黄芩素在制备防治寨卡病毒感染的药物中的应用的制作方法

本发明涉及含有机有效成分的医药制品，具体涉及含黄酮类化合物的药物。

背景技术：

寨卡病毒(zikavirus,zikv)是一种蚊媒黄病毒，主要通过埃及伊蚊叮咬传播，也可通过母婴、血液和性传播，人群普遍易感。它会引发类似登革热的轻微症状，目前还无法通过药物或疫苗来防治。迄今，全世界已有30多个国家报道寨卡病毒感染并引发多个国家输入性病例。世界卫生组织(who)认为，新生儿小头畸形、格林-巴利综合征可能与寨卡病毒感染存在关联。胎儿经由孕妇传染，进而导致新生婴儿的小头畸形；成年人感染病毒一般表现为发热(罕见高热，通常是低热)、斑丘疹、关节痛、非化脓性的结膜炎，严重的可导致瘫痪和死亡。该病毒2007年首次在西太平洋密克罗尼亚群岛爆发流行，2013-2014在大洋洲的法属波利尼西亚爆发了更大规模的一次流行，2015年起于中南美洲快速扩散，2016年，世界卫生组织(who)召开紧急会议，宣布将寨卡病毒列为全球紧急公共卫生事件，并呼吁国际社会协调应对。当前全球有近30个研究机构正在进行寨卡病毒疫苗研发，但尚没有批准的人用疫苗，寻找一种有效治疗寨卡病毒病的药物迫在眉睫，研究寨卡病毒是病毒学当前的研究热点。

黄芩素，属黄酮类化合物，黄色结晶，熔点264℃-265℃。溶于甲醇、乙醇、丙酮、醋酸乙酯及热冰醋酸，微溶于氯仿，溶于稀氢氧化钠呈绿棕色，但不稳定，易氧化成绿色。

黄芩素的化学结构如下式(ⅰ)所示：

黄芩素富含于植物黄芩(scutellariabaicalensisgeorgi)根部，黄芩素是黄芩中含量最高的黄酮类化合物之一。由于黄芩素主要存在于黄芩，因此而得名。黄芩素具有降低脑血管阻力，改善脑血循环、增加脑血流量及抗血小板凝集的作用，临床用于脑血管病后瘫痪的治疗。但是，目前文献报道中还没有出现黄芩素具有抗寨卡病毒活性的报道。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供黄芩素的新用途，即在制药中的新应用。

上述在制药中的新应用为，黄芩素在制备防治寨卡病毒感染的药物中的应用。

上述应用中，所述的黄芩素可以采用常规的方法从天然植物提取，也可以由合成或其他方法制得。

上述应用中，所述的药物由黄芩素和医学上可接受的辅料组成，其中，黄芩素在药物中的质量百分含量为0.1％～95％。

上述应用中，所述的药物可以是临床上可接受的大容量注射液、注射剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂。

本发明采用病毒空斑滴度法测定黄芩素对寨卡病毒的抑制作用，观察黄芩素对vero细胞的毒性作用和对寨卡病毒的抑制作用，利用cck-8检测试剂测得受试药物的半数有毒浓度(cc50)为43.3μm，对半数寨卡病毒的最大效应浓度(ec50)为0.1μm，其选择指数si分别是433，说明黄芩素用于防治寨卡病毒感染具有低毒高效的优点。

以下通过动物实验来验证上述效果。

1.实验材料

1.1细胞株

非洲绿猴肾细胞(vero)，购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，本实验室保存。

1.2实验组及其对应的受试药物

受试样品：取购于宝鸡市辰光生物科技有限公司(lot：0151024)的黄芩素，用pbs制得浓度为5mm的储备液。

1.3病毒株

zikavrius(genbankaccessionku963796)

来源于广东省疾病预防控制中心，zv株在c6/36细胞扩增，上清液通过0.45μm微孔滤膜过滤后储存于-80℃。病毒滴度由空斑实验在vero细胞测定。

1.4试剂和仪器新生小牛血清及dmem培养基(gibco公司)；dmso(sigma公司)；胰蛋白酶(美国difco公司)。olympuspm-6倒置显微镜(日本olympus公司)。

2.方法

2.1黄芩素在vero细胞上毒性浓度的测定

将细胞瓶中成片生长的vero用edta-胰酶消化计数，以2×10⁴/100μl/孔接种细胞于96孔板中(白色平底)，37℃5％co2孵育过夜。将药物用细胞生长培养液(含10％血清)按终浓度100、50、25、10、5、1、0.1、0.01μm稀释。吸去培养基，每孔加入药物溶液10μl，设正常细胞对照，每孔加入90μl细胞生长培养液。然后向每孔加入体积分数为10％cck8细胞活性检测试剂(其中dmem与cck8试剂的比例为9：1)100μl，细胞培养板置37℃、体积分数为5％的co2温箱中继续孵育20min。在酶标仪上测定各孔吸光度值，检测波长为450nm。细胞存活率计算公式：

细胞存活率(％)＝(药物组-空白对照)/(正常细胞组-空白对照)×100％

计算50％毒性浓度为药物半数有毒浓度(cc50)

2.2体外抗病毒作用的测定

用无菌pbs配制成50mm药物母液。细胞毒性实验同1.3.1。将vero、hela、huh7、bhk-21细胞均匀地接种至96孔细胞培养板中，待细胞生长至4×10⁴个/孔时更换成无血清的dmem培养基，加入终浓度为25.0，17.5，10.0，5.0，1.0，0.1，0.01μmdmem培养基梯度稀释的待测药物，37℃细胞培养箱孵育1h。孵育后每孔加入感染复数(multiplicityofinfection)moi＝0.5的寨卡病毒，37℃细胞培养箱吸附1h。弃去病毒液，用pbs润洗一次，加入含药培养基，37℃细胞培养箱培养48h。收集细胞上清液测定病毒滴度。计算50％病毒抑制浓度为药物半数有效浓度(ec50)

选择指数si＝cc50/ec50

2.3病毒滴度的测定

将细胞瓶中成片生长的vero用edta-胰酶消化计数，以2×10⁵/500μl/孔接种细胞于24孔板中。37℃5％co2孵育过夜。用不含血清的培养基稀释病毒样本，设置两个稀释倍数，每个稀释倍数设置两个复孔，稀释倍数：10^-2-10^-7。吸去培养基，每孔加200μl病毒液，于37℃5％co2培养1h。除去接种物，每孔加500μl含2％血清的0.8％cmc，37℃5％co2培养5-9天。用3.7％多聚甲醛固定，0.5％结晶紫染色，计数空斑。pfu/ml＝空斑数×1000/200×稀释因子的倒数。

3.结果

3.1药物毒性结果见下表1。

表1黄芩素对vero细胞毒性

利用软件graphpadprism5.0绘图如图1所示。

由图1可见，黄芩素在vero细胞的药物毒性的cc50为＝43.4μm，为低细胞毒性药物。

3.2药物抗病毒作用的测定结果见下表2和图2。

表2黄芩素对寨卡病毒的抑制作用

黄芩素在vero细胞的抗病毒作用的经病毒滴度测定，计算得到的ec50为0.1μm，表明黄芩素具抗寨卡病毒的选择指数si＝433，有较好的抗病毒作用和安全性。

附图说明

图1为染毒vero细胞细胞存活率与黄芩素浓度关系曲线。

图2为黄芩素对寨卡病毒抑制作用的曲线图。

具体实施方式

例1：(注射剂)

取黄芩素1000mg，加枸橼酸1000mg，枸橼酸钠500mg，氯化钠1800mg，加1000ml的注射用水，搅拌使溶解，除菌滤过，灌封，经100℃15分钟流通蒸汽灭菌，制成每支2mg/2ml的注射液供注射使用。

例2：(胶囊剂)

取黄芩素5000mg，采用辊压法进行干法制粒，填充入3#空心胶囊，制成规格为100mg/粒的胶囊剂供口服使用。

例3：(片剂)

取黄芩素5000mg与4000mg淀粉、200mg交联pvp、300mg羧甲基淀粉钠混合均匀，用5％pvp的75％乙醇溶液作为粘合剂，制软材，以18目筛制粒，60℃干燥后1h，20目整粒后加入适量滑石粉，混匀，压片，制成规格为100mg/片的片剂供口服使用

例4：(颗粒剂)

取黄芩素5000mg与4000mg淀粉、200mg交联pvp、300mg羧甲基淀粉钠混合均匀，用5％pvp的75％乙醇溶液作为粘合剂，制软材，以18目筛制粒，60℃干燥后1h，制成规格为100mg/片的颗粒供口服使用。

例5：(大容量注射液)

取黄芩素100mg，氯化钠900mg，加1000ml的注射用水，搅拌使溶解，除菌滤过，灌封，经100℃15分钟流通蒸汽灭菌，制成每支0.1mg/1ml的注射液供注射使用。