一种组合物及其在抗肿瘤药物中的应用的制作方法

本发明属于药品研发领域，尤其涉及一种组合物及其在抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
：含铂抗肿瘤药物，是一种十分有效与有力的化疗试剂，其中顺铂又被称之为癌症中的青霉素，用于治疗多种不同的癌症。据统计，将近50％的癌症患者都接受过铂类物质的治疗，顺铂联合治疗已成为许多癌症治疗的基石。然而，含铂抗肿瘤药物存在着一定的不良反应，尤其是肾毒性与耳毒性，限制了其使用；由于这些副作用，禁止使用高剂量含铂抗肿瘤药物，所以实际治疗之中含铂抗肿瘤药物常采用较低剂量，这也导致病人对含铂抗肿瘤药物容易产生耐药性。同时，大约有三分之一的患者在接受了顺铂治疗之后出现急性肾损伤。因此，研发出一种组合物及其在抗肿瘤药物中的应用，用于解决现有技术中，含铂抗肿瘤药物在用药时，存在着不良反应严重以及容易产生耐药性的技术缺陷，成为了本领域亟待解决的问题。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了一种组合物及其在抗肿瘤药物中的应用，用于解决现有技术中，含铂抗肿瘤药物在用药时，存在着不良反应严重以及容易产生耐药性的技术缺陷。本发明提供了一种组合物，所述组合物包括：含铂抗肿瘤化合物以及螯合剂，所述螯合剂为：钠(s)-2-(二硫代羧酸根((2s，3r，4r，5r)-2,3,4,5,6-五羟基己基)氨基)-4-(甲硫基)丁酸盐(简称gmdtc)。优选地，所述含铂抗肿瘤化合物选自：顺铂、奥沙利铂以及卡铂中的任意一种或多种。优选地，所述含铂抗肿瘤化合物为顺铂。优选地，以摩尔份计，所述组合物包括：含铂抗肿瘤化合物1～5份以及螯合剂1～50份。优选地，以摩尔份计，所述组合物包括：含铂抗肿瘤化合物1～3份以及螯合剂1～20份。优选地，以摩尔份计，所述组合物包括：含铂抗肿瘤化合物1份以及螯合剂20份。本发明还提供了一种包括以上任意一项所述的组合物在抗肿瘤药物中的应用。根据本发明提供的技术方案，该组合物具有以下优点：第一，组合物中的螯合剂对于其中的含铂抗肿瘤化合物以及有毒重金属具有强力螯合效果，同时，又对人体必需的金属(如：钙、铁、镁、锌等)没有影响。第二，根据实验数据显示，在动物实验中，对小鼠和大鼠的急性口服致死剂量(ld50)大于10,000mg/kg，安全性能高，无急毒性。在24小时暴露在1000μm的级别，组合物没有显示对于正常人体肾细胞hk2的细胞毒性作用；同时，还可减少含铂抗肿瘤化合物导诱的细胞凋亡和细胞毒性。第三，组合物可显著提高抗肿瘤功效，例如在4t1乳腺癌异种移植的小鼠模型试验中，可延缓肿瘤生长、抑制转移，血尿素氮(bun)和肌酐(cre)减少，肾近端小管的组织检查中可以看出，组合物的联合治疗可有效降低含铂抗肿瘤化合物单独使用造成的肾毒性。第四，组合物的联合治疗能大幅降低小鼠体内的全身毒性，缓冲含铂抗肿瘤化合物单独使用所引起的体重减少。从血液rbc、wbc、plt以及alt的分析来看，使用组合物的联合治疗之后，血液毒性以及肝毒性显著降低。本发明提供的技术方案中，通过下述作用机理实现其有益效果：螯合剂(gmdtc，d3)，化学名为：钠(s)-2-(二硫代羧酸根((2s，3r，4r，5r)-2,3,4,5,6-五羟基己基)氨基)-4-(甲硫基)丁酸盐。gmdtc是一种具有重金属络合作用的化合物，本研究发现gmdtc与铂类抗肿瘤药物联合应用具有多种协同效应，主要原理如下：1、提高抗肿瘤效果：gmdtc结构中含有葡萄糖残基结构，可以利用细胞膜上的葡萄糖转运体(glut)快速进入细胞，提高药物进入代谢活性高的肿瘤细胞内铂化合物的浓度，从而提高抗肿瘤效果。2、减少肾毒性：gmdtc可利用自身的葡萄糖残基通过肾小管腔膜面的钠葡萄糖共转运体(sglt2)进入肾小管细胞，通过gmdtc上的二巯基特异性地与铂化合物络合形成gmdtc配合物，再通过基底面的葡萄糖转运体(glut2)进入血液，再经肾小球滤出，随尿液排出体外。由于铂化合物的排出而显著减少肾毒性。铂类抗肿瘤药物治疗过程中同时给予一定量的gmdtc，gmctc可以使铂类抗肿瘤药物形成gmdtc络合形态。络合后，gmdtc可以加速铂类抗肿瘤药物进入与排出细胞的活力，改善药物的动力学特性；同时，药物的含铂代谢产物与gmdtc络后更易通过肾排出，降低药物的毒副反应。因此，gmdtc与铂类抗肿瘤药物联用具有增效及减毒的双重作用。综上所述，本发明提供了一种组合物，所述组合物包括：含铂抗肿瘤化合物以及螯合剂，所述螯合剂为：钠(s)-2-(二硫代羧酸根((2s，3r，4r，5r)-2,3,4,5,6-五羟基己基)氨基)-4-(甲硫基)丁酸盐。本发明还提供了上述组合物在抗肿瘤药物中的应用。经实验测定可得，组合物中的螯合剂可有效螯合含铂抗肿瘤化合物，降低含铂化合物单独使用时的各项不良反应，可提高含铂抗肿瘤化合物的用药量，优化抗肿瘤效果；同时，螯合剂自身无毒性，不会螯合人体必需的金属，对人体无不良影响。本发明提供的一种组合物及其在抗肿瘤药物应用，解决了现有技术中，含铂抗肿瘤药物在用药时，存在着不良反应大以及容易产生耐药性的技术缺陷。附图说明图1为本发明实施例中，螯合剂gmdtc紫外光谱，顺铂及顺铂+gmdtc复合物hplc图谱及紫外特征；图2为本发明实施例中，螯合剂gmdtc处理后的体外细胞活力测试；图3为本发明实施例中，顺铂和螯合剂处理后的体外细胞活力试验；图4为本发明实施例中，在螯合剂gmdtc和顺铂处理后，hk2细胞活力测试；图5为本发明实施例中，hk2细胞中铂含量测定试验；图6为本发明实施例中，顺铂与gmdtc螯合剂给药后的小鼠血液bun、cre指标；图7为本发明实施例中，小鼠组织病理学切片；图8为本发明实施例中，4t1小鼠模型肿瘤增长曲线示意图；图9为本发明实施例中，4t1小鼠模型在疗程结束后的肿瘤重量测定结果；图10为本发明实施例提供的一种组合物中，螯合剂的化学结构式。具体实施方式本发明实施例提供了一种组合物及其在抗肿瘤药物应用，用于解决现有技术中，含铂抗肿瘤药物在用药时，存在着不良反应大以及容易产生耐药性的技术缺陷。下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。为了更详细说明本发明，下面结合实施例对本发明实施例提供的一种组合物及其在抗肿瘤药物应用，进行具体地描述。实施例1本实施例为制备抗肿瘤组合物的具体实施例。1000μmol螯合剂与50μmol顺铂用药学可接受溶剂混合，得组合物1。1000μmol螯合剂与50μmol奥沙利铂用药学可接受溶剂混合，得组合物2。1000μmol螯合剂与50μmol卡铂用药学可接受溶剂混合，得组合物3。实施例2本实施例为测定螯合剂与含铂抗肿瘤化合物组合后络合效果的具体实施例。本实施例中，所使用的测定方法为hplc测定法；其中，固定相为c18柱(250mm×4.6mm，粒径5μm)；梯度流动相为：0-8min时，h2o/乙腈的体积比77：23(+0.1％h3po4)，8-13min时，h2o/乙腈的体积比68：32(+0.1％h3po4)，13-16min时，h2o/乙腈的体积比23：77(+0.1％h3po4)，16-40min时，h2o/乙腈的体积比77：23(+0.1％h3po4)；流速：1.0ml/min；10μl样品加载，dad检测器，uv350nm复合物。通过紫外-可见(uv/vis)光谱进行识别和量化分析化学中的化学物质，使用nanodropone扫描uv光谱，溶于水的顺铂在210nm处具有峰值uv吸光度，螯合剂水溶液在263和293nm处具有两个uv吸收峰。将顺铂和螯合剂混合后，保持并使其在4℃下反应24小时，形成新的反应产物，从图1中可以得出，螯合剂可以与顺铂反应并结合形成螯合剂-顺铂复合物。实施例3本实施例为测定螯合剂减缓含铂抗肿瘤化合物毒性效应在体外细胞水平的具体实施例。3.1细胞培养所使用的细胞包括：人肾近端小管细胞系hk2(atcccrl2190)、猪近端小管细胞系llc-pk1(atcccl101)和小鼠乳腺癌细胞系4t1(atcccrl2539)，均购自americantypeculturecollection。llc-pk1细胞在dulbecco改良的eagle培养基(dmem)中培养，hk2细胞在dmem/f12培养基中培养，4t1细胞在rpmi1640培养基中培养。所有细胞培养基补充有10％fbs，100单位/ml青霉素和100单位/ml链霉素。将细胞系在5％co2气氛中于37℃温育，并每周传代培养2次。3.2体外细胞活力测定用胰蛋白酶处理hk2和llc-pk1细胞，并以10,000个细胞/孔的密度接种到96孔板中的100μl培养基中，然后在处理前孵育24小时。对于螯合剂的毒性效应分析，用不同剂量的螯合剂处理细胞24小时。对于螯合剂减少含铂抗肿瘤化合物毒性作用，此处以顺铂为例，进行毒性效应分析，将细胞用不同剂量的螯合剂和50μm顺铂共同处理24小时。对于螯合剂营救顺铂毒性效应分析，用300μm顺铂预处理细胞30分钟，用pbs洗涤两次，更换培养基，然后用不同剂量的螯合剂处理48小时。处理后，使用mtt测定法测量细胞活力。向每个孔中加入10μl12mm的mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑)储备溶液。在37℃孵育4小时后，除去培养基并向每个孔中加入100μl二甲基亚砜(dmso)，然后将板在37℃下孵育10分钟。使用平板振荡器混合平板，并使用读板器(bio-tek)在570nm处读取吸光度。3.3体外facs细胞凋亡试验使用fitc膜联蛋白v/死细胞凋亡试剂盒(v13242，invitrogen)分析细胞凋亡。hk2和llc-pk1细胞在6孔板中培养，将细胞用pbs、50μm顺铂或50μm顺铂+1000μm的螯合剂在37℃处理24小时。处理后收获细胞，在冷pbs中洗涤，并以1×106个细胞/ml的密度重悬浮于膜联蛋白结合缓冲液中，将5μlfitc膜联蛋白v和1μl的100μg/mlpi工作溶液加入到每个100μl细胞悬浮液中，并将细胞在室温下孵化15分钟。孵化结束后，加入400μl膜联蛋白结合缓冲液，轻轻混合，同时将样品保持在冰上；然后，将细胞悬浮液转移至facs管并在bdfortessa流式细胞仪上，分析膜联蛋白-v/pi染色，测量530nm和>575nm处的荧光强度，使用fcsexpress6软件(denovosoftware)分析数据。3.4结果：3.4.1螯合剂gmdtc对hk2和llc-pk1细胞的毒性研究hk2和llc-pk1是永生化的肾近端小管细胞系。hk2从人肾中分离，llc-pk1来自猪肾，利用上述细胞用于分析螯合剂或顺铂在体外的毒性。用不同剂量的螯合剂处理hk2和llc-pk1细胞24小时，使用mtt细胞活力测定法测量毒性。与空白对照相比，螯合剂对hk2细胞(1000μm)和llc-pk1细胞(400μm)的细胞活力的影响没有显著性差异(图2a、b)。螯合剂降低两种细胞活力的效应成剂量依赖性。螯合剂对两种细胞的毒性很低，ic50约为8mm。3.4.2螯合剂gmdtc抑制顺铂引起的细胞毒性用50μm顺铂，或1000μm的螯合剂，或50μm顺铂+递度剂量的螯合剂处理hk2和llc-pk1细胞24小时，使用mtt细胞活力测定法测量毒性。两种细胞在顺铂暴露后均显示出了50％的细胞活力下降。螯合剂可以抑制顺铂的细胞毒性，并提高细胞活力至80％。细胞活力随螯合剂剂量的增加而增加。结果如图3所示，在llc-pk1细胞系试验中，共处理可以降低螯合剂和顺铂两者引起的细胞毒性。3.4.3螯合剂gmdtc对顺铂引起的hk2细胞毒性的减毒作用hk2细胞经300μm的顺铂预处理30分钟，pbs洗涤两次，进行培养基替代，然后用不同浓度的螯合剂处理48小时。hk2细胞活性下降至低于对照组的40％。受损的细胞可以被螯合剂保护，细胞活力增长致对照组的60％。结果如图4所示，螯合剂可以有效减少顺铂产生的细胞损害。3.4.4螯合剂抑制hk2细胞对顺铂的摄取，并能加快铂从细胞内清除通过ipc-ms法测定细胞中铂的含量。当给于50μm顺铂处理时，hk2细胞中的铂浓度为202.6ng/106；当共同给予1000μm的螯合剂时，hk2细胞中的铂浓度将大幅下降至17.2ng/106，下降率达到91.5％。当hk2细胞给予短时间的顺铂暴露30分钟，然后移除并陪养48小时，铂浓度为8.33ng/106。在给予顺铂作用48小时后，用1000μm的螯合剂进行干预，hk2细胞中的铂浓度下降至5.16ng/106，下降率达到38.0％。结果如图5所示，螯合剂可以通过抑制hk2细胞对顺铂的摄取而降低其细胞毒性，同时螯合剂在细胞的营救作用中能加快铂从细胞内清除。实施例4本实施例为测定组合物对小鼠肿瘤动物模型作用的具体实施例。4.1小鼠4t1乳腺癌模型选用来自charlesriverlaboratories的雌性balb/c小鼠，8周龄，体重19-20g。给小鼠喂食标准的啮齿动物饮食，随意饮水。将动物维持在12小时光/暗循环中，恒温(20±1℃)和湿度(50±5％)。所有动物程序均按照动物护理和使用委员会批准的方案进行。将4t1乳腺癌细胞(1×105)皮下植入balb/c小鼠的右乳腺。注射后，监测小鼠10天，然后，根据肿瘤大小和体重随机分成3组，每组6只动物，药物治疗在第11天开始。对照组腹腔内注射(i.p.)0.9％盐水。顺铂治疗组腹腔注射，每周两次，使用5mg/kg顺铂。实验组(顺铂-螯合剂共处理)每周两次注射5mg/kg顺铂，每天一次注射500mg/kg螯合剂i.p.，顺铂后2小时注射螯合剂；所有小鼠均治疗3周。使用公式v＝π(a×b^2)/6估计肿瘤体积，其中a和b是使用卡尺测量的肿瘤的最长和最短直径。在实验期间每3-4天监测小鼠体重，并在治疗结束时处死小鼠。在使用异氟烷吸入麻醉后，使用心脏血液收集作为终止程序。此外，在处死后立即取肿瘤、肝脏、肾脏、肾上腺、脾脏、脑、肺和心脏以记录重量。然后，分离一半组织并立即在液氮中冷冻用于将来分析，剩余的一半储存在10％福尔马林中用于组织病理学检查。4.2试验方法：血液分析方法使用edta管收集全血用于全血细胞计数(cbc)测试。通过离心使用肝素涂覆的管收集血液获得血浆，用于血液化学测试和其他分析，包括cbc、血液化学测试，血浆bun和肌酸酐水平作为肾损伤的标志物。4.3试验方法：组织病理学方法小鼠组织的组织病理学检查：在苏木精和伊红(he)染色的4μm厚的脱石蜡切片中评估肾脏的组织病理学变化。通过在肾的皮质髓质连接处的10个不同视野(zeissaxioimager电化荧光显微镜)中评价肾小管扩张，坏死，细胞凋亡和铸型形成来评估管状损伤。4.4试验方法：铂的组织分布测定方法切下肾片，称重并溶解在70％hno3中，用70％hno3稀释血浆。使用100℃的热块加热样品直至完全蒸发。将所有固体残余物重新溶解在5ml2％hno3中。通过电感耦合等离子体光谱法(icp-ms)测量铂的量。4.5实验结果4.5.1螯合剂gmdtc对顺铂导致的中毒性肾损害的抑制作用采用乳腺癌4t1小鼠模型评估螯合剂的抗肿瘤作用和保护作用。如图6所示，每周给予两次5mg/kg顺铂。螯合剂组在给予顺铂2小时后，给予500mg/kg的螯合剂。3周后，给予顺铂小鼠的平均bun水平为87.9mg/dl，达到对照组的4倍。当采用螯合剂进行干预时，bun水平下降至47.6mg/dl，下降率为46％。cre水平测试得到相似的结论。肾的病理切片结果(图7)显示，顺铂组小鼠显示，从延髓外侧延伸到皮质小管出现细胞广泛坏死和变性区域。而螯合剂干预组与对照组间则未见到明显差异。4.5.2顺铂+gmdtc螯合剂的抗肿瘤活性测定通过对肿瘤相关指标的测定，与顺铂单用相比较，顺铂+gmdtc螯合剂并不会降低抗肿瘤活性(图8)。在肿瘤增长测定与给药结束后最终肿瘤大小测定中，与对照组相比，顺铂+螯合剂共治疗组显著地抑制了肿瘤的增长与转移(图9)。4.5.3螯合剂对体内常规金属含量的影响小鼠中的其他必需金属也通过icp-ms分析(表1)，与对照小鼠相比，螯合剂并未对体内正常金属，如：zn2+、mg2+、al3+、mn2+和cu2+等，的具体含量及分布造成干扰，所得结果请参阅表1和表2。表1给予顺铂和gmdtc后，体内常规金属含量在肾脏和血桨中的分布(ug/g)24mn27al55mn65cu66zn195ptcontrol236.54.221.044.7323.60.015cisplatin237.83.930.924.1324.49.841cp+gmdtc253.16.781.095.9631.37.347表2给予顺铂和gmdtc后，体内常规金属含量在肾脏和血桨中的分布(ug/g)24mn27al55mn65cu66zn195ptcontrol35.73.600.0091.331.270.001cisplatin28.75.230.0101.570.900.175cp+gmdtc24.83.600.0101.660.760.124综上所述，本发明提供了一种组合物，所述组合物包括：含铂抗肿瘤化合物以及螯合剂，所述螯合剂为：钠(s)-2-(二硫代羧酸根((2s，3r，4r，5r)-2,3,4,5,6-五羟基己基)氨基)-4-(甲硫基)丁酸盐。本发明还提供了上述组合物在抗肿瘤药物中的应用。经实验测定可得，组合物中的螯合剂可有效螯合含铂抗肿瘤化合物的重金属，有效降低了含铂化合物单独使用时的各项不良反应，可提高含铂抗肿瘤化合物的用药量，优化抗肿瘤效果；同时，螯合剂自身无毒性，不会螯合人体必需的金属，对人体无不良影响。本发明提供的一种组合物及其在抗肿瘤药物应用，解决了现有技术中，含铂抗肿瘤药物在用药时，存在着不良反应大以及容易产生耐药性的技术缺陷。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12