本发明涉及桑黄组合物的配伍和提取制备方法以及抗氧化方面的应用,属于生物技术领域。
背景技术：
野生桑黄（phellinusigniarius）在长白山区有分布，桑黄是一种营养丰富的食药两用型真菌，无毒副作用，素有“森林黄金”之美称。桑黄味微苦，能利五脏、软坚、排毒；止血、活血；和胃止泻。现代药理学研究表明，桑黄具有抗炎，抗糖尿病，抗氧化，免疫增强，抗诱变，抗癌和抗肿瘤作用。目前，桑黄是国际上公认的生物治癌领域中有效率最高的一种食药用真菌，抗癌效果比灵芝和巴西蘑菇等要好(傅海庆,2005)也有文献报道，“多酚提取物可用于预防缺血性中风”(papaweesuabjakyong,2015);据报道，桑黄总黄酮具有明显的降血脂作用和抗衰老作用（李善姬，2015）；从桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物中得到环二肽c4，此化合物目前已报道具有抑制鳗弧菌繁殖的作用（cn103073550a）；桑黄菌粗提物，进行正相硅胶层析，采用氯仿与甲醇洗脱，然后是甲醇凝胶层析，经hplc检测后，进行高压反相制备，经hplc检测，适当合并洗脱液，减压干燥，即得环二肽c6，即六氢-7-羟基-3-（2-甲基丙基）吡咯并[1,2-ɑ〕吡嗪-1,4-二酮，此化合物目前已报道具有广谱抗菌作用（cn103145716a）。一种富集纯化桑黄中桑黄总黄酮的方法，利用间歇蒸馏-大孔吸附树脂耦合法富集纯化桑黄中桑黄总黄酮的方法（cn102078339a）；ー种提取桑黄多糖的方法，其工艺是桑黄经选料、清洗、切片、浸泡、超高压处理、水煮、过滤灭菌而得出桑黄多糖原液，切片时片厚为0.3-0.5mm,浸泡约有半小时，超高压处理为200-300mpa，保持10-15分钟，再经水煮，在100°c沸水中煮1-2小时，桑黄与水的比例为1:40，取出煮制液在经巴氏灭菌处理而得（cn101463093）；用高效逆流色谱制备桑黄多糖，采用超声萃取法从桑黄子实体中提取桑黄粗多糖，桑黄粗多糖的得率高，一般为2%，本法可达6％（cn200810041120.0）。
近来研究表明桑黄中的三萜类物质具有迅速提高免疫力的作用，表现在促进淋巴细胞增殖，提高巨噬细胞、nk细胞、t细胞的吞噬能力和杀伤力，并直接和间接毒杀肿瘤细胞，同时能够激活化疗药物难以杀死的休眠期肿瘤细胞，进行单独和联合毒杀（cn102628064a）。桑黄的活性成分，其中以多糖为主（cn103059155a）。
研究发现p.igniarius含有丰富的酚类和多糖，并且具有比p.linteus更高的sod样活性。p.igniarius比p.linteus更有可能开发抗氧化剂和免疫调节食品。食用菌的水分和粗纤维含量分别为〜90％和〜1％[nae-cherng，etal，2016]。由于p.igniarius和p.linteus都是木质化程度较高的硬蘑菇，两种蘑菇的含水量（15％）较少，纤维含量较高（6％至8％）比其他食用蘑菇含量高。p.igniarius和p.linteus子实体含有高含量的无氮可溶物。一般来说，食用菌中的无氮可溶物低于10％，而p.igniarius和p.linteus中的无氮可溶物含量>67％。这一观察结果表明，桑黄菇的碳水化合物组成中的营养成分明显不同于其他常用的蘑菇。总之，我们发现p.igniarius具有更高的酚类化合物，类黄酮和多糖的含量以及更高的sod样活性。这些结果表明，p.igniarius在食品中具有比p.linteus更高的抗氧化剂和免疫调节功能的发展潜力（nae-cherng，etal，2016）。
关于桑黄，目前已发现主要是多糖，其次是黄酮、萜类、甾醇等，还含有氨基酸、落叶松酸、藜芦碱、蘑菇酸等多种营养成分。桑黄菌中含有多种微量元素，有铁、锌、钙、镁等。这些元素都是人体必需或对人体有益的物质。有人认为桑黄主要以多糖为主，但桑黄成分复杂，作用广泛，实际上尚有很多活性成分并未能揭示出来，例如，过去一直认为粗纤维是不能被人体消化和吸收的。通常认为粗纤维对人体不具有营养作用，甚至吃多了还会影响人体对食物中营养素，尤其是对微量元素的吸收，对身体不利，一直未被重视。此后，人们发现，并认识到那些不能被人体消化吸收的“非营养”物质，却与人体健康密切相关，而且在预防人体某些疾病如冠心病、糖尿病、结肠癌和便秘等方面起着重要作用，与此同时，也认识到“粗纤维”一词概念已不适用，因而将其废弃改为膳食纤维。桑黄含有多量纤维，因此有必要对其进行科学加工提高其生物利用度，特别是整体开发利用，而不是仅仅利用其多糖或黄酮萜类等成分的制备。尤其是落叶松提取物的添加，更增强了桑黄的生物活性及临床应用价值。落叶松也是桑黄(p.laricid)的寄主，二者共生于长白山区，天作之合，注定了它们不可多得的效果。落叶松中含有的二氢槲皮素是最好的天然抗氧化剂之一。二氢槲皮素因具有抗肿瘤、抗氧化、抗辐射、抗病毒、抗心血管系统疾病、改善毛细血管微循环、改善脑部血液循环、抗血小板凝聚等作用，用于治疗脑梗及其后遗症、脑血栓、心脏冠状动脉等疾病,所以将其开发为食品添加剂、保健食品和药品等相关产品,具有很高的开发潜力。
抗性糊精是由淀粉加工而成的一种低热量葡聚糖，属于低分子水溶性膳食纤维。作为一种低热量可溶性食品原料，在食品工业中具有的广阔的发展前景。抗性糊精可以像砂糖或糖类一样简单的添加,又不会影响食物原有的风味,从而应用到制作食物纤维强化乳制品或补充食物纤维的乳饮料中.由于抗性糊精与脂肪有相似的口感,热量低,也可作为与乳制品风味匹配适当的低热量麦芽糊精来使用,抗性糊精的添加使得抗性糊精和乳酸菌、双歧杆菌等肠内有益菌的生物机能更加充分的被发挥出来,从而产生了极大的相乘效果益生元产品的特征是：“有益细菌”的增加和/或“有害细菌”的减少、肠道ph值的降低、短链脂肪酸的产生和细菌酶浓度的变化。研究表明，抗性糊精是通过结肠发酵表现出所有这些益生元作用的。抗性糊精具有优异的生理功能：抗性糊精有助于保持正常的、健康的血糖水平和胰岛素水平，延缓和抑制小肠对糖类的消化吸收，并改善末梢组织对胰岛素的感受性，降低对胰岛素的需求。抗性糊精也能改变消化道激素的分泌和肠道内消化酶活性，抑制糖类的消化与吸收，从而起到降低血糖的作用；
可达到降血脂，改善各种类型高血脂症患者的脂类代谢的作用。抗性糊精在小肠内不被吸收，可直接进入大肠，能促进肠道有益菌群的生长、繁殖，同时抑制肠道有害微生物的生长繁殖;抗性糊精在大肠内发酵产生短链脂肪酸，产酸量较同等膳食纤维多，这些短链脂肪酸能阻止癌细胞的生长与繁殖。抗性糊精的吸水膨胀能增加粪便体积，促进肠道蠕动，对于便秘、痔疮都有一定作用。
抗性糊精作为食品的膳食功能成分，可以添加到发酵乳或乳酸饮料中，不仅可提供膳食纤维，而且可使乳酸菌、双歧杆菌等肠内有益菌的生物机能充分的发挥，产生极大的相乘效果，可作为减肥食品和便秘人群保健食品。
阿拉伯胶是一种天然植物胶，取自一种名为acacia的树，系含羞草科，金合欢属，阿拉伯胶树a.senegal(l.)willd.和儿茶a.catechu(l.f.)willd.可提取阿拉伯胶由树的汁液凝结而成。它会在树皮上自然形成节结，被称为流胶现象。
阿拉伯胶是一种碳水化合物聚合体，可在大肠中被部分降解。它可以为人体补充纤维素，与淀粉和麦芽糊精相比，其能量值还不到一半。更具体的说，阿拉伯胶是阿拉伯半乳糖寡糖、多聚糖和蛋白糖的混合物。根据来源不同，多糖组分中的d－半乳糖（阿拉伯树胶）和l－树胶醛糖比例也不相同。与金合欢树相比，阿拉伯树胶含有更多4－o－甲基－d－葡萄糖醛酸，而l－鼠李糖和不可替代的d－葡萄糖醛酸的量较少。具有高度的可溶解性，平常的胶类在溶水的过程中仅能最多加进约5-8%的胶体即达饱和，而阿拉伯胶与水的混合比则可高达60%，在高含量时能有非常高的黏度表现。因其为水性胶，故不会溶解于油与酒精，但若酒精含量低于15%时，则可以溶解。在营养学上，阿拉伯胶基本不产生热量，是良好的水溶性膳食纤维，被用于保健品糖果及饮料。
本发明的特征在于：由于采用新鲜桑黄，省去烘干过程，保护了其中的一些生理活性物质如sod，以及一些维生素类物质，如维生素c；其次，桑黄经破壁，尤其是经过超高压处理，均质过程中通过剪切、磨擦、冲击、挤压等手段，对固体、液体等凝聚态物质施加机械能，诱导其结构及物理化学性质发生变化，并诱发化学反应，改变了桑黄中大分子化合物的多糖的结构，还有阿拉伯胶和抗性糊精的结构，并使桑黄中的小分子化物，例如，黄酮类、多酚类、萜类以及甾醇类等成分。落叶松提取物中的二氢槲皮素与桑黄中的多糖以及阿拉伯胶和抗性糊精在均质过程中通过剪切、磨擦、冲击、挤压等手段形成包埋，提高了这些小分子水溶性，尤其是提高它们的生物利用度，增强功效，由此减少用量，减少副作用。
本发明的特点：采用三年生新鲜桑黄子实体，洗净，制成小块，加水混合，经破壁，与落叶松提取物（含二氢槲皮素素90%以上），阿拉伯胶，抗性糊精混合，置于150-250兆帕的超高压均质机中处理，然后放入真空冷冻干燥机中，冷冻干燥，制成落叶松桑黄粉。
技术实现要素：
本发明提供了桑黄组合物的制备方法，其特征在于：所述桑黄组合物中的组分及各组分重量百分数为：鲜桑黄子实体85%，落叶松提取物（含二氢杨梅素90%以上）3%，阿拉伯胶5%，抗性糊精7%；
落叶松根木屑粉碎成直径0.5mm-10mm小颗粒，用环己烷静态浸泡10-24h，过滤，得滤液，残渣再用环己烷浸泡10h，同样操作，将2次滤液合并，减压回收溶剂，晾干，得落叶松提取物；将桑黄与落叶松提取物、阿拉伯胶和抗性糊精共同置于30-250兆帕的超高压均质机中处理，然后放入真空冷冻干燥机中，冷冻干燥，即得桑黄组合物。
本发明的积极效果在于：由于采用新鲜桑黄，省去高温烘干过程，保护了其中的一些生理活性物质如sod，以及一些维生素类物质，如维生素c；其次，桑黄经破壁，尤其是经过超高压均质处理，均质过程中通过剪切、磨擦、冲击、挤压等手段，对固体、液体等凝聚态物质施加机械能，诱导其结构及物理化学性质发生变化，并诱发化学反应，改变了桑黄中大分子化合物的多糖的结构，尤其是水溶性多糖分子,还有阿拉伯胶和抗性糊精的结构。落叶松提取物中的二氢槲皮素与桑黄中的多糖以及阿拉伯胶和抗性糊精在均质过程中通过剪切、磨擦、冲击、挤压等手段形成包埋，提高了这些小分子水溶性，尤其是提高它们的生物利用度，增强功效，由此减少用量，减少副作用。
本发明的积极效果在于：桑黄与落叶松提取物的配合，尤其是落叶松提取物中含有二氢槲皮素，明显增加桑黄组合物的抗氧化作用。
本发明可以以单一或组合物的形式通过口服给药方式适用于健康或病患者。
实验例1桑黄组合物抗氧化作用
实验方法
1.1样品溶液的制备
分别取实施例4、5、6和7桑黄落叶松组合物1g，以10倍量70%乙醇回流提取1小时，提取液离心过滤，浓缩一定体积，加乙醇和水使溶液乙醇浓度达到70%，定容至50ml容量瓶中，供试。
1.2桑黄组合物对dpph自由基清除作用
dpph自由基清除作用的实验是最常用的，因为它与抗氧化剂简单，直接，快速地反应。称取dpph0.0128g用无水乙醇将其定溶于50ml容量瓶中，然后取10ml溶液定溶于50ml容量瓶中，避光，最终浓度为1.3×10-4mol/l。
参考luo等的方法，并作适当修改，96孔板用来快速测定样品的吸光度值。分别吸取样品和阳性对照品待测液80μl，加入dpph·溶液80μl，37℃下黑暗静置30分钟之后，以无水乙醇调零，测定517nm波长处的吸光度(a样品)，每个样品平行测定3次；取样品待测液80μl与70%乙醇80μl混合液在517nm处的吸光度(a1)，再测定80μldpph·溶液与80μl70%乙醇在517nm波长处的吸光度(a0)。dpph·清除率按下面的公式计算。
dpph·清除率/%＝(1－
结果见实施例4-7。
实施例1
三年生新鲜桑黄子实体100g，洗净，制成小块，加水，置于破壁机中，在4°c条件下，破壁3分钟，得桑黄水混悬液液，用高压均质机处理，接着用超高压均质机，200兆帕处理，得桑黄水悬浮液，喷雾干燥，得桑黄干燥粉。
实施例2
落叶松根木屑粉碎成直径0.5mm-5mm颗粒，用环己烷静态浸泡14h，过滤，得滤液，残渣再用环己烷浸泡10h，同样操作，将2次滤液合并，减压回收溶剂，晾干，得落叶松提取物1（二氢槲皮素含量49%），加入热水，趁热除去水不溶性杂质，浓缩至一定体积，冷却，室温放置，过滤收取结晶，再溶于水，反复进行3次，即得落叶松提取物2（二氢槲皮素含量≥90%）。
实施例3
取实施例1的桑黄提取物干粉85g，再加入实施例2的落叶松提取物（二氢槲皮素含量≥90%）3g，阿拉伯胶5g，抗性糊精7g，加水1000ml，置于普通均质机中，混匀，制得桑黄组合物，其中二氢槲皮素在该混悬液中溶解度达到1.29g。
实施例4
取实施例1的桑黄提取物干粉85g，再加入实施例2的落叶松提取物（二氢槲皮素含量≥90%）3g，阿拉伯胶5g，抗性糊精7g，加水适量，置于普通均质机中，混匀，置于50兆帕的高压均质机中混匀，然后放入真空冷冻干燥机中，冷冻干燥，制成落叶松桑黄粉。取该粉10g加水100ml，其中二氢槲皮素溶解度达到3.38g/l，对dpph自由基清除作用结果：清除率为88.51%。
实施例5
取实施例1的桑黄提取物干粉85g，再加入实施例2的落叶松提取物（二氢槲皮素含量≥90%）3g，阿拉伯胶5g，抗性糊精7g，加水适量，置于普通均质机中，混匀，置于100兆帕的高压均质机中混匀，然后放入真空冷冻干燥机中，冷冻干燥，制成落叶松桑黄粉。取该粉10g加水100ml，其中二氢槲皮素溶解度达到4.10g/l，对dpph自由基清除作用结果，清除率为90.68%。
实施例6
取实施例1的桑黄提取物干粉85g，再加入实施例2的落叶松提取物（二氢槲皮素含量≥90%）3g，阿拉伯胶5g，抗性糊精7g，加水适量，置于普通均质机中，混匀，置于150兆帕的高压均质机中混匀，然后放入真空冷冻干燥机中，冷冻干燥，制成落叶松桑黄粉。取该粉10g加水100ml，其中二氢槲皮素溶解度达到5.64g/l，对dpph自由基清除作用结果，清除率为92.71%。
实施例7
取实施例1的桑黄提取物干粉85g，再加入实施例2的落叶松提取物（二氢槲皮素含量≥90%）3g，阿拉伯胶5g，抗性糊精7g，加水适量，置于普通均质机中，混匀，置于250兆帕的高压均质机中混匀，然后放入真空冷冻干燥机中，冷冻干燥，制成落叶松桑黄粉。取该粉10g加水100ml，其中二氢槲皮素溶解度达到5.11g/l，对dpph自由基清除作用结果清除率为91.25%。
实施例8
取未经处理过的二氢槲皮素提取物和经本发明专利权利要求5制备得到的富含二氢槲皮素的落叶松提取物进行水溶性试验，结果显示，溶液饱和后，未经处理的二氢槲皮素在水中生物溶解度为0.45g/l，经本发明专利处理后的产品，二氢槲皮素的最高溶解度为5.11g/l。