一种西洋参发酵液作为护肤品或护肤品添加剂的应用的制作方法

本发明属于药材发酵液应用领域，具体涉及一种西洋参发酵液作为护肤品或护肤品添加剂的应用。
背景技术：
随着人均可支配收入增加和社交网络高速发展，全世界都更加重视皮肤护理，甚至打出颜值即正义的口号。伴随而来的是因为追求即刻效果，而添加激素、抗生素、重金属等有害物质，给肌肤带来更大的伤害。还有很多人通过医学美容重塑肌肤，但当前医学美容存在乱象多、安全隐患多的问题，要得到有保障的医学美容仍需很长时间。因此选择来源天然、安全有效的护肤添加剂或护肤品并坚持使用，才是对皮肤最好的护理。西洋参为名贵中药材，其所含皂苷的医疗保健价值在国内外已经获得高度认可，因此医疗保健企业最大限度提取皂苷后就将西洋参舍去。西洋参种植五年以上才采收，种植耗时长，采收后需轮作，土地利用率低，药材使用上的浪费极度不环保。技术实现要素：提取皂苷后的西洋参中还余有高达60％的总糖、蛋白质、微量元素、矿物质等，这些物质都有益于皮肤的护理。纤维素、果胶等形成的细胞壁会阻碍活性物质的溶出，高温易使蛋白质变性，成分水溶性，降低大分子提高小分子占比，扩增有效成分，减少纯化步骤等问题，在当前的水煎煮、已有的发酵手段都未得到很好的解决，因此如何最大程度和最便利地使用这些护肤成分，需要技术革新。本发明旨在提供一种采用特定方法制备得到西洋参发酵液作为护肤品或护肤品添加剂的应用。具体地，本发明提供了一种西洋参发酵液作为护肤品或护肤品添加剂的应用，其中，所述西洋参发酵液按照包括以下步骤的方法制备得到：(1)往提取皂苷后的西洋参中加入水，粉碎并过筛，并将所得滤液的ph值调节至4-5，得到酶解底物；(2)往所述酶解底物中加入纤维素酶和果胶酶，之后在45-55℃下酶解反应6-8h，得到酶解液；(3)往所述酶解液中加入碳源、氮源和碳酸钙，调节ph至6.0-6.5，超高温瞬时灭菌，随后加入发酵菌并在30-40℃下发酵3-5天，得到发酵液；(4)将所述发酵液进行固液分离，所得液体组分采用0.2-0.5μm的滤膜过滤。优选地，步骤(1)中，所述过筛所采用的筛网的孔径为10-14目。优选地，步骤(1)中，所述西洋参与水的重量比为1：(19-29)。根据本发明，步骤(2)中，往所述酶解底物中加入纤维素酶和果胶酶之后在特定的条件下进行酶解反应，能够瓦解酶解底物的细胞壁结构，使细胞内容物流出，纤维素转变成可溶性多糖，果胶从细胞壁上溶出，部分果胶进一步降解以增加水溶性小分子，同时能够带给肌肤柔滑的肤感。优选地，步骤(2)中，所述西洋参与纤维素酶的用量比为1g：(15-20u)，所述西洋参与果胶酶的用量比为1g：(5-8u)。优选地，步骤(2)中，在所述酶解反应过程中每10分钟搅动一次，这样能够使得酶解反应更为彻底。根据本发明，步骤(3)中，所述发酵菌优选为植物乳杆菌、肠膜明串珠菌、嗜酸乳杆菌按照(2-3):(1-2):(4-5)重量比组成的混合物。利用植物乳杆菌、肠膜明串珠菌和嗜酸乳杆菌三种益生菌对酶解液进行发酵，这三种益生菌的发酵液气味比霉菌、酵母菌更好些，而且能产生乳酸等保湿成分和益生因子，满足最便利使用发酵液的目的。利用体系中碳源和氮源迅速增殖的发酵菌产生的代谢产物能够将酶解液中的多糖和蛋白质进行转化，大分子变成小分子，增加易透过皮肤屏障结构的有效物含量，同时产生乳酸等有机酸以及益生因子，通过维持皮肤的弱酸性以及益生因子的存在，能够促进皮肤微生态的稳固，进而改善痘痘肌等皮肤问题。此外，采用超高温瞬时灭菌(uht灭菌)的方式进行灭菌处理，能够最大程度地减少蛋白质、维生素等的损失，保证发酵前物料的活性。优选地，所述西洋参与碳源和氮源的重量比为1：(0.8-1.0)：(0.0009-0.0012)。优选地，所述碳源的具体实例包括但不限于：葡萄糖和/或蔗糖。优选地，所述氮源的具体实例包括但不限于：蛋白胨、酵母浸粉、玉米浆和小麦低聚肽中的至少一种。优选地，所述西洋参与碳酸钙的重量比为1：(0.01-0.02)，更优选为1：(0.01-0.013)。优选地，所述超高温瞬时灭菌的条件包括温度为130-145℃，时间为7-10s。优选地，所述发酵菌的用量为所述酶解液用量的0.1-2wt％。优选地，所述固液分离的方式为离心分离，且离心分离的速率为3500-4500r/min。本发明提供的西洋参发酵液的制备方法还优选包括滤膜过滤之后的无菌灌装步骤。其中，采用本发明提供的方法制备得到的西洋参发酵液的ph值为3.5-4.0，在该ph值下配合无菌灌装能够共同形成优异的抗菌条件，实现在无防腐剂下保存，满足使用者对零添加的需求。此外，采用滤膜过滤，能够避免高温对发酵液颜色、澄清透明度、有效物的破坏，进而避免影响发酵液作为护肤品或护肤添加剂的料体稳定性。采用本发明提供的方法获得的西洋参发酵液含有单糖、多糖、肽、氨基酸、维生素、有机酸、益生因子等活性成分，经细胞、人体试验证明有很好的护肤作用，能刺激胶原蛋白形成和减少胶原蛋白降解，对红血丝、皱纹、痘痘、色素均有改善作用，来源天然，安全性高，可用于日常的美容护肤(作为护肤品或护肤品添加剂)。当所述西洋参发酵液作为护肤品或护肤品添加剂时，所述西洋参发酵液的添加量优选1-90wt％。所述西洋参发酵液可复配护肤领域可接受的其他原料制成护肤品。本发明的有益效果如下：所得西洋参发酵液富含多种肌肤有益成分，能刺激胶原蛋白形成和减少胶原蛋白降解，对红血丝、皱纹、痘痘、色素有改善作用，来源天然，安全性高，无需添加防腐剂，发酵液澄清透明度高，单用即可有效护肤，还可复配护肤领域的其他原料制成护肤品，添加工艺简单，所得护肤品稳定性高。附图说明图1为实施例制得的西洋参发酵液对胶原蛋白含量的影响；图2为实施例制得的西洋参发酵液对基质金属蛋白酶(mmp-1)的影响。具体实施方式下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。以下实施例和对比例中：纤维素酶购自夏盛实业集团，7000u/g；果胶酶购自夏盛实业集团，60000u/g。菌种均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，其中，植物乳杆菌的保藏号为cicc20242，肠膜明串珠菌的保藏号为cicc21859，嗜酸乳杆菌的保藏号为cicc22150。实施例西洋参发酵液制备工艺的优化1、酶单用和复配的效果差别提取皂苷后的西洋参中加入水(提取皂苷后的西洋参与水的重量比为1:19)，粉碎，将粉碎产物通过12目筛，调节ph值至4.5，得到酶解底物。往酶解底物中分别加入纤维素酶、果胶酶、纤维素酶和果胶酶复配物，见表1，在45℃下酶解反应6h，得到酶解液。将酶解液离心3500rpm/min*20min，倾出上清液，烘干沉淀物，对比沉淀物占比。表1酶单用和复配的效果差别单用纤维素酶、果胶酶，对酶解底物的降解效率低，复配使用时对酶解底物的降解效率高，且复配使用时西洋参与纤维素酶的用量比优选为1g：(15-20u)，所述西洋参与果胶酶的用量比优选为1g：(5-8u)。2、酶解时间提取皂苷后的西洋参中加入水(提取皂苷后的西洋参与水的重量比为1:19)，粉碎，将粉碎产物通过12目筛，调节ph值至4.5，得到酶解底物。往酶解底物中分别加入纤维素酶1g:15u+果胶酶1g:5u，在45℃下酶解反应2h、4h、6h、8h、10h，得到酶解液。将酶解液离心3500rpm/min*20min，倾出上清液，烘干沉淀物，对比沉淀物占比。表2不同酶解时间的效果差别分组2h4h6h8h10h沉淀物占比(wt％)3.162.872.422.332.27酶解时间在4h以下，酶解程度较低。在10h酶解程度与8h无明显差异，又增加能耗，因此酶解时间优选为6h-8h。3、发酵菌单用和复配效用的差别提取皂苷后的西洋参中加入水(提取皂苷后的西洋参与水的重量比为1:19)，粉碎，将粉碎产物通过12目筛，调节ph值至4.5，得到酶解底物。往酶解底物中分别加入纤维素酶1g:15u+果胶酶1g:5u，在45℃下酶解反应6h，得到酶解液。往酶解液中投入碳源、氮源、碳酸钙(其中，碳源为葡萄糖，氮源为小麦低聚肽，西洋参与碳源、氮源和碳酸钙的重量比为1:0.9:0.001:0.01)，搅拌，调节ph至6.5，之后将反应液通过超高温瞬时灭菌设备于138℃下灭菌处理8s，转移入发酵罐。将1wt％的不同发酵菌分别接种到发酵罐中，在37℃下搅拌发酵3天，得到发酵液。将发酵液于4000r/min下进行离心，取离心液，经0.45μm滤膜过滤，无菌灌装，即得澄清透明的西洋参发酵液。皮肤真皮层的成纤维细胞与其分泌的胶原蛋白、弹力蛋白及基质成分共同构成了真皮的主体，因此成纤维细胞生物学特性的改变，是皱纹形成的根本原因。胶原蛋白是一种高分子蛋白质，是维持皮肤张力和承受拉力的重要成分，维持皮肤饱满充盈的物质基础。随着年龄的增长及外界因素的作用，真皮中胶原蛋白逐渐减少，皮肤干燥松弛出现皱纹。基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase,mmps)是一个大家族，mmps的主要作用是降解真皮中的胶原蛋白及弹性蛋白，mmps分泌增加会加速胶原蛋白的降解，造成皮肤中胶原蛋白流失，皮肤松弛，弹性下降，细纹增多且不断加深，使皮肤呈现出衰老的迹象。取表5分组中的第8组西洋参发酵液按体积比用无血清培养基(dmem培养基)配置成实验所需浓度，并用0.22μm孔径的滤膜过滤。另准确称取维生素c2mg，定容于10ml容量瓶中，再稀释成100μg/ml，作为阳性对照。取对数生长期hff-1细胞，接种于e-plate16培养板中，分别加入不同浓度(50％、25％、12.5％、6.25％、3.12％、1.56％、0.78％、0.39％、0.20％(v/v，以下同)的样品，在rtca仪器上培养24h左右。其中以未处理组作为细胞对照组，每组设2个复孔，置于rtca仪器中，37℃，5％co2环境，再培养24h。结果表明，培养24h，样品浓度为0.20％时对细胞影响最小，细胞生长曲线与未加药细胞生长曲线最为接近。因此选择0.20％、0.10％、0.05％、0.03％、0.01％五个浓度进行抗衰老功效性测试。其中阳性对照中维生素c选择的测试浓度100μg/ml也在安全浓度范围内，符合测试要求。取对数生长期hff-1细胞，接种于96孔板中培养过夜，分别加入不同浓度(0.20％、0.10％、0.05％、0.03％、0.01％，vc(100μg/ml))的样品培养过夜。其中，0.20％、0.10％、0.05％、0.03％、0.01％，vc(100μg/ml)为阳性对照，以未处理组作为细胞空白对照组。每个浓度设置3个复孔。培养24h后，吸取细胞上清液于ep管中，根据elisa试剂盒说明书测定胶原蛋白含量。结果如表3和图1所示。表3测试样品对胶原蛋白含量的影响样品浓度0.20％0.10％0.05％0.03％0.01％vc空白平行13.01263.46123.51303.73484.11233.42662.7645平行23.15673.18623.63953.82873.99213.91052.4108平行32.96313.30283.25813.26114.20163.86212.8356均值3.04413.31673.47023.60824.10203.73312.6703snk分组cbcbcbabd注：应用spss19.0进行统计分析，采用单因素方差分析法分析不同样品间的差异，双侧检验，检验水准α＝0.05，并选用snk法进行多重比较，对不同样品的效用值进行排序。由表3和图1可以看出，阳性对照组(b)的细胞内胶原蛋白的水平明显高于空白组(d)，且与空白组存在显著差异(p<0.05)，说明阳性对照(b)具有促进细胞内胶原蛋白生成的效果。测试样品在浓度为0.01％-0.20％，细胞内胶原蛋白的水平高于空白组，组间存在显著性差异(p<0.05)。由此可说明测试样品在添加浓度为0.01％-0.20％，可有效促进胶原蛋白生成。取对数生长期hff-1细胞，接种于96孔细胞培养板，分别加入不同浓度(0.20％、0.10％、0.05％、0.03％、0.01％，vc(100μg/ml))的样品培养过夜，以未处理组作为细胞空白对照组。每个浓度设置3个复孔。培养24h后，吸取细胞上清液于ep管中，根据elisa试剂盒说明书测定基质金属蛋白酶-1(mmp-1)含量。结果如表4和图2所示。表4测试样品对mmp-1的影响样品浓度0.20％0.10％0.05％0.03％0.01％vc空白平行116.856016.512118.207116.322614.462716.103619.6756平行216.012015.910217.342618.298715.852914.205119.8375平行315.312615.839617.051315.512314.210813.210719.1827均值16.060216.087317.533716.711214.842114.506519.5653snk分组bcbcbbccca由表4和图2可以看出，阳性对照组(c)细胞内mmp-1的水平明显低于空白组(a)，说明阳性对照具有抑制mmp-1的效果，且与空白组存在显著差异(p<0.05)。测试样品浓度为0.01-0.20％，细胞内mmp-1的水平低于空白组(a)，组间存在显著性差异(p<0.05)；多个浓度组与阳性对照(c)效果相当，组间无差异(p>0.05)；由此可说明测试样品在添加浓度为0.01-0.20％时，可有效抑制细胞内mmp-1的活性。通过评估西洋参发酵液对人成纤维细胞(hff-1)中胶原蛋白合成试验和基质金属蛋白酶抑制试验，测试其抗衰老功效，对比发酵菌单用或复配的效用差别，结果分别见表5和表6。其中，在下述测试过程中，分别取各组西洋参发酵液，配制成0.01％的溶液完成测试。表5发酵菌单用和复配对mmp-1的影响表6发酵菌单用和复配对胶原蛋白含量的影响结果表明，植物乳杆菌、肠膜明串珠菌和嗜酸乳杆菌三菌复配发酵产物对hff-1的抗衰老功效最好，优选三菌复配发酵。评价西洋参发酵液对人体皮肤的作用。年龄在25-40的女性15人，左脸使用10wt％西洋参发酵液(表5中第8组西洋参发酵液)做成的精华(经人体斑贴实验说明本品无刺激性)，右脸使用不添加西洋参发酵液的空白精华，配方如表7，早晚各使用一次，使用前和使用10天后分别用visia测试评价，结果11人反馈左脸皮肤情况有改善，表现在减少红血丝，淡化细纹，促进痘痘愈合、减少痘印，轻微淡化色素4个方面。表7精华配方从以上结果可以看出，采用本发明提供的方法得到的西洋参发酵液能够刺激胶原蛋白形成和减少胶原蛋白降解，对红血丝、皱纹、痘痘、色素有改善作用，来源天然，安全性高，无需添加防腐剂，发酵液澄清透明度高，单用即可有效护肤，还可复配护肤领域的其他原料，添加工艺简单，护肤品稳定性高。以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。当前第1页12