼠心脏组织超氧化物歧化酶sod、mda和gsh检测结果。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

本实施例提供的赤芝孢子油的提取方法，包括以下步骤：

(1)取市售赤芝孢子粉1000克，进行超声，把超声后的灵芝孢子粉混合后采用液氮冷冻3次，30℃复温，随后中性蛋白酶酶50℃，ph7.4，1小时酶解，酶解后酸性灭活酶后使用氢氧化钾中和。

(2)孢子粉过滤、50℃10小时烘干后，置于萃取釜中，使用二氧化碳超临界萃取，设定条件为：①萃取压力为15mpa、温度为40℃、时间2小时；②分离压力为6mpa，温度30℃；③co2速度为20l/h。

采用gc-ms方法测定赤芝孢子油，赤芝孢子油占提取物总质量的质量百分含量为27％，赤芝孢子油中包括灵芝总三萜和脂肪酸，灵芝总三萜占赤芝孢子油总质量的18.7％，脂肪酸占赤芝孢子油总质量的74％，脂肪酸包括油酸、棕榈酸和亚油酸，其中油酸、棕榈酸和亚油酸占脂肪酸总质量分别为61.5％、15.6％和13.3％。

实施例2

以下通过实验来验证赤芝孢子油在预防“主动脉瓣膜病致心肌纤维化”方面的功效。

1、实验动物

48只4周龄断奶后c57小鼠饲养于广东实验动物监测所spf级设施，设施内恒温恒湿，动物每天给予12小时光照，自动采食饮水。实验于aaalac认证的设施内开展。

2、实验材料

(1)赤芝孢子油：按实施例1制备，4℃保存备用。

(2)超氧化物歧化酶(sod)、丙二醛(mda)和谷胱甘肽(gsh)检测试剂盒：购自南京建成生物工程研究所；

(3)ha和ln检测试剂盒：购自上海海研医学生物技术有限公司；

(4)其他常规耗材：异氟烷、4-0带线缝合针、2-0带线缝合针、苏木素、乙醇、二甲苯等。

3、实验方法

(1)“主动脉瓣膜病致心肌纤维化”小鼠模型制备

小鼠用1.5％-2％的异氟烷插管麻醉，开胸在超声诱导下确定瓣膜位置，使用探针进行部分瓣膜损伤，同时在主动脉根部进行进行狭窄，通过超声判定主动脉狭窄部位后段的血流流出量减少20％-30％为成功超模。模型用于模拟因主动脉瓣膜病后心脏血容量和压力过负荷状态，特征为心肌纤维化及心功能受损、心脏重构和心衰。空白对照组实行开胸手速，但不损伤瓣膜和狭窄血管。

(2)动物分组

将72只c57小鼠随机分为6组，每组12只小鼠，分别为：空白对照组、模型对照组、抗心肌纤维化药物组、赤芝孢子油低剂量预防组(10mg/kg/天)、赤芝孢子油中剂量预防组(20mg/kg/天)、赤芝孢子油高剂量预防组(50mg/kg/天)。空白对照组或其它实验组中未给药期间灌胃给予玉米油，详细给药见表1。第一个实验的42天为给予赤芝孢子油进行“预防”处理，后开始建模。建模后第二个42天超声检测心脏结构功能，并对小鼠麻醉后进行采血、安乐死，对血清进行胞外细胞基质检查和对心脏进行组织学检查。

表1赤芝孢子油药效实验分组(n＝12)

抗纤维化药物和赤芝孢子油给药时间表如图1所示。

(3)形态学检测

①将处理42天后的心脏在体灌注4％多聚甲醛后，固定过夜，然后进行常规脱水、石蜡包埋。切片3微米，使用masson三色染色法染色。

②染色步骤：将切片烤箱内溶蜡后脱水，冲洗后使用苏木素染色5min，返蓝30min；使用masson丽春红染色5分钟，冰醋酸浸染，磷钼酸分化；使用梯度乙醇、二甲苯脱水透明，晾干后封片。

③对心肌细胞间心肌纤维所占面积在40倍切片的视野计算，随机取五个视野的平均数。计算时不计算血管和因切片原因导致的裂缝。

切片结果见图2，图2中的观察表明：

(a)可见模型对照组的心肌细胞排列紊乱、肌纤维断裂、溶解；而抗心肌纤维化药物组、赤芝孢子油低剂量预防组，赤芝孢子油中剂量预防组，赤芝孢子油高剂量预防组的心肌细胞排列整齐，胞浆染色均匀，胶原组织分布均匀，和空白对照组表现一致。

(b)空白对照组、模型对照组、抗心肌纤维化药物组、赤芝孢子油低剂量预防组、赤芝孢子油中剂量预防组、赤芝孢子油高剂量预防组左室心肌纤维所占面积分别为8.2±0.2％，65.6±6％,11.8±0.4％,25.9±0.3％,24.2±0.6％,17.1±0.5％，说明赤芝孢子油预防作用显著，赤芝孢子油低剂量预防组，赤芝孢子油中剂量预防组，赤芝孢子油高剂量预防组的心肌纤维面积分别降低了60.5％，63.1％，73.9％。以上结果表明赤芝孢子油能够预防瓣膜病致心肌纤维化。

(4)心脏功能超声检测

心脏超声功能检测使用小动物高频超高分辨率成像系统vevo2100。检测时使用2％异氟烷对小鼠诱导麻醉后，固定于超声操作台上，37.6℃保温，成像过程小鼠心率维持在450～480bpm，取胸骨旁短轴观通过m型测量，计算小鼠心脏功能。

结果表明(见表2)：

(a)与空白对照组比较，模型对照组左心内径增加、心室容积增加、每搏输出量减少、收缩力明显下降。

(b)与模型对照组比较，抗心肌纤维化药物租、赤芝孢子油低剂量预防组、赤芝孢子油中剂量预防组、赤芝孢子油高剂量预防组的左心室内径、射血分数、短轴缩短率、心输出量均有显著改善。例如在心脏收缩舒张功能的最直观的指标射血分数上，可看到心肌纤维化模型造模成功后，射血分数从63.18±2.51％降到42.34±2.40％，而抗心肌纤维化药物租、赤芝孢子油低剂量预防组、赤芝孢子油中剂量预防组、赤芝孢子油高剂量预防射血分数重归正常，数值分别为：59.20±4.28％、50.85±1.89％、51.85±1.89％和61.23±2.15％，与模型对照组有显著差异，如表3所示。

(c)射血分数的降低表明心脏功能受损，射血分数回升说明了心脏功能的改善。赤芝孢子油低、中、高剂量预防组心脏功能的改善效果分别为50.85±1.89％、51.85±1.89％和61.23±2.15％，并与抗心肌纤维化药物组效果相近，如图3所示。

以上结果说明赤芝按一定比例混和提取赤芝孢子油对能够预防心肌纤维化的作用。

表2各组小鼠超声检测结果(n＝12)

*表示与模型组组比较p<0.05

(5)血清纤维化指标层粘蛋白ln和透明质酸酶ha的测量

实验结束后，小鼠麻醉后采血，全血800g/l离心10分钟，获得的血清放置于-80℃冰箱保存直至使用。应用放射免疫方法检测了反映细胞外基质改变的层粘蛋白ln、透明质酸酶ha的改变。

结果表明(见表3和图4)：

①模型对照组与空白对照组比较，显示模型对照组的层粘蛋白ln和透明质酸酶ha显著增加。

②与模型对照组比较，赤芝孢子油低、中、高预防组均具有减少心肌纤维化的作用，与模型对照组比较，分别降低了26.9％，25.2％，31.91％，的血清中的层粘蛋白ln，以及分别降低了血清透明质酸酶ha22.4％，20.1％，和30.8％，差异具有统计学意义。

③赤芝孢子油预防显著降低血清中胞外基质的含量，和抗心肌纤维化药物氯沙坦42天治疗后有相近的结果，均显著减少了血清胞外基质成分ln和ha成分，表明了赤芝孢子油具有预防心肌纤维化的疗效。

表3各组小鼠血清指标的检测结果(n＝12)

*表示与模型对照组比较p<0.05，n＝12

(6)心脏组织超氧化物歧化酶sod、mda和gsh检测

实验结束动物安乐死后，剖开胸腔，取出心脏，用20ml的0.9％氯化钠生理盐水冲洗3此，洗干净血水后，取左心室使用研钵，在液氮研磨后，加入磷酸缓冲液，按试剂和说明书测定组织的sod、mda和gsh含量。计量单位为nml/mg蛋白。

超氧化酶歧化酶sod是生物体内重要抗氧化酶，用于检测重要脏器损伤后继发性过氧化损伤及其药物治疗效果；丙二醛mda为脂质和不饱和脂肪酸的氧化代谢产物，由于监测脂质氧化水平；谷胱甘肽gsh是低分子自由基清除剂，用于检测集体抗氧化能力大小的重要指标。

结果显示(见表4和图5)：

与模型对照组比较，赤芝孢子油低、中、高预防组中sod水平有显著提高(p<0.05)，分别提高了58.3％，60.0％，79.6％，gsh亦有相同的趋势；同时赤芝孢子油低、中、高浓度预防组中mda含量显著降低，分别降低了28.1％，40.4％，40.7％。

以上结果提示提示了摄入赤芝孢子油能有效提高心脏的的抗氧化能力。

表4各组小鼠的sod、mda和gsh结果(n＝12)

*表示与模型对照组比较p<0.05，n＝12

赤芝孢子油在制备具有预防“主动脉瓣膜病致心肌纤维化”功效的功能性食品和药品中的应用。进一步的，还可以制备具有预防“主动脉瓣膜病致心肌纤维化”功效的药物组合物，包括辅料和功能性食品或药品成分，其中所述的功能性食品或药品成分上述的赤芝孢子油。所述药物组合物的剂型为乳剂或软胶囊剂。辅料可以为常规辅料。

上面列举一部分具体实施例对本发明进行说明，有必要在此指出的是以上具体实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。