一种以药桑叶多糖为载体的口服胰岛素制剂的制备方法与流程

本发明涉及降血糖药物应用技术领域。具体地说是一种以药桑叶多糖为载体的口服胰岛素制剂的制备方法。

背景技术：

糖尿病及其并发症的预防和治疗己然成为了一个全球性的重大公共健康难题。目前临床上用于治疗糖尿病的首选药和用药方式是注射胰岛素，虽然降糖作用明显但存在较大的副作用，易导致低血糖，致使糖尿病患者往往不能得到有效的治疗，同时也给患者带来很大的痛苦。因此，找到一种无痛且高效的治疗药物和方法成为首要解决的问题。

药桑(morusnigral)属于桑科(moraceae)桑属(morusnigra)黑桑种，是新疆南疆阿克苏、和田、喀什地区古老的果树之一，耐干旱、耐瘠薄，是新疆蚕区独一无二的特殊稀贵资源，其中桑叶具有降血糖、消炎、补血和镇静等药用功能，研究表明，药桑叶多糖是降血糖的主要活性成分之一，在治疗糖尿病上具有多向调节作用。近年来，多糖类纳米载药体系引起了人们越来越多的关注，其主要原因是多糖来源丰富、具有稳定、无毒、无免疫抗原性、水溶性好、优良的生物相容性和可生物降解性等优点。此外，多糖分子链上具备很多活性基团如羟基、氨基等便于进一步化学修饰。

技术实现要素：

为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种以药桑叶多糖为载体的口服胰岛素制剂的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

一种以药桑叶多糖为载体的口服胰岛素制剂的制备方法，包括如下步骤:

(1)药桑叶多糖-苯硼酸载体的构建；

(2)药桑叶多糖-苯硼酸载体纳米载体的自组装；

(3)口服胰岛素制剂的制备。

上述以药桑叶多糖为载体的口服胰岛素制剂的制备方法，在步骤(1)中，将药桑叶多糖和n,n'-羰基二咪唑分别溶解于二甲基亚砜dmso中，加入三乙胺tea，避光、氮气保护下搅拌反应一段时间后，缓慢加入到3-氨基甲酰基苯硼酸中或同时加入柠檬酸三丁酯作为结构调控剂，继续反应一段时间，反应完毕后，将反应液转入纤维素透析袋中透析，将保留液冷冻干燥，得到药桑叶多糖-苯硼酸载体。

上述以药桑叶多糖为载体的口服胰岛素制剂的制备方法，在步骤(2)中，将步骤(1)中得到的药桑叶多糖-苯硼酸载体溶解在四氢呋喃中或同时加入三乙醇胺作为结构调控剂；然后在旋转蒸发仪中蒸发使形成一层均匀薄膜，再搅拌下进行水化，超声分散，纤维素透析袋透析，将保留液冷冻干燥，得到药桑叶多糖-苯硼酸纳米载体。

上述以药桑叶多糖为载体的口服胰岛素制剂的制备方法，在步骤(3)中，将步骤(2)中得到的药桑叶多糖-苯硼酸纳米载体溶解在四氢呋喃中，溶解后缓慢滴加到胰岛素溶液中，搅拌，将包埋胰岛素的载体溶液装入纤维素透析袋中透析，透析后保留液冷冻干燥，得到口服胰岛素制剂。

上述以药桑叶多糖为载体的口服胰岛素制剂的制备方法，在步骤(1)中，将1g药桑叶多糖和0.2mgn,n'-羰基二咪唑分别溶解于10ml二甲基亚砜dmso中，加入0.2ml三乙胺tea，避光、氮气保护下搅拌反应4h后，缓慢加入到0.2mg的3-氨基甲酰基苯硼酸中或同时加入2ml柠檬酸三丁酯作为结构调控剂，滴加时间为2h，继续反应12h，反应完毕后，将反应液转入截留分子量mwco＝8000的纤维素透析袋中袋透析48h，利用冷冻干燥机fd-1在1pa、-45℃的条件下将保留液冻干得到药桑叶多糖-苯硼酸载体。

上述以药桑叶多糖为载体的口服胰岛素制剂的制备方法，在步骤(2)中，将步骤(1)中得到的药桑叶多糖-苯硼酸载体100mg在50ml四氢呋喃中溶解或同时加入15ml三乙醇胺作为结构调控剂，然后在旋转蒸发仪中，温度为60℃、转速为40转/min的条件下蒸发使形成一层均匀薄膜，再搅拌下进行水化30min，在频率为40khz、功率为360w的条件下进行超声分散30min，用截留分子量mwco＝3500的纤维素透析袋透析，利用冷冻干燥机fd-1将保留液在1pa、-45℃的条件下冷冻干燥，得到药桑叶多糖-苯硼酸纳米载体。

上述以药桑叶多糖为载体的口服胰岛素制剂的制备方法，在步骤(3)中，将步骤(2)中得到的药桑叶多糖-苯硼酸纳米载体100mg溶解在50ml四氢呋喃中，溶解后缓慢滴加到浓度为40iu/ml的胰岛素溶液中，搅拌30min，将包埋胰岛素的载体溶液装入截留分子量为mwco＝8000的纤维素透析袋中透析4h，利用冷冻干燥机fd-1将保留液在1pa、-45℃的条件下冷冻干燥，得到口服胰岛素制剂。

上述以药桑叶多糖为载体的口服胰岛素制剂的制备方法，所述药桑叶多糖的制备方法如下：药桑叶自然阴干后粉碎，过筛得药桑叶粉，用热水对药桑叶粉进行浸渍提取，离心取上清液，对上清液进行浓缩得浓缩提取液，向浓缩提取液中加入乙醇溶液进行沉淀，离心后取沉淀，依次用无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤，冷冻干燥，即得药桑叶粗多糖。

上述以药桑叶多糖为载体的口服胰岛素制剂的制备方法，在药桑叶多糖的制备方法中：过60目筛得药桑叶粉，浸渍提取时的温度为90℃、提取时间为3h、液料比25∶1g/ml，获取上清液时离心的转速为5000r/min、离心时间为5min，向浓缩提取液中加入4倍体积的乙醇溶液，获取沉淀时离心的转速为5000r/min、离心时间为5min。

本发明的技术方案取得了如下有益的技术效果：

本发明以药桑叶多糖为载体材料，采用具有葡萄糖敏感的苯硼酸修饰药桑叶多糖，自组装成纳米载体后可以装载和输送降糖药物胰岛素，口服给药后使多糖载体和胰岛素发挥协同降血糖作用。胰岛素在药桑叶多糖-苯硼酸纳米载体保护下能够缓慢释放，胃肠酸性条件对药桑叶多糖-苯硼酸纳米载体的影响不大，在12h内胰岛素累积释放量达到60％，且对葡萄糖具有响应性，能够在高糖条件下释放胰岛素，降低血糖。本发明制备的药桑叶多糖-苯硼酸纳米载体对胰岛素具有较高的包埋率和载药率，缓释的时间更长，可降低患者的服药次数，减少患者的痛苦。

附图说明

图1本发明以药桑叶多糖为载体的口服胰岛素制剂的制备方法中载体合成、自组装及药物释放流程图；

图2本发明以药桑叶多糖为载体的口服胰岛素制剂方法中胰岛素制剂在不同ph条件下以及葡萄糖溶液中的释放图；

图3本发明以药桑叶多糖为载体的口服胰岛素制剂方法中胰岛素制剂在不同ph条件下以及葡萄糖溶液中的释放图。

具体实施方式

实施例1

(1)药桑叶多糖-苯硼酸载体的构建：

本实施例所用药桑叶多糖采用本课题组成员前期制备的(药桑叶多糖提取工艺优化及其降血糖活性研究；韩爱芝，王丽君，贾清华，王子坤，马玲，杨玲；《中国酿造》，2017年第36卷第8期139-143页)，具体制备方法如下：药桑叶自然阴干后粉碎，过60目筛得药桑叶粉，用90℃热水对药桑叶粉进行浸渍提取、提取时间为3h、液料比25∶1g/ml，离心取上清液(转速为5000r/min、离心时间为5min)，对上清液进行浓缩(旋转蒸发仪，温度为60℃、转速为40转/min)上)得浓缩提取液，向浓缩提取液中加入4倍体积的乙醇进行沉淀，离心后取沉淀(转速为5000r/min、离心时间为5min)，依次用无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤，冷冻干燥，即得药桑叶粗多糖。

将1g药桑叶多糖和0.2mgn,n'-羰基二咪唑分别溶解于10ml二甲基亚砜dmso中，加入0.2ml三乙胺tea，避光、氮气保护下搅拌反应4h后，缓慢加入到0.2mg的3-氨基甲酰基苯硼酸中，滴加时间为2h，继续反应12h，反应完毕后，将反应液转入截留分子量mwco＝8000的纤维素透析袋中袋透析48h，利用冷冻干燥机fd-1在1pa、-45℃的条件下将保留液冻干得到药桑叶多糖-苯硼酸载体。

(2)药桑叶多糖-苯硼酸载体纳米载体的自组装(如图1所示)：将步骤(1)中得到的药桑叶多糖-苯硼酸载体100mg在50ml四氢呋喃中溶解，然后在旋转蒸发仪中，温度为60℃、转速为40转/min的条件下蒸发使形成一层均匀薄膜，再搅拌下进行水化30min，在频率为40khz、功率为360w的条件下进行超声分散30min，用截留分子量mwco＝3500的纤维素透析袋透析，利用冷冻干燥机fd-1将保留液在1pa、-45℃的条件下冷冻干燥，得到药桑叶多糖-苯硼酸纳米载体。

(3)口服胰岛素制剂的制备：将步骤(2)中得到的药桑叶多糖-苯硼酸纳米载体100mg溶解在50ml四氢呋喃中，溶解后缓慢滴加到浓度为40iu/ml的胰岛素溶液中，搅拌30min，将包埋胰岛素的载体溶液装入截留分子量为mwco＝8000的纤维素透析袋中透析4h，利用冷冻干燥机fd-1将保留液在1pa、-45℃的条件下冷冻干燥，得到口服胰岛素制剂。

药桑叶多糖-苯硼酸载体的性质研究

(1)包封率和载药率

胰岛素的含量用蛋白浓度测定试剂盒(microbcaproteinassay)，用酶标仪在562nm下测量吸光度，根据标准曲线法计算含量。在粒径仪上测定药桑叶多糖-苯硼酸载体装载胰岛素前和装载胰岛素后的粒径大小，结果表明药桑多糖-苯硼酸载体载胰岛素的载药率和包封率分别为5.35±3.22％、68.36±4.21％，装载胰岛素前后粒径大小基本不变。见表1。

表1载药率和包封率

(2)药物释放

将制备的口服胰岛素制配制成1mg/ml溶液，在37℃下，将口服胰岛素制剂溶液分别置于ph＝7.4的缓冲溶液、人工胃液(sgf，ph＝1.2)、人工肠液(sif，ph＝6.8)和5g/l的葡萄糖溶液(ph＝7.4)中，慢速搅拌，0.5、1、2、4、6、8、10、12h取样，测定在不同时间段内胰岛素的释放量。

如图2所示，结果表明在ph＝7.4，ph＝1.2和ph＝6.8条件下，胰岛素的释放情况基本一致，ph＝7.4时在12h内药物累积释放量达到58％，ph＝6.8时在12h内药物累积释放量达到60％，ph＝1.2时在12h内药物累积释放量达到62％，说明胰岛素在药桑叶多糖-苯硼酸纳米载体保护下能够缓慢释放，胃肠酸性条件对药桑叶多糖-苯硼酸纳米载体的影响不大。在葡萄糖5g/l的浓度下，胰岛素的释放量明显增加，说明具有葡萄糖响应性，能够在高糖条件下释放胰岛素，降低血糖。

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于：

在步骤(1)中：将药桑叶多糖、n,n'-羰基二咪唑、二甲基亚砜dmso和三乙胺tea四者反应后的混合物缓慢加入到3-氨基甲酰基苯硼酸中时，同时滴加2ml柠檬酸三丁酯作为结构调控剂，使得3-氨基甲酰基苯硼酸和药桑多糖首先反应生成较为有序的药桑多糖-苯硼酸。在步骤(2)中：将得到的药桑叶多糖-苯硼酸载体在四氢呋喃中溶解时，同时加入15ml三乙醇胺作为结构调控剂，这样使得自组装生成的多糖纳米载体空洞规整有序，不仅可以负载更多的胰岛素，而且还可以更加缓慢地释放胰岛素。所得药桑叶多糖-苯硼酸载体的包封率和载药率如表2所示，负载胰岛素之后的释放情况如图3所示。

由表2可以看出：药桑叶多糖-苯硼酸载体载胰岛素的载药率和包封率分别为6.87±2.29％、89.21±2.80％，装载胰岛素前后粒径大小基本不变。与实施例1相比，载药率和包封率均有大幅提升。

表2载药率和包封率

如图3所示，本实施例口服胰岛素制剂在ph＝7.4，ph＝1.2和ph＝6.8条件下，胰岛素的释放情况基本一致，ph＝7.4时在12h内药物累积释放量达到50％，ph＝6.8时在12h内药物累积释放量达到53％，ph＝1.2时在12h内药物累积释放量达到56％。相比实施例1中制得的口服胰岛素制剂，胰岛素在药桑叶多糖-苯硼酸纳米载体保护下释放更加缓慢，胃肠酸性条件对药桑叶多糖-苯硼酸纳米载体的影响不大。在葡萄糖5g/l的浓度下，胰岛素的释放量明显增加，说明具有葡萄糖响应性，能够在高糖条件下释放胰岛素，降低血糖。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本专利申请权利要求的保护范围之中。