一种体外控释药物及其制备方法与流程

本发明涉及一种体外控释药物靶向释放技术，具体涉及一种红外激光体外控释药物。

背景技术：

化学药物治疗已成为治疗人类疾病的重要途经。但目前市面上绝大多数药物，靶向性不佳,目标器官蓄积能力较差,使得治疗效果不尽如人意。如何高效地将治疗药物递送入目标器官,提高药物在治疗部位的浓度,降低其在正常组织中的浓度,成为制药领域研究的热点。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺陷，提供一种能够有效进行体外控制药物靶向释放的体系。

为了达到上述目的，本发明提供了一种体外控释药物，该体外控释药物采用红细胞为载体，其内包载有目标药物及红外荧光染料。

其中，目标药物可采用抗肿瘤药物；红外荧光染料优选采用icg(吲哚菁绿)。

目标药物优选dox(阿霉素)；红细胞内包载dox的药物包载量为345.0-780.0mg/10¹⁰红细胞；所述红细胞内包载icg的染料包载量为22.0-38.0mg/10¹⁰红细胞。

本发明还提供了上述体外控释药物的制备方法，包括以下步骤：

(1)红细胞采集；

(2)采用低渗-重封闭法进行红细胞包载dox；

(3)将包载有dox的红细胞进行icg包载。

其中，步骤(2)中红细胞包载dox的具体过程如下：

a、制备红细胞悬浮液和dox溶液：采用ph值为7.4的pbs溶液制备50％v/v红细胞悬浮液，备用；将dox溶解于ph值为7.2-7.4的pbs溶液，制备得到dox溶液备用，其中dox浓度为1mg/ml；

b、低渗：将红细胞悬浮液重悬于dox溶液中，红细胞悬浮液与dox溶液的体积比为1:1-4；然后将混合后的悬浮液置于截留分子量为14kda的透析袋中，并在4℃下与低渗缓冲液放置4-12h；所述低渗缓冲液中含有：15mmnah2po4·2h2o，15mmnahco3，2mmatp，3mm还原型谷胱甘肽，20mm葡萄糖，5mmnacl，72mosm/kg，ph8；

c、高渗：将透析袋转移到50ml的再密封缓冲液中在37℃下放置30分钟；所述再密封缓冲液中含有：250mmnacl，12.5mm葡萄糖，12.5mm丙酮酸钠，12.5mm肌苷，12.5mmnah2po4·2h2o，0.63mm腺嘌呤，550mosm/kg，ph8；

d、等渗：在pbs缓冲液中洗涤两次以除去未包封的dox，获得包载dox的红细胞溶液，其中红细胞的体积浓度为10¹⁰-10¹³/ml。

步骤(3)中进行icg包载的具体过程如下：将包载有dox药物的红细胞溶液与icg溶液混合在pbs溶液中，超声5min，采用pbs溶液清洗未成功包载的icg，即得所述体外控释药物；所述icg溶液中icg的浓度为0.5mg/ml，icg溶液与包载有dox药物的红细胞溶液的比例为1：2-5。

本发明相比现有技术具有以下优点：

1、体外红外激光控制“靶向”释放：治疗药物释放实现体外控制释放，在体外采用激光器(808nm，0.1w-2.0w)对目标部位进行照射，从而实现控制药物释放的时间、部位及量，是治疗药物靶向释放到目标器官，提高肿瘤治疗效果，减少毒副作用研究成功的关键之一；

2、高载药量：利用天然良好载体——红细胞，实现治疗药物的高包载率，结合靶向释放，能够减少毒副作用的同时提高药物治疗效果；

3、良好的生物兼容性：克服了药物在体内弥散分布造成的对目标器官的伤害，也减少了药物被血液清除率的量，都是利用自身红细胞实现良好生物兼容性。

附图说明

图1为本发明体外控释药物的制备流程图；

图2为本发明体外控释药物的tem表征图；

图3为本发明体外控释药物的靶向释放工作原理图；

图4为本发明体外控释药物在激光照射前后的对比图；

图5为本发明体外控释药物在激光照射前后的红细胞形态对比图；

图6为本发明体外控释药物随着激光照射时间变化，药物释放率变化曲线；

图7为本发明体外控释药物与dox单独给药应用于肿瘤靶向给药的对比示意图；

图4中，a为激光照射前，b为激光照射后；

图5中，off为激光照射前，on为激光照射后；

图7中，a为动物给药示意图，b为激光照射不同时间的活体成像对比图，c为体内器官聚集的活体成像对比图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进行详细说明。

如图1所示，本发明红外激光体外控释药物的具体制备过程如下：

1.红细胞包载目标药物

1.1红细胞采集

从sd大鼠心脏采集新鲜血液，并收集到抗凝管中。1200rpm离心10分钟，用pbs-7.4洗涤三次，去除红细胞以外的细胞。用pbs-7.4制备50％v/v细胞悬浮液并储存直至使用。

1.2红细胞低渗-重封闭法包载目标药物

将目标药物溶解与pbs，ph至7.2-7.4，本例中采用dox，配制溶液浓度为1mg/ml。使用低渗-重封闭法进行红细胞包载胰岛素。过程如下：

(1)低渗：将红细胞重悬于dox溶液中，红细胞与dox溶液的体积比为1:1，将所得悬浮液置于透析袋(14kda)中，并在4℃下与低渗缓冲液(15mmnah2po4·2h2o，15mmnahco3，2mmatp，3mm还原型谷胱甘肽，20mm葡萄糖，5mmnacl，72mosm/kg，ph8)，放置8h。

(2)高渗：将透析袋转移到50ml的再密封缓冲液(250mmnacl，12.5mm葡萄糖，12.5mm丙酮酸钠，12.5mm肌苷，12.5mmnah2po4·2h2o，0.63mm腺嘌呤，550mosm/kg，ph8)在37℃下30分钟。

(3)等渗：在pbs缓冲液中洗涤两次以除去未包封的dox，获得包载dox的红细胞溶液，其中红细胞的浓度为10¹²/ml。

2.红细胞包载icg

将包载dox的红细胞与icg溶液(pbs为溶剂，浓度为0.5mg/ml)混合(混合体积比1：5)在pbs溶液中，超声5min，pbs清洗未成功修饰的icg，即得到dox-icg-er。

对红细胞的载药量进行测定，其中dox的包载量为547.7mg/10¹⁰红细胞；所述红细胞内包载icg的染料包载量为29.2mg/10¹⁰红细胞。

3.靶向释放研究

(1)采用激光共聚焦显微镜观察激光器(808nm，1w/分钟)照射2分钟后，溶液中icg荧光的变化及红细胞的形态变化。

(2)激光器(808nm，1w/分钟)照射不同时间，溶液中h2o2浓度的变化(3)激光器(808nm，1w/分钟)照射不同时间，目标药物(本次以dox为研究对象)的释放情况。

4.动物试验

(1)肿瘤模型的建立：健康balb/c裸鼠10只，雌雄不限，4～6周龄，体重20～25g，无菌环境下饲养，由南通大学动物中心提供。hela细胞用rpmi1640培养液培养。细胞铺满瓶底80％以上时，以0.25％胰蛋白酶-0.02％edta消化细胞1min，用含10％小牛血清的rpmi1640培养液吹打分散细胞，1000r/min离心5min，离心半径为5cm。弃上清，以pbs调整细胞数量，2×106/0.2ml，将细胞接种于裸鼠臀部皮下,10d后肿瘤逐渐长出。

(2)荷瘤动物活体成像：将荷瘤小鼠分为2组，每组5只，分别经尾静脉注射dox-icg-er和游离icg染料(icg剂量为5μg)，注射后间隔不同时间(5min，30min，60min)对2组动物进行活体成像。6h后将动物人道处死，取心、肝、肺、肾及肿瘤进行离体成像。

4.结果：

4.1实验设计示意图

如图1所示为红细胞载药及icg的制备过程。

如图2所示为dox-icg-er的tem表征图，包载药物后，红细胞能够保持其双凹圆盘结构。

如图3所示dox-icg-er体外控制释放示意图。在体外采用激光808nm进行照射，icg被激发会产生h2o2，红细胞内的h2o2增高，导致红细胞膜上孔道打开，释放药物。

4.2体外试验结果

在体外模拟控制释放情况，如图4、5所示。

如图4所示，激光照射前，icg均在红细胞内部，激光照射后，icg导致红细胞破裂。

如图5所示，激光照射前，单个红细胞状态，呈现双凹圆盘形，激光照射后，红细胞表面孔道打开，内部的药物及icg均释放出来。

如图6所示，激光照射与药物释放的关系：随着激光照射时间的增加，药物释放率逐渐增大。

4.3动物试验

将荷瘤小鼠分成2组，对照组注射dox，药物组注射本发明icg-er包载dox的dox-icg-er。

结果如图7所示：图a给药示意图；图b5min，30min，60min的活体成像图，在肿瘤部位激光照射5min，dox-icg-er能够在肿瘤部位聚集。图c6h后，人道主义处死动物，取出动物的重要脏器，成像。可以看出dox-icg-er在肿瘤部位聚集的dox量要大于单独dox组。