一种Zn2+掺杂超小粒径普鲁士蓝纳米探针的制备方法与流程

本发明属于纳米医学领域，具体涉及一种zn²⁺掺杂超小粒径普鲁士蓝纳米探针的制备方法。

背景技术：

近年来，癌症已成为严重威胁人类健康和生命的重大疾病之一。在我国，每年新增患癌人数约占世界新增患癌人数的一半（约800万），且这一数据还在不断增加。如何提高癌症的治疗效率和患癌病人的存活率是当今肿瘤学研究探索的热点。目前癌症治疗的常用手段为手术、化疗和放疗，此三种方法都具有其自身的局限性。肿瘤的手术切除往往会形成较大的创伤面积、术后恢复期长，具有再复发的危险；化疗所使用的化疗药物靶向选择性低，会破坏人体自身免疫系统并形成全身性的毒副作用；放疗则会出现辐射的损伤，且不能完全的杀死癌细胞，治疗效果较差。因此开发一种安全高效的治疗手段，是肿瘤学研究领域亟待解决的关键问题。

光热治疗（photothermaltherapy,ptt）与传统治疗手段相比具有毒副作用低，治疗创伤面积小，安全高效等优点，目前已成为肿瘤新型治疗的一大研究热点。ptt技术通过近红外光（700-1100nm，人体正常组织的血液和水对这一波段的光吸收很低，因此其可抵达人体深层组织）的照射使光热材料急剧产热形成局部高温杀死癌细胞以实现肿瘤治疗的目的。因此开发一种具有低生物毒性、高光热转换效率和高光热稳定性的纳米光热材料是进行光热治疗的前提条件。

普鲁士蓝是一种已被美国食品药品管理局（foodanddrugadministration,fda）批准的可被用于临床放射性治疗的药剂。现已有研究表明普鲁士蓝可以作为光热治疗的试剂应用于肿瘤的光热治疗，与其他光热治疗剂相比较，例如贵金属基纳米材料、碳基纳米材料，普鲁士蓝纳米微粒的生物毒性更低，水溶性更好。此外，由于普鲁士蓝纳米微粒同时含有fe²⁺和fe³⁺，因而其不仅具有磁共振成像造影的功能，还具有抗氧化的功能。

但是，目前已报道的普鲁士蓝纳米微粒的光热转换效率、弛豫率和抗氧化性能都偏低，并且普鲁士蓝纳米微粒的粒径较大（acsnano2016,10,11115-11126;acsappl.mater.interfaces2015,7,11575-11582;），使其在生物医学领域的应用中存在很大局限性。已有研究证明具有小粒径特征的纳米材料在肿瘤治疗过程中可降低巨噬细胞对其的吞噬作用并延长体内的循环时间，此外，还可通过肿瘤组织的高通透性和滞留效应（enhancedpermeabilityandretentioneffect,epr）实现纳米材料的在肿瘤组织的富集与被动靶向治疗（journalofcontrolledrelease,2013,172:782-794）。因此，开发一种具有超小粒径、水溶性好、生物毒性低、光热转换效率高且具有优良的mr成像造影和抗氧化性能的普鲁士蓝纳米探针具有重要的科学意义和广阔的应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种zn²⁺掺杂超小粒径普鲁士蓝纳米探针（zn²⁺dopedultra-smallprussianbluenanoprobe,uspbzn）的制备方法，为解决现有普鲁士蓝纳米微粒制备技术过于复杂以及粒径偏大等不足，在通过改变zn²⁺掺杂浓度实现普鲁士蓝纳米微粒粒径调控的基础上，进一步提高uspbzn纳米探针的mr成像造影性能及其光热/抗氧化协同治疗的效果。

为实现上述目的，本发明具体提供的技术方案为：一种zn²⁺掺杂超小粒径普鲁士蓝纳米探针的制备方法，将铁盐与锌盐按比例混合溶于溶剂中，磁力搅拌至形成均一稳定的溶液a，加热至30～100℃，保温10～60min。

将亚铁氰化钾与有机酸混合溶于溶剂中，磁力搅拌至形成均一稳定的溶液b，加热至30～100℃，保温10～60min；

将溶液a与溶液b混合，持续搅拌并加热至30～100℃，保温反应10～60min。

将a、b溶液混合，持续搅拌并冷却至室温，冷却后进行离心洗涤，用体积比为1:1~1:5的去离子水和无水乙醇混合液洗涤，并在一定温度下保存。

进一步，所述溶液a的配比为铁盐0.05～0.5g/l、锌盐0.05～0.5g/l。

进一步，所述溶液b的配比为亚铁氰化钾0.1～1g/l、有机酸1～10g/l。

进一步，所述合成技术中，样品的离心洗涤的离心速度为10000rpm~50000rpm。

进一步，用去离子水和无水乙醇清洗2～4次，4~25℃保存。

本发明制备方法简单可控，可通过反应温度与所加溶液的比例调控uspbzn纳米探针的形貌与掺杂比例，且通过该技术所得uspbzn纳米探针形貌均一，水溶性好，可在水溶液、各种缓冲液、血清中长期稳定分散。

本发明制备所得uspbzn纳米探针形貌均一、tem表征粒径为5～150nm的立方相晶体。通过改变zn²⁺掺杂浓度实现uspbzn纳米探针的粒径调控。

本发明制备所得的uspbzn纳米探针在500~1100nm波段具有强烈的光吸收现象，因而具有较高的光热转换效率和良好的光热稳定性，在光热治疗中有广阔的应用前景。另外，uspbzn纳米探针良好的光热性能使其能够应用于光声成像。

本发明制备所得的uspbzn纳米探针中含有fe²⁺和fe³⁺，具有较高的弛豫率和良好的mr成像造影性能，可应用于mr的造影成像。

本发明制备所得的uspbzn纳米探针中含有fe²⁺和fe³⁺，在不同的氧化还原环境中，能够实现铁离子在+2价与+3价之间的转变。另外，uspbzn纳米探针的超小粒径使其表面具有更多的铁离子。因此，与传统普鲁士蓝纳米微粒相比，uspbzn具有更好的抗氧化性能，可应用于肿瘤、阿尔兹海默病等疾病的抗氧化治疗。

本发明制备所得的uspbzn纳米探针水溶性、生物相容性好，生物毒性低，在生物医学领域具有广阔的应用前景。

本发明提出的zn²⁺掺杂超小粒径普鲁士蓝纳米探针的制备方法，操作简单，成本低廉；根据这一合成技术制备所得的纳米探针具有优异的光热性能，对近红外光吸收强烈、光热转换效率高、光热稳定性好；通过zn²⁺掺杂易于调控普鲁士蓝纳米探针的粒径，极大扩展了uspbzn纳米探针在生物医学领域的应用领域。uspbzn纳米探针的结构及所具有的功能示意图如图1所示。此外，uspbzn纳米探针更具有mr成像造影性能和抗氧化的功能，是一种具有广阔应用前景的磁共振造影剂、光热治疗及抗氧化治疗药物。

附图说明

图1所示为利用本发明合成的uspbzn纳米探针的结构及所具有的功能示意图；

图2所示为本发明实施例1中普鲁士蓝纳米探针（a）和实施例2中uspbzn（40%）纳米探针（b）的透射电镜图；

图3所示为利用本发明技术制备的uspbzn(10%)纳米探针的可见-近红外吸收光谱；

图4所示为本发明实施例3中不同浓度uspbzn(20%)纳米探针的温升曲线；

图5所示为本发明实施例3中uspbzn(20%)纳米探针的光热转换效率与光热稳定性；

图6所示为利用本发明技术制备的不同浓度uspbzn(30%)纳米探针的r1、r2弛豫率拟合结果及mr成像图；

图7所示为利用本发明技术制备的不同浓度uspbzn(50%)纳米探针的4t1细胞毒性mtt法检测结果。

图8所示为本发明实施例2中uspbzn(40%)纳米探针的4t1细胞光热治疗效果。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。

实施例1不掺杂zn²⁺普鲁士蓝纳米探针的合成

称取3.2mg氯化铁溶于20ml去离子水中，磁力搅拌并加热至60℃，加热5min至溶液为澄清淡黄色液体，将此液体记为溶液a。称取8mg亚铁氰化钾和105mg柠檬酸溶于20ml去离子水中，磁力搅拌并加热至60℃，加热5min至溶液澄清，将此溶液记为溶液b。将溶液b缓慢滴加入溶液a中，并持续磁力搅拌并加热，保持温度为60℃，反应10min。待反应完全后，冷却溶液。12000rpm离心50min，使用去离子水洗涤2次，获得普鲁士蓝纳米探针。普鲁士蓝纳米探针的电镜表征结果如图2（a）所示。

实施例2uspbzn(40%)纳米探针的合成

称取1.9mg氯化铁和1.1mg氯化锌溶于20ml去离子水中，磁力搅拌并加热至60℃，加热5min至溶液为澄清淡黄色液体，将此液体记为溶液a。称取8mg亚铁氰化钾和105mg柠檬酸溶于20ml去离子水中，磁力搅拌并加热至60℃，加热5min至溶液澄清，将此溶液记为溶液b。将溶液b缓慢滴加入溶液a中，并持续磁力搅拌并加热，保持温度为60℃，反应10min。待反应完全后，冷却溶液。12000rpm离心50min，使用去离子水洗涤2次，制备所得uspbzn(40%)纳米探针。uspbzn(40%)纳米探针的电镜表征结果如图2（b）所示。

实施例3uspbzn(20%)纳米探针的合成

称取2.6mg氯化铁和0.8mg硝酸锌溶于20ml去离子水中，磁力搅拌并加热至60℃，加热5min至溶液为澄清淡黄色液体，将此液体记为溶液a。称取8mg亚铁氰化钾和105mg柠檬酸溶于20ml去离子水中，磁力搅拌并加热至60℃，加热5min至溶液澄清，将此溶液记为溶液b。将溶液b缓慢滴加入溶液a中，并持续磁力搅拌并加热，保持温度为60℃，反应10min。待反应完全后，冷却溶液。12000rpm离心50min，使用去离子水洗涤2次，制备所得uspbzn(20%)纳米探针。

纳米探针的可见-近红外吸收光谱

根据本发明技术制备获得uspbzn(10%)纳米探针并分散于去离子水中，利用紫外-可见分光光谱仪扫描获得其在500～1000nm波段的吸收光谱，据图3可得其在近红外光波段具有有较强的吸收，且在710nm处吸收最为强烈。此外，在808nm波长处uspbzn(10%)仍有较强的吸收。由于808nm波长具有更好的生物组织穿透性，在光热治疗中多应用808nm的近红外光作为治疗用光源。因此，uspbzn(10%)可作为光热治疗剂。

纳米探针的温升曲线

将实施例3中所得的pb(zn=20%)纳米探针材料分散溶于去离子水中，制备样品浓度分别为0、186μg/ml、279μg/ml、372μg/ml、558μg/ml、744μg/ml、930μg/ml的六个样品各1.5ml置于石英比色皿内，并应用功率为6w/cm²的808nm波长的激光照射5min。记录其在不同时间点的温度。根据图4可知，随着uspbzn(20%)纳米探针浓度的增大，样品的温升效果越明显。在6w/cm²功率的808nm激光照射下，浓度为930μg/ml的样品溶液升温24℃，由此可知uspbzn(20%)纳米探针具有良好的光热转换性能。

纳米探针的光热转换效率与光热稳定性

将实施例3制备所得的uspbzn(20%)纳米探针分散于去离子水中，取1.5ml于石英比色皿中，使用功率为5w/cm²的808nm激光照射5min，再自然降温至室温；相同条件下再进行激光照射和自然降温，重复5次，并计算获得样品的光热转换效率。根据图5可得uspbzn(20%)具有较高的光热转换效率（图5(a)）和良好的光热稳定性(图5(b))。

纳米探针的弛豫率及mr成像

根据本发明技术制备所得的uspbzn(30%)纳米探针样品分散于去离子水中，配置5个不同浓度的样品，取1.4ml置于1.5ml离心管中。利用mesomr23-060h-i核磁共振成像分析仪测定样品的t1、t2弛豫时间，将1/t1、1/t2与样品浓度进行线性拟合，得到样品的横向和纵向弛豫率。同时设置合适的mr成像参数对样品进行核磁共振成像。如图6所示为不同浓度uspbzn(30%)纳米探针的r1、r2弛豫率拟合结果及mr成像图。

纳米探针的细胞毒性

根据本发明技术制备所得的uspbzn(50%)纳米探针样品进行消毒灭菌，并使用培养液将其配置为0、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml浓度的材料。使用mtt法测定不同浓度样品对4t1细胞的毒性作用。如图7所示为不同浓度样品对4t1细胞的mtt法毒性评估结果。mtt结果显示所得uspbzn(50%)纳米探针的细胞毒性低。

纳米探针的细胞光热治疗

将实施例2中所得的uspbzn(40%)纳米探针样品进行消毒灭菌，并使用培养液将其配置为0、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml浓度的材料。使用mtt法测定不同浓度样品对细胞的光热治疗作用。将1×10⁵个/ml4t1细胞接种到96孔板中，每孔100μl，在37℃，5%co2的条件下培养24h，再在每孔中加入不同浓度的样品100μl，培养4h后，使用功率为1.5w/cm²的808nm激光照射5min，再培养20h，每孔加入10μlmtt，培养4h后，移去孔内溶液，再向每孔加入150μldmso溶液，使用酶标仪测量在490nm波长下每孔的吸光度值，并用细胞活力百分比来表示不同样品的光热治疗效果。图8表明随着uspbzn(40%)纳米探针浓度的增加，4t1细胞的存活率呈现显著降低趋势。

纳米探针应用于临床血清样本中尿酸的检测

取1ml临床血清样本，向其加入0.1ml尿酸酶，将制成的混合液置于37℃，反应30min，生成h2o2；再加入显色剂（如tmb）与0.2ml0.2mg/ml的实施例2中制备所得的uspbzn(40%)纳米探针，置于37℃下孵育30min；uspbzn(40%)催化h2o2生成羟基自由基，羟基自由基再催化tmb显蓝色。利用紫外-可见分光光谱仪测量反应液在650nm处的吸光度值，根据标准曲线计算得到样品中尿酸的浓度。

纳米探针应用于小鼠的mr成像

将实施例2中所得的uspbzn(40%)纳米探针样品分散于pbs中，配置成质量浓度为20mg/ml的分散液，取0.1ml经尾静脉注射至小鼠体内。取不同时间点，利用mesomr23-060h-i核磁共振成像分析仪对小鼠进行磁共振成像。uspbzn(40%)纳米探针具有良好的磁共振成像造影效果。

纳米探针应用于小鼠乳腺癌模型的光热治疗

在小鼠腋窝皮下注入2ⅹ10⁶个4t1细胞，待肿瘤成型后，将利用本发明技术制备所得的uspbzn(30%)纳米探针样品配置为20mg/ml浓度的材料，取100μl样品经尾静脉注射入小鼠体内。或者配置2mg/ml的样品，取50μl直接注射到小鼠肿瘤内部；注射一定时间后使用功率为2w/cm²的808nm激光照射肿瘤部位5min。实施光热治疗完成后，继续饲养一段时间，饲养期间隔天测量小鼠肿瘤体积和体重。肿瘤小鼠模型经光热治疗的实验结果说明uspbzn(30%)纳米探针具有良好的光热治疗效果。

实施例中具体参数值只是在本发明合适参数范围内的一个举例，并不能理解为是对本发明可实施范围的界定与限制。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

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