一种低强度聚焦超声响应型相变溶栓纳米粒、应用及其制备方法与流程

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及了一种低强度聚焦超声响应型相变溶栓纳米粒、应用及其制备方法。

背景技术：

血栓是血流在心血管系统血管内面剥落处或修补处的表面所形成的小块。在可变的流体依赖型(variableflowdependentpatterns)中，血栓由不溶性纤维蛋白、沉积的血小板、积聚的白细胞和陷入的红细胞组成。

血栓形成是急性缺血性心血管疾病的主要发病机制，是引起不稳定性心绞痛，心肌梗死和中风的主要原因。长期以来，由于重组组织纤溶酶原激活剂(rtpa)可以激活纤溶酶原，进而溶解血栓，是溶栓领域的常用药，因此血栓形成患者主要采用重组组织纤溶酶原激活剂(rtpa)治疗，该治疗最好在疾病发生4.5小时以内进行静脉输注。超过这个时间段后，即使采用动脉内给药的方式，也只能将时间窗扩大到6小时，对于不能及时进行溶栓治疗的患者，不能达到缓解或者根治的效果。此外重组组织纤溶酶原激活剂(rtpa)潜在的缺血再灌注损伤，血脑屏障的破坏都会导致危及生命的症状性颅内出血及神经毒性等副作用。因此，设计一种价格低廉、局部给药、剂量可控并有效的治疗方式是解决该问题的措施。

迄今为止，已报道了很多通过对给药系统的优化以提高重组组织纤溶酶原激活剂(rtpa)的治疗效果的研究，最常见的是纳米粒载药的方式，例如应用磁性马达、脂质体、合成的高分子聚合物装载重组组织纤溶酶原激活剂(rtpa)以达到提高治疗效果并减少副作用的目的。但是不管药物是包裹在纳米粒内部还是外部，药物的装载量都会受到载药系统容量的限制，并且在制备此类纳米粒的过程中也有导致药物失活的可能性，最终导致治疗效果不佳。此外，还有报道通过超声、交变磁场、激光等手段进行溶栓治疗的研究，但是这类非药物溶栓方式并不能达到很好地溶栓效果，而且还容易对正常组织造成损害，产生副作用。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一种低强度聚焦超声响应型相变溶栓纳米粒，以解决现有技术中载药纳米粒因载药量受限或者药物失活而造成溶栓效果不佳的问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种低强度聚焦超声响应型相变溶栓纳米粒，包括壳体聚乳酸-羟基乙酸共聚物plga，所述壳体上嵌入有四氧化三铁fe3o4，所述壳体内包裹有全氟己烷pfh，所述壳体上连接有用于靶向纤维蛋白的creka多肽。

进一步，外形呈球形，粒径为311.3±4.3nm，分散性为0.094±0.048。

进一步，zeta电位为1.19±0.45mv。

进一步，creka多肽连接率为98.72±1.03％。

进一步，载铁量为73.43±4.71％。

本发明提供的低强度聚焦超声响应型相变溶栓纳米粒，即fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒，利用聚乳酸-羟基乙酸共聚物plga作为载体，plga是一种可降解的功能高分子有机化合物，具有良好的生物相容性、无毒、良好的成囊和成膜的性能，从而使该纳米粒具有良好的生物相容性，也提高了纳米粒的生物安全性。

通过在壳体plga上嵌入四氧化三铁fe3o4，利用四氧化三铁fe3o4使fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒能够进行磁共振和光声显像，在进行溶栓实验时能够准确地定位到该纳米粒，以便于观察其溶栓效果，即便于监测该纳米粒的位置。

通过在壳体内包裹全氟己烷pfh，利用全氟己烷pfh在液态时具有良好的稳定性，当pfh被包裹入该纳米粒中后，在低功率聚焦超声lifu的辐照下能够发生液-气相变，pfh体积增大，使纳米粒内部压强增大，当增大到一定值时能够使纳米粒爆破；因此利用这一变化过程，在纳米粒到达血栓处时，通过低功率聚焦超声lifu在组织外部进行辐照，使纳米粒其内的pfh发生液-气相变，从而在血栓处爆破，实现溶栓，避免了现有技术中载药类纳米粒因受限于载药系统容量、药物失活等因素而造成溶栓效果下降的问题。

通过在壳体外表面上连接creka多肽(creka多肽是指半胱氨酸-精氨酸-谷氨酸-赖氨酸-丙氨酸五肽)，利用creka多肽具有纤维蛋白靶向的性质，使该纳米粒具有纤维蛋白靶向性，由于血栓中包括不溶性的纤维蛋白，因此纳米粒能够准确地靶向到血栓，从而提高溶栓的效率和效果，避免了对正常组织造成损害。

综上，本发明的fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒具有良好的生物相容性、无毒，具有较高的安全性，在临床上具有应用价值。该纳米粒具有靶向特异性，能够精确靶向到血栓部位，并能够联合低强度聚焦超声达到优良的溶栓效果，为后续体内溶栓治疗提供了实验基础和理论依据。此外，由于该纳米粒无需载药即可达到良好的溶栓效果，不仅能够避免了因载药量受限或药物失活而造成的溶栓效果下降问题，还能够避免因使用药物而产生的副作用，从而进一步提高了本纳米粒的生物安全性，为其后期在临床上的使用提供了更多的可能性。

本发明的目的之二是提供一种低强度聚焦超声响应型相变溶栓纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备fe3o4-plga-pfh纳米粒

称取plga溶于二氯甲烷中，并加入pfh及油酸修饰的fe3o4溶液，采用超声波破碎仪进行乳化；再加入pva溶液，继续乳化，加入异丙醇溶液在冰浴条件下磁力搅拌；离心洗涤后，即可制备得到fe3o4-plga-pfh纳米粒；

(2)制备fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒

将步骤(1)中制备得到的fe3o4-plga-pfh纳米粒溶于mes缓冲液中，再向其中先加入edc和nhs，然后混合液在冰浴条件下摇晃孵育；离心洗涤后，再加入mes缓冲液和creka多肽继续在冰浴条件下进行反应，即可制备得到fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒。

本发明提供的低强度聚焦超声响应型相变溶栓纳米粒的制备方法，以plga、pfh及fe3o4为原料，采用双乳化法制备fe3o4-plga-pfh纳米粒，然后再通过碳二亚胺法制备fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒。该制备方法条件温和，操作简单，能够快速、成功地制备出大小均一、形态规则、分散性好、性质稳定的靶向相变fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒。该纳米粒具有良好的生物相容性，通过creka多肽对血栓具有良好的靶向能力，联合低强度聚焦超声对血栓具有良好的溶解能力。

本发明的目的之三是提供一种低强度聚焦超声响应型相变溶栓纳米粒在用于制备治疗血栓药物上的应用。

利用纳米粒上creka多肽与血栓中纤维蛋白进行特异性结合，使该纳米粒能够更好地靶向血栓，从而使纳米粒能够充分地聚集在血栓部位，增强溶栓治疗的效果。通过pfh在低强度聚焦超声作用下发生液-气相变，引起纳米粒爆破，而实现溶栓作用，从而达到治疗血栓的效果。

附图说明

图1为本发明实施例中纳米粒fe3o4-plga-pfh-creka的结构示意图；

图2为本发明实施例中纳米粒fe3o4-plga-pfh-creka和plga-pfh-creka的透射电镜图；

图3为本发明实施例中纳米粒fe3o4-plga-pfh-creka、plga-pfh-creka、fe3o4-plga-creka和fe3o4-plga-pfh的粒径分布图；

图4为本发明实施例中纳米粒fe3o4-plga-pfh-creka、plga-pfh-creka、fe3o4-plga-creka和fe3o4-plga-pfh的粒径大小比较图；

图5为本发明实施例中纳米粒fe3o4-plga-pfh-creka、plga-pfh-creka、fe3o4-plga-creka和fe3o4-plga-pfh的zeta电位比较图；图6为本发明实施例中纳米粒fe3o4-plga-pfh-creka的元素分析线扫统计图；

图7为本发明实施例中纳米粒fe3o4-plga-pfh-creka的高分辨透射电镜图、相应的fe元素图、f元素图以及二者合并图；

图8为本发明实施例中纳米粒fe3o4-plga-pfh-creka、fe3o4-plga-creka和fe3o4-plga-pfh的载铁量比较图；

图9为本发明实施例中纳米粒fe3o4-plga-pfh-creka酶解实验前后的倒置荧光显微镜图；

图10为本发明实施例中纳米粒fe3o4-plga-pfh-creka与fe3o4-plga-pfh在不同浓度下的信号强度图；

图11为图10对应的r2*统计图；

图12为本发明实施例中纳米粒fe3o4-plga-pfh-creka在不同浓度下的伪彩图；

图13为图12对应的灰度图；

图14为本发明实施例中纳米粒fe3o4-plga-pfh-creka在不同浓度下的光声显像图；

图15为本发明实施例中纳米粒fe3o4-plga-pfh-creka的全波长扫描机光声图；

图16为图15对应的光声信号强度统计图；

图17为本发明实施例中纳米粒fe3o4-plga-pfh-creka与fe3o4-plga-creka在lifu辐照后相应的b模式和造影模式图；

图18为本发明实施例中纳米粒fe3o4-plga-pfh-creka与fe3o4-plga-creka在lifu辐照后不同时间点b模式及造影模式的定量分析图；

图19为本发明实施例中实验组与对照组的体外靶向性检测图；

图20为本发明实施例中实验组与对照组的体内靶向性检测图；

图21血凝块与纳米粒fe3o4-plga-pfh-creka、fe3o4-plga-creka溶液在lifu辐照2h后的病理切片染色图；

图22实验组与对照组的血凝块在声功率1w/cm²的lifu辐照2h之间的体积变化图；

图23为本发明实施例中实验组与对照组的血凝块最终重量的比较图；

图24为本发明实施例中实验组与对照组的血凝块最终溶栓率的比较图；

图25为本发明实施例中实验组与对照组的血凝块在声功率1w/cm²的lifu辐照2h之间的重量变化图；

图26为本发明实施例中实验组与对照组的血凝块在声功率3w/cm²的lifu辐照2h之间的重量变化图；

图27为本发明实施例中实验组与对照组的血凝块在声功率8w/cm²的lifu辐照2h之间的重量变化图；

图28为本发明实施例中实验组与对照组的血凝块在声功率1w/cm²的lifu辐照2h之间的溶栓率变化图；

图29为本发明实施例中实验组与对照组的血凝块在声功率3w/cm²的lifu辐照2h之间的溶栓率变化图；

图30为本发明实施例中实验组与对照组的血凝块在声功率8w/cm²的lifu辐照2h之间的溶栓率变化图；

图31为本发明实施例中聚焦超声lifu辐照的安全性检测图。

图32为本发明实施例中纳米粒fe3o4-plga-pfh-creka的溶栓过程示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明：

一、本发明的低强度聚焦超声响应型相变溶栓纳米粒的制备方法，具体步骤如下：

(1)制备fe3o4-plga-pfh纳米粒

称取50mgplga溶于2ml二氯甲烷中，并加入0.2mlpfh及油酸修饰的fe3o4溶液，采用超声波破碎仪乳化60s，再加入5ml浓度为4％的pva溶液，继续乳化60s，加入10ml浓度为2％的异丙醇溶液在冰浴条件下磁力搅拌3h。离心洗涤后，即可制备得到fe3o4-plga-pfh纳米粒。

(2)制备fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒

将步骤(1)中制备得到的fe3o4-plga-pfh纳米粒溶于ph5.2、0.1mmes缓冲液，适量的edc和nhs按2:1的摩尔比例进行添加，用以活化fe3o4-plga-pfh纳米粒表面的羧基端，混合液在冰浴条件下摇晃孵育3h，然后离心洗涤3次，加入ph8、0.1mmes缓冲液和5mgcreka多肽继续在冰浴条件下反应12h，即可制备得到fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒。

(3)制备plga-pfh纳米粒

称取50mgplga溶于2ml二氯甲烷中，并加入0.2mlpfh，采用超声波破碎仪乳化60s，再加入5ml浓度为4％的pva溶液，继续乳化60s，加入10ml浓度为2％的异丙醇溶液在冰浴条件下磁力搅拌3h。离心洗涤后，即可制备得到plga-pfh纳米粒。

(4)制备plga-pfh-creka纳米粒

将步骤(3)中制备得到的plga-pfh纳米粒溶于ph5.2、0.1mmes缓冲液，适量的edc和nhs按2:1的摩尔比例进行添加，用以活化fe3o4-plga-pfh纳米粒表面的羧基端，混合液在冰浴条件下摇晃孵育3h，然后离心洗涤3次，加入ph8、0.1mmes缓冲液和5mgcreka多肽继续在冰浴条件下反应12h，即可制备得到plga-pfh-creka纳米粒。

(5)制备fe3o4-plga纳米粒

称取50mgplga溶于2ml二氯甲烷中，并加入0.2ml油酸修饰的fe3o4溶液及0.2ml双蒸水，采用超声波破碎仪乳化60s，再加入5ml浓度为4％的pva溶液，继续乳化60s，加入10ml浓度为2％的异丙醇溶液，在冰浴条件下磁力搅拌3h，离心洗涤后，即可制备得到fe3o4-plga纳米粒。

(6)制备fe3o4-plga-creka纳米粒

将步骤(5)中制备得到的fe3o4-plga纳米粒溶于ph5.2、0.1mmes缓冲液，适量的edc和nhs按2:1的摩尔比例进行添加，用以活化fe3o4-plga-pfh纳米粒表面的羧基端，混合液在冰浴条件下摇晃孵育3h，然后离心洗涤3次，加入ph8、0.1mmes缓冲液和5mgcreka多肽继续在冰浴条件下反应12h，即可制备得到fe3o4-plga-creka纳米粒。

如图1所示，所制得的本发明的低强度聚焦超声响应型相变溶栓纳米粒，即为fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒，包括壳体聚乳酸-羟基乙酸共聚物plga，壳体上嵌入有四氧化三铁fe3o4，壳体内包裹有全氟己烷pfh，壳体上通过酰胺键连接有用于靶向纤维蛋白的creka多肽。

二、fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒的一般特性

1、检测fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒的结构

(1)采用透射电子显微镜观察fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒和plga-pfh-creka纳米粒的表面形态和结构特点。

(2)采用马尔文粒径分析仪检测fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒、plga-pfh-creka纳米粒、fe3o4-plga-pfh纳米粒及fe3o4-plga-creka纳米粒的粒径大小、分散性及zeta电位。

检测结果：

(1)如图2所示(标尺：大视野1μm；小视野200nm)，透射电子显微镜检测到fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒和plga-pfh-creka纳米粒的外形均呈球形，大小均一，形态规则，分散性好，能够说明两者均具有良好的生物稳定性。但两者表面形态又有所不同，前者可见到纳米粒表面的fe3o4均匀地分布(图2中左侧)，而对比后者，没有嵌入fe3o4的纳米粒表面是光滑的(图2中右侧)。

(2)如图3至图5所示，马尔文粒径分析仪检测到fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒、plga-pfh-creka纳米粒、fe3o4-plga-pfh纳米粒及fe3o4-plga-creka纳米粒的粒径大小分别为311.3±4.3nm、292.8±5.8nm、299.7±5.5nm及306.4±4.6nm，其分散性分别为0.094±0.048、0.084±0.025、0.07±0.014及0.087±0.025，其zeta电位分别为1.19±0.45、1.6±0.69、-6.09±0.94及1.24±0.77。

从测得的数据可知，在连接creka多肽后fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒的粒径并没有受到明显的影响。比较上述四种纳米粒的平均粒径，证明在连接fe3o4后纳米粒的粒径会稍大一些，证明10nm的四氧化三铁颗粒对纳米粒的粒径有一定的影响。

2、检测fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒中的铁元素和氟元素

(1)采用元素地图和透射电子显微镜检测分析fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒中铁元素和氟元素的分布情况。

(2)采用原子吸收光谱检测fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒、fe3o4-plga-pfh纳米粒及fe3o4-plga-creka纳米粒的载铁量。

检测结果：

(1)如图6所示，元素分析的线扫结果显示，fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒中铁元素的每秒计数相对高于氟元素的每秒计数，我们推测在纳米粒内部的元素信号还是会受到壳体plga的影响。通过高分辨率的透射电镜图像检测到fe3o4在纳米粒壳体plga球表面的均匀分布，如图7所示(标尺：200nm)，元素地图分析显示铁元素图可以重叠在氟元素图的表面，进一步说明氟元素位于纳米粒的内部，铁元素位于纳米粒的外部。

(2)如图8所示，原子吸收光谱测得fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒、fe3o4-plga-pfh纳米粒及fe3o4-plga-creka纳米粒的载铁量分别为73.43±4.71％、75.39±5.85％及71.65±6.92％。上述三组纳米粒载铁量的定量分析并没有统计学意义，说明纳米粒中壳体plga内部所装载的材料和是否连接creka多肽并不会对载铁量产生影响。

3、检测fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒中creka多肽的连接情况

将fitc标记的creka多肽连接在dii染色的fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒表面，用羧肽酶b分解fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒中的creka多肽，再使用倒置荧光显微镜检测分解前后的fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒，并应用流式细胞仪半定量分析其上creka多肽的连接率。

检测结果：

如图9所示(标尺：5μm)，倒置荧光显微镜检测显示，用羧肽酶b溶解creka多肽前，fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒表面上可见绿色荧光，证明fitc标记的creka多肽已经成功连接在fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒表面。通过流式细胞仪分析测得fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒上creka多肽连接率为98.72±1.03％，具有极高的连接率，提高了fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒的靶向能力。实验发现，当连接了creka多肽后，负性的zeta电位极性会稍减少(如图5所示)，这也进一步证明了纳米粒上已经成功连接creka多肽。用羧肽酶b溶解creka多肽后，fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒表面上几乎没有出现绿色荧光，由此证明creka多肽是连接在fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒的外部。

三、fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒的体外多模态显像、体内外靶向性实验

1、fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒的体外多模态显像

(1)按照铁的浓度，分别配置含有0，0.0821，0.1643，0.3285，0.6571，1.3143，2.6286mmplga的fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒和fe3o4-plga-pfh纳米粒，使用1.5t磁共振的t2*wi进行扫描。

检测结果：

如图10所示，不同浓度的fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒的t2*图像显示，随着纳米粒浓度的升高，mr信号逐渐下降，说明fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒表面可以产生一个高的梯度磁场。通过计算fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒的弛豫率拟合线斜率，如图11所示，可得到一个数据值为50.98mm^-1s^-1，根据前人的研究结果可知这个弛豫率是可以成像的。mr图片的伪彩图(如图12所示)是灰度图(如图13所示)的一个显示，同时也证明了mr信号的均匀性。基于mr显像结果，证明fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒具有对血栓性疾病的诊断潜力。

(2)按照铁的浓度，分别配置含有0.1643，0.3285，0.6571，1.3143，2.6286mmplga的纳米粒进行光声显像。

检测结果：如图14所示为不同浓度下的fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒的光声图像。如图15所示为fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒的全波长扫描机光声值，从图中可知，680nm是该纳米粒最佳的激发波长。如图16所示，随着fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒浓度的增加，光声信号呈一个线性相关的趋势(r²＝0.9958)。

(3)另外，采用lifu辐照对fe3o4-plga-creka纳米粒和fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒进行超声造影成像，分别采集辐照前及辐照10min、20min、30min、40min、50min、60min的超声图像。

检测结果：

由于载有pfh的纳米粒在从液态到气态的过程中可以产生超声造影信号(ceus)。因此，因此本发明研究了fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒和fe3o4-plga-creka纳米粒的体外信号。如图17所示，实验研究发现，载有pfh的fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒在用lifu辐照之后的b模式(b-mode)和造影模式(ceus)的信号明显增强，而载有双蒸水的对照组fe3o4-plga-creka纳米粒在此过程中并没有明显的改变。如图18所示，通过后处理软件对信号强度的半定量分析发现，在此过程中fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒的b模式信号和造影信号分别比lifu辐照前增加到了12和6.6倍。因此，可以证明fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒多模态成像的可行性。

2、fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒的体内外靶向性实验

(1)体外靶向性实验

用真空采血管抽取新西兰大白兔耳缘动脉的血液，并放置于水浴锅中4h后取出切成大小约1×0.3×0.3cm的立方体，大约重300mg，待放置于37℃水浴锅4h后，使用pbs冲洗并制作成冰冻切片，为保持原始形态，切片使用冷丙酮固定10min。pbs冲洗后分别与fe3o4-plga/dii-pfh-creka纳米粒(实验组)、fe3o4-plga/dii-pfhnps纳米粒(对照组)在37℃孵育2h。2h后pbs冲洗并使用倒置荧光显微镜观察。

检测结果：

如图19所示，可以观察到实验组的荧光强度明显强于对照组，说明fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒具有更好的体外靶向能力。

(2)体内靶向性实验

sd大鼠(雌性；10-12周龄；280-320g体重)使用戊巴比妥钠麻醉，暴露出腹主动脉，采用alexa488标记的纤维蛋白原进行尾静脉注射，同时，用10％fecl3浸湿的滤纸包裹住游离的腹主动脉，4min后取出滤纸并用生理盐水冲洗。将上述sd大鼠分成两组，其中一组注射1ml、1mg/ml的fe3o4-plga/dii-pfh-creka纳米粒溶液(实验组)，另一组注射1ml、1mg/ml的fe3o4-plga/dii-pfh纳米粒溶液(对照组)。待循环3h后，取出两组sd大鼠的该段腹主动脉，使用oct包埋剂包埋，制作成冰冻切片，通过荧光显微镜观察。

检测结果：

如图20所示，实验组中，可以观察到红色荧光标记的fe3o4-plga/dii-pfh-creka纳米粒与绿色荧光基本一致，alexa488标记的纤维蛋白原在建模后变为纤维蛋白，而对照组中，fe3o4-plga/dii-pfh纳米粒的红色荧光分布不能和绿色荧光的纤维蛋白重合。因此，可以说明携带有creka的fe3o4-plga/dii-pfh-creka纳米粒具有良好的靶向能力。

四、fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒的低强度聚焦超声lifu响应的体外溶栓及其辐射安全性实验

1、fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒的低强度聚焦超声lifu响应的体外溶栓

用真空采血管抽取新西兰大白兔耳缘动脉的血液，并放置于水浴锅中4h后取出切成大小约1×0.3×0.3cm的立方体，大约重300mg，用pbs冲洗后置于自制的凝胶模块中。设置对照试验，实验组(相变溶栓组pt)：将上述模块加入25ml浓度为2mg/ml的fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒的溶液中，对照组(非相变溶栓组npt)：将上述模块加入25ml浓度为2mg/ml的fe3o4-plga-creka纳米粒的溶液中，实验组和对照组的模块下方均放置低强度聚焦超声lifu探头进行辐照，并分别选择1、3、8w/cm²的声功率进行2h辐照，观察并检测实验组和对照组中血凝块的重量和体积变化。

检测结果：

(1)如图21所示(标尺：200μm)，聚焦超声lifu辐照2h后，对照组(图19中左侧npt部分)血凝块边缘无明显变化，而实验组(图19中右侧pt部分)血凝块边缘却可以见到小孔，这些小孔的直径较大的有300微米，证明在液态向气态转变过程中，fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒有数百倍的变化，这也证实在相变fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒膨胀到极限时，最后一瞬间的爆炸可通过碎片和液体产生强大的剪切应力和微射流，这两者相互配合共同毁掉血栓并暴露其内部结构。另外，通过来自lifu的声孔效应和空化作用，可以进一步协助相变fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒进入血栓并提高溶栓效果。

(2)如图22所示，实验组血凝块的体积明显比对照组小，尤其是在第1小时的四个时间点。此外，实验组血凝块表面白色斑块的分布面积会随着时间的增加而增多，在30倍放大的图片上同样可以观察到机械爆破的效果，这也证明相变fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒可以提高溶栓效果。

(3)在实验组和对照组中，治疗前总血栓负荷在6个亚组之间没有统计学差异(f＝1.092，p＝0.385)，但治疗后，实验组的总血栓负荷低于对照组(如图23所示)，实验组的溶栓率小于对照组(如图22所示)。单因素方差分析的应用表明治疗组之间在总血栓负荷和溶栓率方面存在统计差异(df＝5，p＝0.0001)，随后的bonferroni事后统计检验表明三者之间存在统计学差异。治疗组之间的所有三个对亚组两两比较对于总血栓负荷或血栓溶解率均具有统计学显著性(p<0.0001)。

在溶栓过程的2小时监测期间，如图25至图27所示，两组的血栓负荷在15分钟后显著改变。如图28至图30所示，尽管两组在最初的15分钟内都显示出最高的溶解速度，但实验组的溶解率仍高于对照组(p<0.05)。具体而言，在对照组最后的30分钟，血栓重量没有显着下降(p<0.05)，表明实验组的后遗效应作用延长，即使不是那么明显。在对照组开始lifu照射后0至30分钟，发生溶栓效应约60％，实验组首次溶栓效应为50％，只有8w/cm²组才能达到60％。实验发现，在对照组中，溶栓率随着声功率的增加而增加，而这种现象仅在实验组的前15分钟内被发现。因此，我们认为fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒通过高声功率更快地相变，然而，随着时间的推移，大多数fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒在到达目的地之前就发生了相变，因此达到血凝块的fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒只是爆破过程产生的碎片而已。

虽然初始溶栓率在低声功率下不是很高，但有更多fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒达到目标区域，最终导致更好的溶栓效应，这表明1w/cm²的声功率已经可以引起fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒发生相变。由此可见，相变有助于提高溶解效率并避免因其高声功率而产生的不必要的不良反应，这与传统的超声波溶栓或微泡介导的血液溶栓不同，此类溶栓方法的效果直接取决于声功率的增加或与药物的相互协作，本发明提供的fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒在较低功率的触发下相变溶栓能够避免对正常组织造成损害问题。2、fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒的低强度聚焦超声lifu的辐射安全性实验

sd大鼠分为4组，其中3组分别用声功率为1、3、8w/cm²的聚焦超声lifu辐照腹主动脉1h，最后一组作为空白对照组不进行辐照；然后取出各组辐照处及空白对照组的相应的血管，进行石蜡包埋，并通过h&e染色、弹力纤维染色、网状纤维染色、凋亡染色观察各组血管的损伤情况。

检测结果：

如图31所示，除了高声功率辐照组(8w/cm²，图中箭头所指处血管内膜有损伤)外，其他三组的血管壁未见明显损伤，因此，可以说明采用功率为1w/cm²、3w/cm²的聚焦超声lifu辐照血栓部位引发纳米粒的响应是安全的。前述的体外溶栓实验也证实，1w/cm²已经可以达到一个良好的治疗效果，这种低功率的触发，既能够使本发明的fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒达到更好的溶栓效果，又能够避免lifu辐照下的溶栓方式存在的潜在不良反应和副作用。综上所述，本发明的fe3o4-plga-pfh-creka纳米粒的溶栓过程大致如下(如图32所示)：通过在壳体外表面上连接creka多肽使纳米粒靶向到血栓部位，然后在低功率聚焦超声lifu的辐照下纳米粒中的pfh发生液-气相变，pfh体积增大，使纳米粒内部压强增大，当增大到一定值时能够使纳米粒爆破。纳米粒爆破时释放的能量使束缚血红细胞的纤维蛋白断裂，从而破坏血栓，实现溶栓。